Summary
건강한 실험실에서 재배 한 진드기의 생산은 진드기 생물학 및 진드기 - 병원체 상호 작용에 대한 연구에 필수적입니다. 여기서 우리는 마우스에 비용 효과적이고 스트레스가 적은 미성숙 진드기 먹이를위한 간단한 프로토콜을 시연합니다.
Abstract
Ixodes의 scapularis, 라임 병의 벡터, 동부와 중서부 미국에서 가장 중요한 질병 벡터 중 하나입니다. 이 종은 각 개발 단계의 척추 호스트에서 혈액 식사를 필요로하는 세 개의 호스트 틱, 그리고 성인 여성은 재생을위한 혈액 식사를 필요로한다. 수유 5 일 완전히 부풀어 오른 경우 호스트를 내려 - 애벌레는 3 자신의 호스트에 연결 틱. 여러 호스트에이 종속성과 울혈의 긴 부착 시간은 실험실 환경에서 틱 양육을 복잡하게한다. 그러나 상호 작용 틱 생물학을 이해하고 병원체를 체크하기 위해, 건강, 실험실 사육 틱의 생산이 필수적이다. 여기, 우리가 쥐에 먹이 미성숙 한 진드기에 대한 간단하고 비용 효율적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 생쥐에서 감소 스트레스에 대한 기존의 프로토콜을 수정 틱 위스콘신의 접촉을 피하기 위해 메쉬 바닥없이 일회용 케이지를 사용하여 성공과 생존을 공급 틱 증가생쥐 소변과 대변으로 오염 된 물.
Introduction
진드기는 척추 동물의 가지 의무적 hematophagous 체외 기생충이며, 전 세계적으로 배포됩니다. 미국의 경우, 틱의 적어도 11 종은 공중 보건의 중요성 (1)의 병원균의 벡터이다. Ixodes의 scapularis는 라임 병 (보렐리 burgdorferi에) 열 (B.의 miyamotoi를) 재발, 인간 과립구 anaplasmosis (아나 플라스마의 phagocytophilum), 및 babesiosis의 원인이되는 에이전트로 여러 병원체의 전송에 대한 책임 (Babesia 종.). 실험실에서 연구 야생에서 풍부한에서이 거미를 수집 질병 벡터 등의 I.의 scapularis의 중요성에도 불구하고 항상 가능하지 않습니다. 따라서, 건강한 실험실 사육 틱의 생산 틱 생물학에 대한 연구에 필수적이며, 상호 작용 병원체을 선택합니다.
I.의 scapularis을 포함한 모든 하드 진드기 (가족 Ixodidae)의 라이프 사이클은, 계란 세 액티브 구성e 단계 : 유충, 요정, 및 성인. 각 활성 단계는 척추 동물 숙주에게 먹이를줍니다. 첨부와 수유 며칠 동안 진드기와 숙주 사이에서 발생하는 복잡한 상호 작용은 인공 지류를 사용하여 거의 복제 할 수 없으며 대규모 양육 2 , 3 , 4 에 충분한 수의 진드기를 제공하지는 않습니다. 따라서 생쥐와 토끼는 미성숙 (애벌레와 애벌레) 및 진드기의 성숙 단계 (어른)를 키우는 주인으로 가장 많이 사용됩니다. 각 발달 단계에서 혈액 공급을위한 다중 숙주의 요구는 진드기 양육을 복잡하게하고, 시간과 비용을 많이 소비한다 5 , 6 , 7 . 대부분의 진드기 양육 프로토콜은 매달린 와이어 그리드 플로어 케이지 7 , 8 또는 원통형 ca동물이 자유롭게 이동 자체 6, 9, 10을 손질 할 수없는 등의 치수 GE.
이 원통 케이지 후에 와이어 그리드와 콘서트홀 케이지에 전송된다. 충혈, 분리 틱이어서 아래 물로부터 수집된다. 그러나 공급 노출이 Methods는 소변과 곰팡이의 성장을 증가시키고 사망률 (9)을 체크 할 수 배설물로 오염 된 물에 틱. 또한, 눈금 물 통 탈출뿐만 아니라 마우스에 스트레스를 야기 할 가능성을 증가시킨다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 여기에 플라스틱 신발 상자 형 일회용 케이지 내에서 마우스에 애벌레 진드기 먹이를 보여줍니다. 이 방법은 틱 복구 충혈 마우스 증가의 정상적인 동작을 허용하고, 오염물에 의한 진드기 사망률을 감소시킨다.
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Protocol
아래에 설명 된 프로토콜 (수-00682)는 네바다 리노의 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 네바다, 리노의 동물 연구 윤리위원회의 대학의 지침을 다음입니다. 요약하면, 마우스를 이소 플루 란으로 마취시키고, 노즈콘을 20 분 동안 연속 이소 플루 수준을 유지하기 위해 사용되었다. 수의사의 연고 마취 눈의 건조를 방지하기 위해 사용되었다. 발가락 핀치는 마취 수준을 확인하는 데 사용 된 호흡 속도는 절차를 통해 측정 하였다. 마우스는 각각의 케이지에 보관 의식이 회복 될 때까지 관찰 하였다. 마우스는 틱 공급 한 번만 사용 된 포스트 틱 복구를 안락사시켰다. 안락사는 동물 의학 직원 인원의 연구소에 의해 수행되었다. CO 2 및 자궁 경부 탈구 동물을 안락사에 사용되었다.
참고 : 틱에서 작업이 완료 개인 보호 EQ의 사용을 필요로uipment. 미성숙 틱 카운트 흰색 실험실 코트, 고무 밴드로 캡핑 실험실 코트 슬리브의 개구를 커버하는 긴 니트릴 장갑 막힌 신발을 착용한다. 진드기와 마우스를 감염시키고 들어, 머리 그물, 일회용 작업복, 소매 위에 긴 소매 장갑, 발 커버를 사용합니다. 변덕스러운 진드기를 감지하는 흰색 또는 밝은 색의 작업복을 사용합니다. 정기적으로 진드기를위한 장갑과 소매를 확인합니다.
동물 주택 1. 준비 룸
- 진드기가 득실 거리는 집 마우스에 별도의 공간을 지정합니다. 사고 틱 탈출을 방지하기 위해 외부와 도어 안쪽에 끈적 끈적한 매트 또는 양면 카펫 테이프를 놓습니다.
2. 계수 마우스 침입 틱
- 모든 7 "× 5"X 14 "플라스틱 용기의 상부 가장자리 주위에 양면 테이프를 넣고 약 2cm 물로 채운다.
- A & 컨테이너의 중앙에 다른 작은 상자 또는 페트리 접시에 놓고 생성 1cm 물로 채우기# 34; 해자 "
- 페트리 접시 안에 애벌레 또는 애벌레가 들어있는 유리 병을 보관하십시오.
- 유리 병에서 애벌레 또는 애벌레를 제거하고 현미경으로 계산하려면 훌륭한 페인트 브러시를 사용하십시오. 50 개의 애벌레 또는 25 명의 애벌레를 별도의 신틸레이션 바이알로 계산하십시오. 나일론 메쉬 나 organdy 천 스크린으로 즉시 튜브를 덮고 고무 밴드로 막으십시오.
3. 미성숙 한 틱으로 생쥐에 감염
- 흰색 또는 밝은 색상의 작업대를 사용하고 작업 영역의 둘레에 양면 테이프를 붙입니다.
- isoflurane으로 마우스를 anesthetize. 발가락 핀치로 마취 수준을 확인하십시오. 마취가 끝나면 마우스를 종이 타월로 덮인 가열 패드로 옮기고 계속해서 이소 플루 란 공급을 위해 코 콘에 붙이십시오.
- 건조를 피하기 위해 석유 젤리 기반 안약을 바르십시오. 마우스의 호흡 양상에 따라 isoflurane 수치를 조절하십시오 (분당 80-230 회 호흡은 정상입니다). br 인 경우 isoflurane 수치를 낮추십시오속도 eathing하는) 동물을 죽이는 피하기 분당 호흡 80 미만이다.
- 50 유충 또는 25 요정 중 한 병을 가지고 장소는 페인트 브러시 (그림 1)과 귀 사이의 머리에 모피에서 틱. 진드기 첨부 할 충분한 시간을 제공하기 위해 배치를 다음 20 분 동안 마취 마우스를 유지합니다.
- 정적 뚜껑과 흰색 침구 표준, 플라스틱 신발 상자 형 일회용 마우스 케이지에 마우스를 이동합니다. 일반 마우스 관리에 따라 장난감, 물, 식품 수의를 제공합니다.
- 상단 가장자리 양면 접착 테이프로 줄 지어 큰 쥐 또는 햄스터 케이지 내에서 마우스 케이지를 저장합니다. 물 3cm (도 2)와 외측 케이스를 채운다.
4. 수집은 마우스에서 펜치
- 미성숙 틱 3 일 (6) 사이에 급전의 분리. 부풀어 오른 진드기 3 일 후 매일 새장 물 해자를 확인합니다.
- 일 4 6. 고통 사이의 케이지에서 분리 된 진드기를 수집t 브러시 또는 고무 밴드로 고정 나일론 메쉬 천으로 덮인 깨끗한 섬광 유리 병에 부풀어 오른 진드기 및 저장을 따기위한 부드러운 집게.
- 마취 및 나머지 부착 진드기 7 일째에 마우스를 확인하십시오.
- 전술 한 바와 같이 절차에 따라 하루 7 안락사 쥐에 부풀어 오른 진드기 침구, 식품 통, 물병을 확인합니다. 어떤 탈출 unfed 틱을 방지하기 위해 일회용 케이지, 침구, 물 병, 식품 저점을 압력솥.
연방 틱 5. 스토리지
- 습도 90 %, 20에서 부풀어 오른 틱 유지 ° C, 및 광 12시 12분 : 습도 및 온도 조절 배양기에서 탈피 암주기가 발생할 때까지. 이 발생하는 약 12 ~ 18 주 걸릴 수 있습니다.
- 높은 습도는 진드기의 생존을 촉진하지만, 또한 곰팡이과 성장하는 경향이 눈금을합니다. 연준이 금형을 위해 적어도 일주일에 한 번 현미경 틱 확인합니다. 검출 된 경우, 5, 70 % 에탄올로 세척 생존자분., 물로 씻어 건조 여과지로 전송하고 새로운 깨끗한 바이알로 옮긴다.
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Representative Results
마우스 숙주의 먹이 효율을 높이고 스트레스를 줄이기 위해 기존의 진드기 양육 프로토콜 6 , 10 을 수정했습니다. 결과는 표준 슈 박스 스타일 마우스 케이지가 진드기 양육에 적합 함을 보여줍니다. 화이트 침구는 깍지 줍기를 쉽게 수집 할 수 있도록 좋은 대비를 제공했습니다. 대부분의 진드기는 수유 후 용기의 벽을 올라가서 수집하기가 쉬웠습니다. 또한, 일회용 플라스틱 상자의 뚜껑이 꼭 끼어서 (UNR에있는 마우스에 일상적으로 사용됨) 진드기가 상자에서 빠져 나가지 못했습니다. 또한, 우리는 진드기에 감염된 쥐를 면도하지 않았습니다 ( 그림 1 ). 발표 된 프로토콜의 이러한 변화는 진드기 부착, 충혈 및 생존을 초래했습니다.
이 프로토콜은 독창적 인 마우스 외부에 특별한 마우스 케이지가 필요 없기 때문에 비용 효율적입니다.y를 사용 중입니다. 우리는 매일 찰싹 때리는 진드기를 수집 할 필요가 없었기 때문에 노동 집약도 적습니다. 우리는 감염 후 4 일에서 6 일 사이에 진드기를 수집했습니다. 대부분의 진드기는 4 일째에 떼어 내고 나머지 5 째는 5 일째에 분리시켰다. 7 일 째까지 모든 쥐에게 진드기가 없었다. 우리는 평균 67 % (52-92 % 범위)의 애벌레가 된 애벌레 진드기를 회복 할 수있었습니다 ( 표 1 ). 모든 생쥐는 건강했으며 불편 함의 징후는 보이지 않았습니다.
그림 1 : 먹는 Ixodes scapularis Larvae on Mice. 마우스는 개별적으로 50 마리의 유충 진드기에 감염되었다. 누적 된 진드기는 4 - 6 일 사이에 마우스에서 떨어졌습니다. 새장은 7 일째 남은 진드기가 있는지 확인한 후 폐기되었습니다. A : 미성숙 한 유충 진드기로 쥐를 감염시킵니다. B : 마우스 귀에 붙어있는 애벌레 진드기. C : An쥐의 귀에 부착 된 충혈 된 애벌레 진드기, 감염 3 일 후. D : 진드기 애벌레가 완전히 자라지 않는.
그림 2 : 진드기 감염에 대한 마우스 케이지 설정. 두 개의 일회용 마우스 케이지는 gerbil 케이지 안에 보관되었습니다. 약 3cm. 물이 gerbil 케이지에 추가되어 해자가되었습니다. 진드기가 빠지지 않도록 양면 접착 카펫 테이프를 gerbil 케이지의 상단 가장자리에 부착했습니다.
| 동물 (마우스) | 회수 된 유충 진드기의 총 수 | 회수 된 백분율 애벌레 진드기 |
| 1 | 34 | 68 % |
| 2 | 32 | 64 % |
| 삼 | (38) | 76 % |
| 4 | (28) | 56 % |
| 5 | (39) | 78 % |
| 6 | (26) | 52 % |
| (7) | (46) | 92 % |
| 8 | (29) | 58 % |
| 9 | (29) | 58 % |
| (10) | (33) | 66 % |
| 평균 | 66.8 % |
표 1 : 마취 마우스 호스트에 연구소 침입 후 복구 부풀어 오른 Ixodes scapularis 애벌레의 수. 각 마우스는 50 유충에 감염되었다.
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Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
진드기를 양육하는 것은 우발적 인 탈출을 방지하기 위해 때 안전 조치의 여러 단계를하는 것이 중요합니다. 접착 테이프와 물 해자의 사용은 안전을 보장하는 것이 중요하다. 몸의 온도를 일정하게 유지하기 위해 가열 패드에 마취 된 마우스를 유지하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 마우스를 면도하는 진드기 첨부 파일에 대한 추가 혜택을 제공하지 않는 것을 발견했다. 개인 마우스가있는 직원과 진드기의 추가 제한 접촉 지정된 "틱 방"에서 일주일 동안 같은 케이지에 보관 될 수있다.
수정 및 문제 해결
고품질의 실험실 사육 틱의 생산은 틱 생물학에 대한 연구와 진드기 병원체 상호 작용이 필요하다. 이전 공급 프로토콜은 생쥐 6 1 부동 계속 현탁 와이어 층 8 원통 케이지를 사용동물에 대한 추가 비용뿐만 아니라 스트레스를 초래 0. 또한, 현탁 와이어 케이지 충혈 틱 소변되므로 곰팡이의 위험을 증가시킨다 마우스 분변에 오염 된 물에 와이어를 통해 하강 할 수있다.
기술의 한계
데이터에 나타낸 바와 같이, 우리는 성공적으로 틱 (92 %까지) 평균 65 %에 회복되었다. 우리는 때때로 마우스 케이지 밖에서 물 해자에 틱을 찾았지만 아무도 탈출하지 않습니다. 제 2 용기의 외부 벽에 접착 테이프를 탈출 눈금을 막았다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 의의
신발 상자 스타일의 일회용 마우스 케이지를 사용하여 우리의 프로토콜은 운동의 자유 범위를 허용하고 마우스 틱 공급을 허용 억제 할 필요가 없다는 것을 보여줍니다. 대부분의 공급 틱 쉽게 알 투명 케이스의 벽에서 수거하고, 나머지 틱 쉽게되어 있었다공급 사이클의 끝 침구 중에서 검출. 이 프로토콜은 따라서, 비용 효과적이며, 사용자 정의 마우스 케이지를 필요로하지 않습니다.
문학은 진드기의 50 % 미만 마우스에 연결하지 연결된 모든 진드기가 완료 될 때까지 먹이를 제안합니다. 평균에, 우리는 ~ 60 % 부풀어 오른 애벌레 틱을 모았다. 우리는 어떤 unfed 또는 공급 틱 탈출 찾지 못했습니다. 때때로 우리는 접착 테이프에 물 해자하지만 아무도 하나 개 또는 두 개의 부풀어 오른 애벌레 진드기를 발견했다. 우리의 결과는 모든 진드기가 호스트에 연결하고 공급없이 죽을 수 있음을 시사한다. Unfed, 죽은 진드기는 쓰레기에서 찾기 어려웠다. 때때로, 우리는 또한 마우스 중 하나가 이탈 후 부풀어 오른 진드기 사망하거나 긁어 것을 제안 흰색 침구에 혈액 얼룩을 발견했다. 우리의 데이터와 케이지 매일 관찰 부풀어 오른 틱 중 하나를 멀리 마우스의 범위에서 침대 아래 케이지 벽에 이동 케이지의 상단 또는 숨길 것이 좋습니다. 따라서, 동봉 된 케이지는 없어진드기의 생존에 악영향 Y.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
우리의 프로토콜은 추가 비용을 추가하거나 동물을 취급 직원의 안전을 저하없이 진드기의 대량 사육에 대한 간단한 대안을 제공합니다. 미래의 실험은 성인 I.의 scapularis을 공급하는 방법을 개선에 초점을 맞출 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
