Summary
Sağlıklı laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, kene biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine çalışmalar için gereklidir. Burada, fare için düşük maliyetli ve stresli olgunlaşmamış kene beslemesi için basit bir protokolü gösteriyoruz.
Abstract
Lyme hastalığının vektörü Ixodes scapularis , doğu ve orta batı Amerika Birleşik Devletleri'ndeki en önemli hastalık vektörlerinden biridir. Bu tür, her gelişim evresi için bir omurgalı konakçıdan bir kan yemek isteyen üç ana kene ve yetişkin dişiler üreme için kan dolumu gerektirir. Larval keneler beslenmek için ev sahibine 3 - 5 gün boyunca bağlarlar ve evin tamamen tıkıldıktan sonra bırakırlar. Birkaç farklı konağa bağımlılık ve engorgement için uzun ekleme zamanı, laboratuar ortamında kenelerin yetiştirilmesini zorlaştırır. Bununla birlikte, kene biyolojisi ve kene-patojen etkileşimlerini anlamak için sağlıklı, laboratuar bakımlı kenelerin üretimi önemlidir. Burada, farelerde olgunlaşmamış kene beslemeye yönelik basit ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz. Farelerde azaltılmış stres için varolan protokolleri değiştirdik ve kenelerin temas etmesini önlemek için örgü dipleri olmayan tek kullanımlık kafesleri kullanarak kene besleme başarısı ve hayatta kalma oranını arttırdık.İdrar ve dışkılarla kirlenmiş su.
Introduction
Keneler omurgalıların zorunlu hematophagous ektoparazitlerdir ve dünya çapında dağıtılmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, kenelerin en az 11 türün halk sağlığı önemi 1'in patojenlerin vektörler bulunmaktadır. Ixodes scapularis, Lyme hastalığı (Borrelia burgdorferi) ateş (B. miyamotoi) nükseden, insan granülosit anaplazmoz (Anaplasma phagocytophilum) ve babeziyoz neden olan maddeler olarak çeşitli patojenlerin iletiminden sorumludur (Babesia spp.). Laboratuvarda çalışmalar için vahşi bolca bu arachnids toplama bir hastalık vektörü olarak I. scapularis önemine rağmen her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, sağlıklı laboratuvarda yetiştirilmiş kene üretimi kene biyolojisi üzerinde çalışmalar çok önemlidir ve etkileşimleri-patojen işaretleyin.
I. scapularis dahil tüm sert keneler (aile Ixodidae), yaşam döngüsü, yumurta ve üç activ oluşurE aşamaları: larva, nimf ve yetişkin. Her aktif aşamada bir omurgalı konakçı beslenir. Bağlar ve besleme birkaç gün içinde keneler ve onların konak arasında gerçekleşen karmaşık etkileşimler yapay besleyiciler kullanarak çoğaltmak için neredeyse imkansızdır ve 2 , 3 , 4 toplu yetiştirme için yeterli sayıdaki beslemiş kenelerin sağlanması pek olası değildir. Dolayısıyla, canlı fareler ve tavşanlar en sık olgunlaşmamış (larvalar ve nimfler) yetiştirme ana bilgisayarları ve tavukların olgun aşamaları (yetişkinler) olarak kullanılır. Her gelişim evresi boyunca kan beslemeye yönelik çoklu konut gereksinimi, kenelerin yetiştirilmesini zorlaştırmaktadır ve zaman ve maliyet yoğun 5 , 6 , 7 . Çoğu kene destekleme protokolleri, fareleri asma tel ızgara taban kafesindeki 7 , 8 ya da silindirik bir kabin içinde tutmayı gerektirirHayvan öyle boyutlara sahip ki, hayvan serbestçe hareket edemez ve kendini damatlayamaz 6 , 9 , 10 .
Bu silindirik kafesler daha sonra bir tel örgü ile bir ayakkabı kutusu kafesine aktarılır. Sızdırılmış, ayrılmış keneler altındaki sudan toplanır. Bununla birlikte, bu yöntem, beslenen kenelerin, idrar ve dışkı ile kirlenmiş mantar büyümesini ve kene ölüm oranını artırabilecek suya maruz kalmasına neden olur. Buna ek olarak, kene su çukurundan kaçma ve aynı zamanda farelere stres yaratma olasılığını artırır. Bu sorunları gidermek için, burada plastik ayakkabı kutusu tipi tek kullanımlık kafeslerdeki farelerde larval kene beslemeyi göstermektedir. Bu yöntem, farelerin normal davranışına izin verir, tıkanmış tıkanıklığı artırır ve kontaminasyondan ötürü kene ölümünü azaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
aşağıda özetlenen protokolü (Sayı-00682) Nevada Reno Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Nevada, Reno hayvan araştırma etik komitesi Üniversitesi kurallarına uygun olduğundan. Kısaca, fareler izofluran ile anestezi uygulandı ve burunluk 20 dakika süre ile devamlı izofluran düzeylerini muhafaza için kullanılmıştır. Bir veteriner merhem anestezi altında gözlerin kurumasını önlemek için kullanılmıştır. Ayak tutam anestezi seviyesini tespit etmek için kullanıldı ve nefes alma hızı prosedürü boyunca ölçüldü. Fareler ayrı kafeslerde tutulur ve bilinç kazanmış kadar takip edildi. Fareler kene beslemek için sadece bir kez kullanıldı ve post kene kurtarma ötenazi uygulandı. Ötenazi Hayvan Tıp personeli personelin Laboratuvarı tarafından gerçekleştirilmiştir. CO2 ve servikal dislokasyon hayvanlar ötenazi kullanılmıştır.
NOT: keneler üzerinde çalışmak tam bir kişisel koruyucu eq kullanımını gerektiriruipment. Olgunlaşmamış keneleri saymak için, beyaz laboratuar önlüğü giyin, lastik bantlarla kaplı laboratuar kaplamasının manşonu açıklığını örten uzun nitril eldivenler ve kapalı ayakkabı kullanın. Fareleri kenelerle enfeste öldürmek için saç ağını, tek kullanımlık tulumları, kolları üzerine uzun kollu eldivenleri ve ayaklıkları kullanın. Yanlış kene tespiti için beyaz veya açık renkli tulum kullanın. Eldiven ve kılıfları periyodik olarak kontrol edin.
1. Hayvan Barınağına Hazırlanma Odası
- Kenelerle bulaşmış fareleri eve ayırmak için ayrı bir oda belirleyin. Kazara kene kaçışını önlemek için, yapışkan bir hasır veya iki taraflı halı bantını kapının dışında ve içinde yerleştirin.
2. Fare Infestation için Keneler Sayma
- Çift taraflı bantları 7 "x 5" x 14 "plastik kapların üst kenarlarına koyun ve yaklaşık 2 cm su ile doldurun.
- Kabın ortasına başka bir küçük kutu veya Petri kabı koyun ve 1 cm su ile doldurun,# 34; Bu kapsayıcı etrafına hendek"
- Petri kabı içinde larva veya perileri içeren flakon saklayın.
- şişeden larvaları ya da nymphs çıkarın ve mikroskop altında saymak için iyi bir boya fırçası kullanın. 50 larva veya ayrı ayrı sintilasyon şişelerine 25 nymphs sayın. naylon mesh veya organze kumaş ekran ve lastik bantlar ile yakın hemen şişeleri örtün.
Olgunlaşmamış Keneler 3. İstila Fareler
- beyaz veya açık renkli çalışma tezgahı kullanın ve çalışma alanının çevresinde çift taraflı bant yapıştırın.
- izofluran ile fare anestezisi. Ayak tutam tarafından anestezi seviyesini kontrol edin. Bir kez anestezi, kağıt havlu ile örtülü bir ısıtma pedi fare aktarmak ve sürekli izofluran temini için bir burun konisi eklemek.
- kuruluğu önlemek için vazelin esaslı göz merhemi uygulanır. Min normal başına 230 nefes br halinde izofluran seviyesini azaltmak -. Izofluran seviyesi (80 ayarlamak için fare solunum desen NotHayvanı öldürmekten kaçınmak için eating oranı dakikada 80 nefesin altındadır).
- Bir şişe 50 larva veya 25 nimf alın ve kulakların arasında kürkün altına kene takozları bir boya fırçası ile yerleştirin ( Şekil 1 ). Kenların iliştirilmesi için yeterli zaman tanımak için 20 dakika boyunca fare ile anestezi altında tutun.
- Fareyi, statik kapaklar ve beyaz yatak takımı ile standart, plastik bir ayakkabı kutusu tipi tek kullanımlık fare kafesine taşıyın. Normal fare bakımı uyarınca oyuncaklar , su ve yiyecekleri ad libitum olarak verin.
- Fare kafesini, üst kenarlar etrafında çift taraflı yapışkan bant ile kaplı daha büyük bir fare veya gerbil kafesi içinde saklayın. Dış kafese 3 cm su doldurun ( Şekil 2 ).
4. Farelerden Kene Toplama
- Olgunlaşmamış keneler, beslenmenin 3. ve 6. günleri arasında ayrılır. Kafesleri ve su hendeklerini 3. günden sonra her gün tıkanmış keneler için kontrol edin.
- 4. ve 6. günler arasında kafesden müstakil keneler toplayın. Bir ağrı kullanınT fırça veya yumuşak forseps ile tıkanmış kene tutun ve naylon örgü kumaş lastik bantlarla sabitlenmiş temiz sintilasyon şişeleri içinde saklayın.
- Kalan kenarlar için 7. günde anestezi uygulayın ve fare kontrol edin.
- 7. günde engellenmiş keneler için yatak takımları, yiyecek yemi ve su şişesini kontrol edin. Yukarıda açıklandığı gibi prosedürü takiben fareleri euthanize edin. Tek kullanımlık kafesleri, yatak takımları, su şişesi ve yiyecek yalakçısı otoklav ederek, kaçmayan kaynaksız kenelerden kaçınınız.
5. Fed Kenarlarının Depolanması
- % 90 nemde tıkanmış kene koruyun, 20 ° C ve 12:12 ışık: koyu renk döngüsü, nem ve sıcaklık kontrolü altındaki inkübatör oluşuncaya kadar. Bu işlemin yaklaşık 12 ila 18 hafta sürebilir.
- Yüksek nem, kene sağkalımını arttırırken, kenelerin mantar büyümesine eğilimli olmasını sağlar. Kalıp için haftada en az bir kere mikroskop altında beslenen keneleri kontrol edin. Saptanırsa, hayatta kalanları% 5 etanol içinde 5Dak., Suda durulayın, kuru bir filtre kağıdına aktarın ve yeni, temiz tüplere aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geliştirilmiş besleme etkinliği ve fare konak üzerinde stresin azaltılması için mevcut kenot yetiştirme protokolleri 6 , 10'u değiştirdik. Sonuçlar, standart ayakkabı kutusu tarzı fare kafeslerinin, kenelerin yetiştirilmesi için çok uygun olduğunu ortaya koymaktadır. Beyaz yatak, beslenen kenelerin kolay toplanması için iyi bir kontrast sağladı. Çoğu keneler, beslendikten sonra kapların duvarlarına tırmandı ve toplanması kolaydı. Buna ek olarak, tek kullanımlık plastik kutuların sıkıca monte edilmiş kapağı (UNR'de bulunan fareler için rutin olarak kullanılır) kutudan kaçmayı önledi. Buna ek olarak, kene istila için fareler tıraş vermedi ( Şekil 1 ). Yayınlanmış protokollerdeki bu değişiklikler önemli kene takviyesi, engorgement ve hayatta kalma ile sonuçlandı.
Bu protokol, alread'in dışında herhangi bir özel fare kafesleri gerektirmediğinden maliyet etkintir.Y kullanımda. Ayrıca, her gün tıkanmış kene toplamamız gerekmediğinden, daha az emek harcıyor. Enfestasyondan sonraki 4. ve 6. günler arasında keneler toplandı. Çoğu kene 4. günde ayrılmış ve geri kalan bazıları 5. günde müstakil olmuştur. 7. günde tüm farelerde keneler bulunmuyordu. Ortalama% 67 (dağılım 52 - 92%) engebeli larval keneleri kurtarmaya başladık ( Tablo 1 ). Bütün fareler sağlıklıydı ve herhangi bir rahatsızlık belirtisi göstermedi.
Şekil 1: Farelerde Ixodes scapularis Larvaları besleme. Fareler, 50 larval kenardan bireysel olarak istila edildi. Sıkışan keneler, 4-6 günler arasında fare düşürüldü. Kafesler, gün içinde kalan keneler için kontrol edildi ve bundan sonra atıldı. C: Farelere çiçeksiz larval kenelerle enfeste ediliyor. B: Farenin kulağına bağlanan bir larval kene. C: BirSıçan yumurtasından 3 gün sonra bir fare kulağına tutturulmuş enginar larval kene. D: Tamamlanmamış kene larvaları ile beslenmemiştir.
Şekil 2: Fare Kafesi, Tick Infestation için ayarlayın. İki atılabilir fare kafesi bir gerce kafes içinde tutuldu. Yaklaşık 3 cm. Hendek yapmak için gerbil kafesine su ilave edildi. Kene kaçışını önlemek için gerce kafesin üst kenarlarının etrafına çift taraflı yapışkan halıcı bant takıldı.
| Hayvan (fare) | Kurtarılan larval kenelerin toplam sayısı | Kurtarılan larva keneler yüzdesi |
| 1 | 34 | % 68 |
| 2 | 32 | % 64 |
| 3 | 38 | % 76 |
| 4 | 28 | % 56 |
| 5 | 39 | % 78 |
| 6 | 26 | % 52 |
| 7 | 46 | % 92 |
| 8 | 29 | % 58 |
| 9 | 29 | % 58 |
| 10 | 33 | % 66 |
| ORTALAMA | % 66.8 |
Tablo 1: Anestezi altındaki fare konakçıları üzerinde laboratuar istilasından sonra toparlanan Ixodes scapularis larva sayısı . Her fareye 50 larvanın enfekte edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolün Kritik Adımları
Kazara kaçmayı önlemek için kenevir yetiştirirken birkaç güvenlik seviyesine sahip olmak önemlidir. Yapışkan bant ve su hendeği kullanımı, güvenliği sağlamak için kritik öneme sahiptir. Vücut ısısını sabit tutmak için anestezi uygulanmış fareyi ısıtma pedinde tutmak önemlidir. Fareyi tıraş etmenin kene ataşmanı için herhangi bir ek fayda sağlamadığını da bulduk. Bireysel bir fare, belirlenen bir "kene odası" nda bir hafta boyunca aynı kafeste tutulabilir ve bu da kenelerin kenarlarla personel arasında daha fazla temasını engeller.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Yüksek kaliteli, laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, tik biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalar için gereklidir. Eskiden kullanılan besleme protokolleri askıdaki tel zemin 8'i veya silikon kafesleri fareleri hareketsiz tutmak için kullandı 6 , 1Hayvana ekstra maliyet hem de strese maruz 0. Buna ek olarak, süspanse tel kafes tıkalı keneler idrar ve böylece kalıp oluşumu riskini artan fare dışkı ile kirlenmiş su içerisine tel üzerinden düşmesini sağlar.
Tekniğin Sınırlamalar
verilerden de anlaşılabileceği gibi, başarılı kenelerin (% 92 kadar), ortalama% 65 oranında geri kazanılmıştır. Zaman zaman fare kafes dışında su hendekte kenelerin bulunduğu ancak hiçbiri kurtuldu. ikinci kabın dış duvarlarında yapışkan bant kaçmasını keneler engelledi.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Açısından Tekniği Önemi
Ayakkabı kutusu stili atılabilir fareler kafesleri kullanarak Bizim protokol hareket serbest yelpazesi izin ve fareler kene beslenmesini izin verecek ölçülü olması gerekmez göstermektedir. En beslenen keneler kolayca görülebilir ve şeffaf bir kafes duvar toplanmış ve geri kalan keneler kolaylıkla olan edildiBeslenme döngüsünün sonunda yataklar arasında tespit edildi. Bu protokol, herhangi bir özel fare kafes gerektirmez, bu nedenle, maliyet etkin olur.
Edebiyat, kenelerin% 50'sinden fazlasının fare ile ilişkili olduğunu ve tüm bağlı kenelerin tamamlanmadığını önermektedir. Ortalama olarak, ~% 60 engajged larval keneler toplandı. Hiçbir kaçan çiçeksiz veya beslenmiş kenarı bulamadık. Bazen, su hendeklerinde bir veya iki adet engebeli larval kene bulunurdu, ancak yapışkan bantta hiçbiri yoktu. Bulgularımız, tüm kenelerin ev sahibine bağlanmadığını ve beslenmeden ölebileceğini göstermektedir. Güvensiz, ölü keneler çöp bulmak zordu. Bazen beyaz yataklarda kan lekeleri tespit ettik; bu da, fare düşürdükten sonra veya damlamadan sonra tıkanmış kene öldürdüğünü göstermektedir. Verilerimiz ve günlük kafes gözlemimiz, tıkanmış kenelerin ya kafes duvarlarında ve kafesin üstünde hareket ettiklerini ya da farenin ulaştığı yerden uzakta yatağın altına gizlenmesini öneriyor. Dolayısıyla, kapalı kafesinK işaretinin hayatta kalmasına olumsuz etkisi.
Bu Tekniği Ustaladıktan Sonra Gelecekteki Uygulamalar veya Talimatlar
Protokolümüz, hayvanları tutan personelin ekstra maliyet veya emniyetini azaltmaksızın kenelerin toplu yetiştirilmesi için basitleştirilmiş bir alternatif sunmaktadır. Gelecekteki deneylerde yetişkin I. scapularis'in beslenme yöntemlerinin geliştirilmesi üzerinde durulacak .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
