Summary
Produktionen af sunde laboratorie-opdrættet flåter er afgørende for undersøgelser af kryds biologi, og kryds-patogen interaktioner. Her demonstrerer vi en enkel protokol til umodne kryds fodring, der er omkostningseffektiv og mindre stressende for mus.
Abstract
Ixodes scapularis , vektoren af Lyme-sygdom, er en af de vigtigste sygdomsvektorer i det østlige og det sydvestlige USA. Denne art er en tre vært tick, der kræver et blodmel fra en hvirveldyr vært for hvert udviklingsstadium, og de voksne kvinder kræver et blodmel til reproduktion. Larval flåter vedhæfter deres vært i 3 - 5 dage til fodring og afgivelse af værten, når de er fuldt engorged. Denne afhængighed af flere forskellige værter og den lange vedhæftningstid for engorgement komplicerer krydsopdræt i laboratorieindstillingen. For at forstå krydsbiologi og kryds-patogen interaktioner er produktionen af sunde laboratorieopdræt flåter imidlertid afgørende. Her demonstrerer vi en simpel, omkostningseffektiv protokol til umodne krydsfodring på mus. Vi ændrede de eksisterende protokoller for nedsat stress på mus og øget fiksering af fodringssucces og overlevelse ved at bruge engangsbure uden maskebunde for at undgå kontakt med flåter wiVandet forurenet med mus urin og afføring.
Introduction
Flåter er obligatoriske hæmatofage ektoparasitter hos hvirveldyr og distribueres over hele verden. I USA er mindst 11 arter af flåter vektorer af patogener af betydning for folkesundheden 1 . Ixodes scapularis er ansvarlig for overførsel af flere patogener, såsom de forårsagende midler af Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) recidiverende feber ( B. miyamotoi), human granulocytisk anaplasmosis ( Anaplasma phagocytophilum ) og babesiosis (Babesia spp.). På trods af vigtigheden af I. scapularis som en sygdomsvektor er det ikke altid muligt at samle disse arachnider i overflod fra naturen til studier i laboratoriet. Derfor er produktion af sunde laboratorieopdræt flåter afgørende for studier af fækbiologi og kryds-patogen-interaktioner.
Livscyklusen for alle hårde flåter (familie Ixodidae), herunder I. scapularis, består af æg og tre aktivee stadier: larve, nymfe, og voksne. Hver aktiv fase feeds på et hvirveldyr vært. De komplekse vekselvirkninger, der finder sted mellem flåter og deres værter over flere dage for fastgørelse og fodring er næsten umuligt at kopiere under anvendelse af kunstige foderautomater, og kan ventes at give nok numre af tilført flåter for masse opdræt 2, 3, 4. Derfor er levende mus og kaniner anvendes hyppigst som værter til opdræt umodne (larver og nymfer), og modne stadier (voksne) af flåter, henholdsvis. Kravet om flere værter til blod fodring i hvert udviklingsstadium komplicerer tick opdræt, og er tids- og omkostningsintensiv 5, 6, 7. Fleste tick opdræt protokoller kræver holde mus i en ophængt trådnet gulv bur 7, 8 eller i en cylindrisk caGe af sådanne dimensioner, at dyret ikke kan bevæge sig frit og pleje sig selv 6 , 9 , 10 .
Disse cylindriske bure overføres senere til en skoboksbur med et trådgitter. Engorged, fritliggende flåter samles derefter fra vandet nedenunder. Denne metode resulterer imidlertid i udsættelse af fodret flåter for vand forurenet med urin og afføring, der kan øge svampevækst og krydsdødelighed 9 . Derudover øger det muligheden for at tippe undslippe fra vandtruget, såvel som forårsager spænding på mus. For at omgå disse problemer demonstrerer vi her larvalkekødfoder på mus indenfor engangsskure af plastiksko. Denne metode tillader musernes normale opførsel, øger indhyllet tæksgendannelse og nedsætter tærskelødeligheden på grund af forurening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen (Nummer-00682) beskrevet nedenfor er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Nevada Reno og følger retningslinjerne fra University of Nevada, Renos dyreforskningsetiske udvalg. Kort fortalt blev musene bedøvet med isofluran, og en næse-konus blev anvendt til at opretholde kontinuerlige isofluran-niveauer i 20 minutter. En veterinærsalve blev brugt til at forhindre tørring af øjne under anæstesi. Tå nippel blev brugt til at fastslå anæstesieniveauet og vejrtrækningen blev målt gennem hele proceduren. Mus blev opbevaret i individuelle bur og overvåges, indtil bevidstheden blev genvundet. Mus blev kun brugt én gang til foderfodring og blev euthaniseret efter krydsgendannelse. Eutanasi blev udført af Laboratoriet for Medicinsk Medicinsk personale. CO 2 og cervikal dislokation blev anvendt til euthanisering af dyr.
BEMÆRK: At arbejde med flåter kræver brug af komplette personlige beskyttelsesekvivalenterUDSTYR. Ved tælling af umodne flåter skal du bære hvide labjakker, lange nitrilhandsker til at dække muffens åbning af lab coat, der er dækket af gummibånd og lukkede sko. Ved angreb af mus med flåter skal du bruge et hårnet, engangsoveralls, langærmede handsker over ærmerne og foddæksler. Brug hvide eller lyse farver til at opdage farvede ticks. Kontroller regelmæssigt handsker og ærmer til flåter.
1. Forberedelse af plads til husdyrbrug
- Udpeg et separat rum til hus mus inficeret med flåter. Placér en klæbrig mått eller dobbeltsidet tæppebånd udenfor og inde i døren for at forhindre utilsigtet krydsflukt.
2. tælle flåter til mus infestation
- Sæt dobbeltsidet tape rundt om de øverste kanter af en 7 "x 5" x 14 "plastikbeholder og fyld med vand til ca. 2 cm.
- Anbring en anden lille kasse eller petriskål i midten af beholderen og fyld med vand til 1 cm, hvilket skaber en &# 34; voldgrav" omkring denne beholder
- Opbevar hætteglasset med larver eller nymfer inde i petriskål.
- Bruge en fin malerpensel at fjerne larver eller nymfer fra hætteglasset og tælle under mikroskopet. Tæller 50 larver eller 25 nymfer i separate scintillationsglas. Dæk hætteglassene straks med nylonnet eller organdi klud skærm og tæt med elastikker.
3. infesting mus med Umodne Flåter
- Brug en hvid eller lys farvet arbejdsbord og holde dobbeltklæbende tape rundt langs kanten af arbejdsområdet.
- Bedøver mus med isofluran. Kontroller niveauet af anæstesi ved tå knivspids. Når bedøvet, overføre musen til en varmepude dækket med køkkenrulle og tillægger en næse kegle for fortsat isofluran forsyning.
- Påfør vaseline-baserede øjensalve for at undgå tørhed. Bemærk den åndedrætsmønster af musen for at justere isofluran niveauer (80 -. 230 vejrtrækninger pr minut er normalt, Reducer isofluran niveau, hvis breathing er mindre end 80 vejrtrækninger per minut for at undgå at dræbe dyret).
- Tage et hætteglas af 50 larver eller 25 nymfer og sted flåter under pelsen på hovedet mellem ørerne med en malerpensel (figur 1). Holde musen under anæstesi i 20 minutter efter placering for at give tilstrækkelig tid for flåter vedhæfte.
- Flyt musen til en standard, plastskotøjsæske Engangsble musebur med statiske låg og hvid strøelse. Giv legetøj, vand og mad ad libitum som normalt mus pleje.
- Opbevar musebur i en større rotte eller gerbil bur foret med dobbeltsidet tape rundt øverste kanter. Fyld den ydre bur med 3 cm vand (Figur 2).
4. Indsamling Flåter fra mus
- Umodne flåter frigøre mellem dag 3 og 6 i fodring. Kontroller bure og vand voldgrav til engorged flåter hver dag efter dag 3.
- Indsamle detached flåter fra buret mellem dag 4 og 6. Brug en smerteT børste eller bløde tænger til opsamling af indespærrede flåter og opbevar i rene scintillationsflasker, der er dækket med nylon mesh klud sikret med gummibånd.
- Bedøve og tjek musen på dag 7 for eventuelle resterende vedhæftede tæger.
- Kontroller sengetøj, madtrug og vandflaske til hakkede flåter på dag 7. Uddøde mus efter proceduren som beskrevet ovenfor. Autoklaver de engangsbure, sengetøj, vandflaske og madtrug for at undgå undslipning af ujævne flåter.
5. Opbevaring af Fed Ticks
- Vedligeholdelse af fedtede flåter med 90% fugtighed, 20 ° C og en 12:12 lys: mørk cyklus i en fugtigheds- og temperaturstyret inkubator, indtil der forekommer smeltning. Det kan tage cirka 12 til 18 uger at forekomme.
- Mens høj fugtighed fremmer fiks overlevelse, gør det også flåterne tilbøjelige til svamp overgrowth. Kontroller de fodrede flåter under mikroskopet mindst en gang om ugen til skimmel. Hvis detekteres, vaskes overlevende i 70% ethanol til 5min., skylles i vand og overføres til en filterpapir til at tørre, og overførsel til nye, rene hætteglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi modificeret eksisterende tick opdræt protokoller 6, 10 for forbedret fodring effektivitet og mindre stress på musen vært. Resultaterne viser, at de faste skotøjsæske stil mus bure er velegnede til kryds opdræt. Den hvide strøelse forudsat en god kontrast til nem samling af fodret flåter. De fleste flåter klatrede op ad væggene i beholderne efter fodring og var nemme at samle. Derudover stramme monteret låg af de disponible plastkasser (rutinemæssigt anvendes til mus boliger på UNR) forhindrede kryds flygte fra boksen. Derudover har vi ikke barbere mus for flåtangreb (figur 1). Disse ændringer i offentliggjorte protokoller resulterede i signifikant kryds vedhæftet fil, overfyldning, og overlevelse.
Denne protokol er omkostningseffektiv, da den ikke kræver nogen specielle mus bure uden for disse already er i brug. Det er også mindre arbejdskrævende, da vi ikke nødt til at indsamle engorged flåter hver dag. Vi indsamlede flåter mellem dag 4 og 6 indlæg skadedyrsangreb. De fleste flåter løsrevne på dag 4 og et par resterende løsrevne ved dag 5. dag 7 alle mus var fri for flåter. Vi var i stand til at inddrive et gennemsnit på 67% (interval 52 - 92%) engorged larval ticks (tabel 1). Alle mus var sunde og viste ingen tegn på ubehag.
Figur 1: Feeding Ixodes scapularis Larver på mus. Mus blev individuelt inficerede med 50 larval ticks. Det overfyldte flåter faldt fra mus mellem dag 4 - 6. Burene blev kontrolleret for eventuelle resterende tæger på dag 7 og kasserede derefter. A: infesting mus med ikke-fodrede larval ticks. B: En larve tick fastgørelse til øret på en mus. C: EnEngorged larval tick knyttet til øret af en mus, 3 dag efter angreb. D: Unfed og fuldt engorged tick larver.
Figur 2: Muscage Opstillet til Tick-infestation. To engangs musebure blev opbevaret inde i en gerbil bur. Ca. 3 cm. Vand blev tilsat til gerbilburet for at gøre en vallgrav. Dobbeltsidet klæbrig tæppebånd blev fastgjort omkring de øverste kanter af gerbilburet for at undgå krydsflyvning.
| Dyr (mus) | Samlet antal larver flåter genvundet | Procentdel af larve flåter inddrives |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| GENNEMSNIT | 66,8% |
Tabel 1: Antallet af opsvulmede Ixodes scapularis Larver udvundet efter Laboratory Infestation på bedøvede mus værter. Hver mus var inficerede med 50 larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske skridt i protokollen
Det er vigtigt at have flere niveauer af sikkerhedsforanstaltninger ved opdræt af flåter for at undgå utilsigtet flugt. Brug af klæbebånd og en vandgrav er afgørende for at sikre sikkerhed. Det er vigtigt at holde den bedøvede mus på en varmepude for at holde kroppens temperatur konstant. Vi fandt også, at barbering med musen ikke giver nogen ekstra fordel for kryds vedhæftning. En individuel mus kan opbevares i samme bur i en uge i et udpeget "tick room", som yderligere begrænser kontakt med flåter med personale.
Ændringer og fejlfinding
Produktionen af højkvalitets laboratorieopdræt flåter er nødvendig for undersøgelser af tykbiologi og kryds-patogen interaktioner. Tidligere fodringsprotokoller anvendte suspenderet trådgulv 8 eller cylindriske bur til at holde musene immobile 6 , 10 som medfører ekstra omkostninger samt stress på dyret. Derudover tillader det hængende ledningskamme, at de indgroede flåter falder gennem ledningen ind i vandet forurenet med urin og fæces af musen og derved øger risikoen for skimmelvækst.
Begrænsninger af teknikken
Som vist i data, har vi med succes genoprettet 65% (op til 92%) flåter. Vi fandt lejlighedsvis flåter i vandgrav uden for musekassen, men ingen undslap. Klæbebåndet på ydervæggene på den anden beholder forhindrede flåterne i at undslippe.
Betydningen af teknikken med respekt for eksisterende / alternative metoder
Vores protokol om at bruge skolemodeller med engangsmus bur tillader fri bevægelsesfrihed og viser, at mus ikke behøver at blive fastholdt for at tillade krydsfodring. Mest fodrede flåter blev let set og samlet fra de gennemsigtige burvægge og eventuelle resterende flåter er letopdaget blandt strøelse i slutningen af fodring cyklus. Denne protokol kræver ingen brugerdefineret mus bur, og dermed er det omkostningseffektiv.
Litteratur antyder, at mindre end 50% af flåter tillægger mus og ikke alle tilsluttede flåter foder til afslutning. På et gennemsnit, vi indsamlet ~ 60% engorged larver flåter. Vi fandt ikke nogen undsluppet ikke-fodrede eller fodret flåter. Lejlighedsvis vi fundet en eller to engorged larve flåter i vand voldgrav men ingen på tape. Vores resultater tyder på, at ikke alle tæger vedhæfte til værten og kan dø uden fodring. Unfed, døde flåter var svære at finde i kuldet. Lejlighedsvis, fandt vi også blod pletter på den hvide strøelse, som tyder på, at enten mus har dræbt den fyldte kryds efter slippe væk eller ridset af. Vore data og daglig observation af bure tyder på, at engorged flåter enten bevæge sig op på burets vægge og toppen af buret eller gemme sig under strøelse væk fra musen rækkevidde. Derfor behøver den vedlagte buret ikke have enY negativ indvirkning på tick overlevelse.
Fremtidige Applikationer eller Retninger efter Mastering af denne Teknik
Vores protokol giver et forenklet alternativ til masseopdræt af flåter uden at tilføje ekstraomkostninger eller reducere sikkerheden hos personalet, der håndterer dyrene. Fremtidige eksperimenter vil fokusere på at forbedre metoder til fodring af voksne I. scapularis .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
