Summary
स्वास्थ्य संबंधी प्रयोगशाला-पौधों की टिक टिक का उत्पादन, टिक जीव विज्ञान पर अध्ययन के लिए आवश्यक है, और टिक-रोगजनन क्रियाएँ यहां हम अपरिपक्व टिक फीडिंग के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं जो कि चूहों के लिए लागत प्रभावी और कम तनावपूर्ण है।
Abstract
Ixodes scapularis , लाइम रोग के वेक्टर, पूर्वी और मिडवेस्टर्न संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे महत्वपूर्ण बीमारी वैक्टर में से एक है। यह प्रजाति एक तीन मेजबान टिक है, जिसे प्रत्येक विकास चरण के लिए एक कशेरुक मेजबान से रक्त भोजन की आवश्यकता होती है, और वयस्क महिलाओं को प्रजनन के लिए एक रक्त भोजन की आवश्यकता होती है। लार्वाल टॉल्स अपने होस्ट को 3 से 5 दिनों के लिए होस्ट करते हैं, जब पूरी तरह से निगेटिव होने पर मेजबान को खिलाने और छोड़ना पड़ता है। कई अलग-अलग मेजबानों पर निर्भरता और प्रयोग के लिए लंबे समय से लगाव के समय प्रयोगशाला सेटिंग में टिक टिकने की जटिलता है। हालांकि, टिक जीव विज्ञान और टिक-रोगजन्य क्रियाकलापों को समझने के लिए, स्वस्थ, प्रयोगशाला-पौधों का उत्पादन करना आवश्यक है। यहां, हम चूहों पर अपरिवर्तनीय टिक फीडिंग के लिए एक सरल, लागत प्रभावी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं। हमने चूहों पर तनाव कम करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित किया है और टिक्स के संपर्क से बचने के लिए जाल के बिना डिस्पोजेबल पिंजरों का उपयोग करके टिक फीडिंग सफलता और अस्तित्व में वृद्धि की है।चूहों मूत्र और मल के साथ दूषित पानी
Introduction
टिट्स हे वर्टिब्रेट्स के हेमाथोफेग्स एक्टोपारासाइट्स हैं और उन्हें दुनियाभर में वितरित किया जाता है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, कम से कम 11 प्रजातियां टिक्ल्स सार्वजनिक स्वास्थ्य महत्व के रोगजनकों के वैक्टर हैं। Ixodes scapularis कई रोगज़नक़ों के संचरण के लिए जिम्मेदार है जैसे लाइम रोग ( बोरेरिया बर्गडोरफेरी ) के लौकिक ज्वर ( बी। मिआमोतोई), मानव ग्रैन्यूलोसिटिक एनाप्लाज्मोसिस ( एनाप्लाज्मा फॅगोसाइटोथिल्यूम ), और बॉयोबायोसिस (बाबेसीया एसपीपी)। आई के महत्व के बावजूद एक रोग वेक्टर के रूप में खूनी, प्रयोगशाला में पढ़ाई के लिए जंगली से बहुतायत में इन एराचेंड्स को इकट्ठा करना हमेशा संभव नहीं होता है। इसलिए, टिक प्रयोगशाला की पढ़ाई के लिए टिक टिकने की आवश्यकता है, टिक जीव विज्ञान पर अध्ययन, और टिक-रोगजनन बातचीत।
सभी कठोर ticks (परिवार Ixodidae) के जीवन चक्र, जिसमें आई scapularis शामिल हैं, अंडा और तीन सक्रिय होते हैंई चरण: लार्वा, अप्सरा, और वयस्क। प्रत्येक सक्रिय चरण एक कशेरुका मेजबान पर फ़ीड। कई दिनों के लगाव और भोजन के दौरान टिक्क्स और उनके मेजबानों के बीच होने वाली जटिल बातचीत कृत्रिम भक्षणों का उपयोग करने के लिए दोहराना लगभग असंभव होती हैं, और बड़े पैमाने पर पालन करने वाले 2 , 3 , 4 के लिए पर्याप्त मात्रा में टेंक प्रदान करने की संभावना नहीं है। इसलिए, जीवित चूहों और खरगोशों को सबसे अधिक बार अपरिपक्व (लार्वा और निम्फ्स) पालन करने के लिए मेजबान, और टिक्कों के परिपक्व चरणों (वयस्क) क्रमशः उपयोग किया जाता है। प्रत्येक विकासात्मक चरण के दौरान रक्त के भोजन के लिए कई मेजबानों की आवश्यकता टिक टिकती है, और यह समय और लागत की गहन 5 , 6 , 7 है । अधिकांश टिक पालन करने वाले प्रोटोकॉल को एक निलंबित तार ग्रिड मंजिल पिंजरे 7 , 8 या एक बेलनाकार सी में चूहे रखने की आवश्यकता होती हैइस तरह के आयाम है कि पशु स्वतंत्र रूप से ले जाया जा सकता है और खुद को दूल्हे 6, 9, 10 में जीई।
इन बेलनाकार पिंजरों बाद में एक तार ग्रिड के साथ एक shoebox पिंजरे के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। लटके हुए, अलग टिक तो पानी के नीचे से एकत्र कर रहे हैं। हालांकि, खिलाया उजागर में इस विधि परिणाम मूत्र तथा मल कि कवक विकास बढ़ाने के लिए और मृत्यु दर 9 टिकटिक कर सकते हैं के साथ दूषित पानी के लिए टिक्स। इसके अलावा, यह पानी गर्त से टिक भागने, और साथ ही चूहों को तनाव पैदा करने की संभावना बढ़ जाती है। इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, हम यहाँ प्लास्टिक shoebox प्रकार डिस्पोजेबल पिंजरों के भीतर चूहों पर लार्वा टिक खिला का प्रदर्शन। इस विधि चूहों, बढ़ जाती है टिक वसूली से लटके हुए की सामान्य व्यवहार की अनुमति देता है, और संदूषण के कारण टिक मृत्यु दर कम हो जाती है।
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Protocol
प्रोटोकॉल (संख्या-00682) नीचे दिये संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) नेवादा रेनो के विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित और नेवादा, रेनो के पशु अनुसंधान आचार समिति के विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों का पालन कर रहा है। संक्षेप में, चूहों isoflurane के साथ संज्ञाहरण कर रहे थे और एक नाक शंकु 20 मिनट के लिए निरंतर isoflurane स्तर को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक पशु चिकित्सक मरहम संज्ञाहरण के तहत आँखों के सुखाने को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पैर की अंगुली चुटकी संज्ञाहरण स्तर पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और साँस लेने की दर प्रक्रिया के दौरान मापा गया था। चूहे व्यक्ति पिंजरों में रखा है और निगरानी की जब तक होश आ गया था रहे थे। चूहे टिक खिला के लिए केवल एक बार इस्तेमाल किया गया और बाद टिक वसूली euthanized थे। इच्छामृत्यु पशु चिकित्सा स्टाफ कर्मियों की प्रयोगशाला द्वारा किया गया। सीओ 2 और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था जानवरों euthanizing के लिए इस्तेमाल किया गया।
नोट: टिक पर कार्य पूरा व्यक्तिगत सुरक्षा eq के उपयोग की आवश्यकताuipment। अपरिपक्व ticks की गिनती के लिए, सफेद लैब कोट पहनें, रबर बैंड के साथ आबद्ध प्रयोगशाला कोट की आस्तीन खोलने और बंद-पैर के अंगूठे के जूते को कवर करने के लिए लंबी नाइट्री दस्ताने। टिक्स के साथ चूहों को पीड़ित करने के लिए, बालों का जाल, डिस्पोजेबल आवरण, आस्तीन के ऊपर लंबे बाजू वाले दस्ताने और पैरों के कवर का उपयोग करें। विषम ticks का पता लगाने के लिए सफेद या हल्के रंग का कवर का उपयोग करें टिक्सेस के लिए समय-समय पर दस्ताने और आस्तीन की जांच करें।
1. पशु आवास के लिए कमरा तैयार करना
- घर के चूहों को टिक्सेस से पीड़ित एक अलग कमरा निर्दिष्ट करें। आकस्मिक टिक से बचने के लिए दरवाजे के बाहर और अंदर एक चिपचिपा चटाई या दो तरफा कालीन टेप रखें।
2. माउस इन्फेक्शन के लिए गिनती की गणना
- 7 "x 5" x 14 "प्लास्टिक के कंटेनर के शीर्ष किनारों के चारों ओर दो तरफा टेप रखें और लगभग 2 सेमी तक पानी भरें।
- कंटेनर के केंद्र में एक और छोटा बॉक्स या पेट्री डिश रखें और पानी से 1 सेमी तक पानी भरें,इस कंटेनर के आसपास # 34;
- पेटी डिश के अंदर लार्वा या नक्सीफ युक्त शीस्ट को स्टोर करें।
- सूक्ष्मदर्शी के नीचे शीशे से लार्वा या नक्सीफ को निकालने के लिए एक ठीक पेंट ब्रश का उपयोग करें और सूक्ष्मदर्शी के नीचे गिनती करें। 50 लार्वा या 25 निम्फों को अलग-अलग जगमगाती शीशियों में गिना। शीशियों को तुरंत नायलॉन जाल या ऑर्गेन्डी क्लॉथ स्क्रीन के साथ कवर करें और रबर बैंड के करीब।
3. अपरिवर्तित टिक्सेस के साथ चूहे को मारना
- कार्य क्षेत्र की परिधि के चारों ओर एक सफेद या हल्के रंग का कार्य बेंच का प्रयोग करें और डबल-साइड टेप को छूएं।
- आईसोफ्लुरेन के साथ माउस को anesthetize करें पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण स्तर की जांच करें एक बार संवेदनाहट करने के बाद, माउस को तौलिये के साथ कवर किए गए हीटिंग पैड में स्थानांतरित करें और निरंतर आईसोफ्लुराइन आपूर्ति के लिए नाक शंकु से जुड़ें।
- सुखाने से बचने के लिए पेट्रोलियम जेली-आधारित नेत्र मरहम लागू करें। आईसोफ्लुरेन के स्तर को समायोजित करने के लिए माउस की सांस लेने के पैटर्न को नोट करें (प्रति मिनट 80-230 साँस सामान्य है।पशु को मारने से बचने के लिए प्रति मिनट 80 साँस से कम एथिंग दर)
- पेंट ब्रश ( चित्रा 1 ) के साथ कान के बीच के सिर पर फर के नीचे 50 लार्वा या 25 निम्फ्स के एक शीशी लें और फट के नीचे जगह लें। संलग्न करने के लिए टिक्स के लिए पर्याप्त समय देने के लिए प्लेसमेंट के बाद 20 मिनट के लिए माउस को संज्ञाहरण के तहत रखें।
- माउस को एक मानक, प्लास्टिक जूता बॉक्स-प्रकार डिस्पोजेबल माउस पिंजरे को स्थिर लेड्स और सफेद बिस्तर के साथ ले जाएं। सामान्य माउस केयर के अनुसार खिलौने, पानी और भोजन की सुविधा प्रदान करें।
- माउस के पिंजरे को एक बड़े चूहे या गियरबिल पिंजरे के अंदर दोहराएं चिपचिपा टेप के चारों ओर किनारों के चारों ओर रखिए। 3 सेमी पानी ( चित्रा 2 ) के साथ बाहरी पिंजरे भरें।
4. चूहे से टिकी इकट्ठा
- अपरिपक्व गड़बड़ी 3 से 6 दिनों के भोजन के बीच अलग हो जाती है। पिंजरों और पानी की खपत को हर दिन 3 दिन बाद की जांच के लिए दबाएं।
- पिंजरे से 4 और 6 दिनों के बीच अलग-अलग टिक्स ले लीजिए। दर्द का प्रयोग करेंरस्सी के बैंड के साथ सुरक्षित नायलॉन जाल क्लॉप्ड के साथ छिपे हुए साफ चिलचिवाती शीशों में अपरिवर्तित टीकों को चुनने के लिए ब्रश या नरम संदंश।
- Anesthetize और किसी भी शेष संलग्न टिक्स के लिए 7 दिन पर माउस की जाँच करें।
- दिन पर बिस्तरों, भोजन की कुंडी, और पानी की बोतल की जांच करें 7. ऊपर बताए अनुसार प्रक्रिया के बाद चूहों का नामकरण करें। डिस्पोजेबल पिंजरों, बिस्तर, पानी की बोतल, और भोजन की कुर्सी आटोक्लेव से बचने के लिए किसी भी बचे हुए टिक्सेस से बचने के लिए।
5. फेड टिक्सेस का भंडारण
- 9 0% आर्द्रता पर 20 गुदगुदी निक्षेपणों को बनाए रखें डिग्री सेल्सियस, और 12:12 प्रकाश: नमी और तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में अंधेरे चक्र जब तक molting होता है। इसमें लगभग 12 से 18 सप्ताह लग सकते हैं।
- जबकि उच्च आर्द्रता टिक टिकने का बढ़ावा देता है, लेकिन यह भी फंगल अतिवृष्टि के लिए प्रवण होने वाली चीजों को बनाता है। हफ्ते में कम से कम एक बार ढालना के लिए सूक्ष्मदर्शी के तहत टेंक की जांच करें। यदि पता चला है, तो 5% के लिए 70% इथेनॉल में बचे लोगों को धो लेंमि।, पानी में कुल्ला सुखाने के लिए एक फिल्टर पेपर पर स्थानांतरित करने, और नए, स्वच्छ शीशियों को स्थानांतरित।
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Representative Results
हमने वर्तमान टिक टिकने वाले प्रोटोकॉल 6 , 10 में बेहतर खिला क्षमता और माउस होस्ट पर तनाव को कम करने के लिए संशोधित किया है। परिणाम दर्शाते हैं कि मानक जूता शैली शैली माउस पिंजरों टिक पालन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। सफेद बिस्तरों ने खिलाड़ियों की आसान संग्रह के लिए एक अच्छा विपरीत प्रदान किया। अधिकांश टिकियां खाने के बाद कंटेनर की दीवारों पर चढ़ गईं और इकट्ठा करने में आसान थीं। इसके अलावा, डिस्पोजेबल प्लास्टिक के बक्से के तंग फिट ढक्कन (नियमित रूप से यूएनआर में चूहों के आवास के लिए इस्तेमाल किया जाता है) ने बॉक्स से टिकटिक से बचने को रोका। इसके अतिरिक्त, हम टीका के शिकार ( चित्रा 1 ) के लिए चूहों को नहीं दागे। प्रकाशित प्रोटोकॉल में इन परिवर्तनों के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण टिकी लगाव, उत्पीड़न, और अस्तित्व में हुई।
यह प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है क्योंकि इसके लिए किसी विशेष माउस पिंजरों की आवश्यकता नहीं होती हैप्रयोग में y। यह भी कम श्रम गहन हम हर दिन engorged टिक इकट्ठा करने के लिए नहीं था के रूप में है। हम दिन 4 और 6 के बाद संक्रमण के बीच टिक एकत्र। अधिकांश 4 दिन-ब-अलग टिक और कुछ शेष 5. दिन-ब-अलग 7 सभी चूहों दिन तक लोगों को टिक से मुक्त थे। लटके हुए लार्वा टिक (तालिका 1) - हम 67% (92% रेंज 52) के एक औसत वसूली करने में सक्षम थे। सभी चूहों स्वस्थ थे और तकलीफ का कोई लक्षण नहीं दिखा।
चित्र 1: दूध पिलाने Ixodes scapularis लार्वा चूहे पर। चूहे को व्यक्तिगत रूप से 50 लार्वा टिक से पीड़ित थे। 6. पिंजरों 7 दिन पर किसी भी शेष टिक के लिए जाँच की और उसके बाद से निकाले गए इन - से लटके हुए टिक दिन 4 के बीच माउस से हटा दिया। एक: भूखा लार्वा टिक के साथ चूहों infesting। बी: एक लार्वा टिक एक माउस के कान करने के लिए संलग्न। सी: एकengorged लार्वा टिक एक माउस, 3 दिन के बाद संक्रमण के कान से जुड़ी। डी: भूखा और पूरी तरह से लटके हुए टिक लार्वा।
चित्र 2: माउस पिंजरे टिक Infestation के लिए सेट करें। दो डिस्पोजेबल माउस पिंजरों एक gerbil पिंजरे के अंदर रखा गया था। लगभग 3 सेमी। पानी gerbil पिंजरे में जोड़ा गया था एक खाई बनाने के लिए। दो तरफा चिपचिपा कालीन टेप टिक भागने से बचने के लिए gerbil पिंजरे के ऊपर किनारों के आसपास चिपका था।
| पशु (चूहा) | लार्वा टिक की कुल संख्या बरामद | प्रतिशत लार्वा टिक बरामद |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| औसत | 66.8% |
सारणी 1: एंजार्जेड आईक्सोड्स स्कैपलरिस लार्वा की संख्या, एनेस्थेटेड माउस मेजबान पर प्रयोगशाला के उपवास के बाद प्राप्त हुई। प्रत्येक माउस को 50 लार्वा से पीड़ित किया गया था।
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Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
आकस्मिक बचने से बचने के लिए टिकी पालन करते समय सुरक्षा उपायों के कई स्तरों के लिए महत्वपूर्ण है सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए चिपचिपा टेप और एक पानी की खाई का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। शरीर का तापमान स्थिर रखने के लिए एनेस्थेटिज्ड माउस को हीटिंग पैड पर रखना महत्वपूर्ण है। हमें यह भी पता चला है कि माउस को शेविंग करने के लिए टिकटिक लगाव के लिए कोई अतिरिक्त लाभ प्रदान नहीं किया गया है। एक व्यक्तिगत माउस को एक पिंजरे में एक सप्ताह के लिए रखा जा सकता है, जिसे एक "टिक रूम" में रखा जाता है जो कि कर्मियों के साथ टिकी के संपर्क को और अधिक सीमित करता है।
संशोधन और समस्या निवारण
टिक-बायोलॉजी और टिक-रोगजन्य क्रियाकलापों के अध्ययन के लिए उच्च-गुणवत्ता, प्रयोगशाला-पौधों की टिकी की आवश्यकता जरूरी है। पिछला खिला प्रोटोकॉल का इस्तेमाल चूहों को स्थिर 6 , 1 रखने के लिए निलंबित तार मंजिल 8 या बेलनाकार पिंजरों का उपयोग किया गया था0 जो अतिरिक्त लागत के साथ-साथ जानवरों के लिए तनाव भी लगाते हैं। इसके अलावा, निलंबित तार पिंजरे में घुसपैठ की जड़ें तार के माध्यम से मूत्र के साथ दूषित पानी में गिरने की अनुमति देती हैं और चूहे के मल को इस प्रकार मोल्ड विकास का खतरा बढ़ जाता है।
तकनीक की सीमाएं
जैसा कि आंकड़ों में दिखाया गया है, हम सफलतापूर्वक औसत 65% (9 2% तक) की टिक्सेस के मुकाबले सफलतापूर्वक पुनर्प्राप्त कर चुके हैं। हम कभी-कभी माउस पिंजरे के बाहर पानी की खाई में टिक्सेस पाए लेकिन कोई नहीं बच गया। दूसरी कंटेनर की बाहरी दीवारों पर चिपचिपा टेप से भागने से टिक्स को रोका गया।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों से सम्मान के साथ तकनीक का महत्व
जूता बॉक्स शैली डिस्पोजेबल चूहों के पिंजरों का उपयोग करने के हमारे प्रोटोकॉल गति की नि: शुल्क सीमा परमिट और यह दर्शाता है कि चूहों को टिक फीट करने की अनुमति देने की आवश्यकता नहीं है। अधिकांश खिलाड़ियों को आसानी से देखा जा सकता है और पारदर्शी पिंजरे की दीवारों से एकत्र किया जाता है और किसी भी शेष टिक आसानी से होते हैंखिला चक्र के अंत में बिस्तर में पता चला। इस प्रोटोकॉल को किसी भी कस्टम माउस पिंजरे की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार, यह लागत प्रभावी है
साहित्य से पता चलता है कि 50% से कम टिक टिकने के लिए माउस से जुड़ा होता है और सभी संलग्न टिक्स को पूरा करने के लिए फ़ीड नहीं करता है। औसतन, हमने ~ 60% एंजार्जेड लार्वाल टिक्स एकत्र किए। हमें किसी भी बेकार या खिलाया टिक्स से बच नहीं पाया। कभी-कभी हमें पानी की खाई में एक या दो इंजेक्टेड लार्वाल टिक्स मिले लेकिन चिपचिपा टेप पर कोई नहीं। हमारे परिणाम यह सुझाव देते हैं कि मेजबान से सभी प्रकार की टिक टिक न करें और बिना भोजन के मर सकते हैं। अनफ़्रमित, कूड़े में मरे हुए टिक्कों को ढूंढना मुश्किल था। कभी-कभी, हम भी सफेद बिस्तर पर खून के दाग पाए जाते हैं जो सुझाव देते हैं कि या तो माउस ने उतरने या खरोंच के बाद उत्तेजित टिक मारा है। पिंजरों के हमारे डेटा और दैनिक निरीक्षण से पता चलता है कि संक्रमित टकियां पिंजरे की दीवारों और पिंजरे के शीर्ष पर आगे बढ़ती हैं या माउस के पहुंच से बिस्तर के नीचे छिपती हैं। इसलिए, संलग्न पिंजरे में एक नहीं हैटिकटिक अस्तित्व पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है
इस तकनीक को माहिर रखने के बाद भविष्य के अनुप्रयोग या निर्देश
हमारे प्रोटोकॉल में अतिरिक्त खर्च या जानवरों को संभालने वाले कर्मियों की सुरक्षा को कम करने के बिना टिक्ल्स के जन-पालन के लिए एक सरल विकल्प उपलब्ध है। भविष्य का प्रयोग वयस्क खिला खिलातों के तरीकों में सुधार पर केंद्रित होगा I scapularis ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
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