Summary
إنتاج القراد المختبرية صحية القراد هو ضروري للدراسات على البيولوجيا القراد، والتفاعلات الممرض القراد. هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول بسيط لتغذية غير ناضجة القراد الذي هو فعالة من حيث التكلفة وأقل إرهاقا للفئران.
Abstract
إيكسوديس كتفي ، ناقلات مرض لايم، هي واحدة من ناقلات الأمراض الأكثر أهمية في شرق وغرب الولايات المتحدة الأمريكية. هذا النوع هو ثلاثة مضيف القراد الذي يتطلب وجبة الدم من المضيف الفقاريات لكل مرحلة التطوير، والإناث البالغات تتطلب وجبة الدم للاستنساخ. القراد اليرقات تعلق على مضيفهم لمدة 3-5 أيام للتغذية وإسقاط قبالة المضيف عندما إنكورجيد تماما. هذا الاعتماد على العديد من المضيفين مختلفة ووقت المرفقة طويلة لالتحام يعقد تعقيد القراد في إعداد المختبر. ومع ذلك، لفهم علم الأحياء القراد والتفاعلات الممرض القراد، وإنتاج القراد صحية، والمختبرات تربيته أمر ضروري. هنا، علينا أن نبرهن على بروتوكول بسيط وفعالة من حيث التكلفة للقراد غير ناضجة التغذية على الفئران. قمنا بتعديل البروتوكولات القائمة لانخفاض الضغط على الفئران وزيادة القراد نجاح التغذية والبقاء على قيد الحياة باستخدام أقفاص المتاح دون قيعان شبكة لتجنب الاتصال من القراد وايث المياه الملوثة مع الفئران البول والبراز.
Introduction
القراد والطفيليات الخارجية لدم تلزم من الفقاريات وتوزع في جميع أنحاء العالم. في الولايات المتحدة، لا يقل عن 11 نوعا من القراد هي ناقلات الجراثيم ذات الأهمية للصحة العامة 1. اللبود الكتفي هو المسؤول عن نقل العديد من مسببات الأمراض مثل العوامل المسببة للمرض لايم (بوريليا برغدورفيرية) الحمى الراجعة (B. miyamotoi)، anaplasmosis المحببات البشري (Anaplasma phagocytophilum)، والبابيزيا (بابيزيا النيابة.). وعلى الرغم من أهمية I. الكتفي بمثابة ناقلات الأمراض، وجمع هذه العناكب في وفرة من البرية للدراسات في المختبر ليست دائما ممكنة. ولذلك، فإن إنتاج القراد تربى مختبر صحي ضروري لدراسات في علم الأحياء القراد، والتفاعلات الممرض القراد.
دورة حياة كل القراد الصلب (الأسرة اللبوديات)، بما في ذلك I. الكتفي، تتكون من البيض وثلاثة أكتيفe مراحل: اليرقة، الحورية، والكبار. تتغذى كل مرحلة نشطة على مضيف الفقاريات. التفاعلات المعقدة التي تحدث بين القراد ومضيفيهم على مدى عدة أيام من التعلق والتغذية يكاد يكون من المستحيل تكرار باستخدام المغذيات الاصطناعية، ومن غير المرجح أن توفر ما يكفي من الأرقام من القراد تغذية للتربية الجماعية 2 ، 3 ، 4 . لذلك، يتم استخدام الفئران الحية والأرانب في كثير من الأحيان كمضيفات لتربية غير ناضجة (اليرقات والحوريات)، ومراحل ناضجة (البالغين) من القراد، على التوالي. متطلبات مضاعفات متعددة لتغذية الدم خلال كل مرحلة تنموية تعقيد زراعة القراد، وهو الوقت والتكلفة مكثفة 5 ، 6 ، 7 . تتطلب معظم بروتوكولات تربية القراد حفظ الفئران في قفص الطابق شبكة الأسلاك المعلقة 7 ، 8 أو في كا أسطوانيغي من هذه الأبعاد أن الحيوان لا يمكن أن تتحرك بحرية والعريس نفسه 6 ، 9 ، 10 .
يتم نقل هذه الأقفاص أسطوانية في وقت لاحق إلى قفص الأحذية مع شبكة الأسلاك. إنغورجد، ثم يتم جمع القراد منفصلة من الماء تحتها. ومع ذلك، يؤدي هذا الأسلوب في تعريض القراد تغذية للمياه الملوثة بالبول والبراز التي يمكن أن تزيد من النمو الفطري والوفيات القراد 9 . وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يزيد من إمكانية القراد الهروب من الحوض المائي، فضلا عن التسبب في الإجهاد على الفئران. للتحايل على هذه المشاكل، ونحن هنا تظهر القراد اليرقات التغذية على الفئران داخل البلاستيك صندوق الأحذية من نوع أقفاص القابل للتصرف. هذه الطريقة تسمح للسلوك الطبيعي من الفئران، ويزيد الانتعاش القراد إنغورجد، ويقلل من الوفيات القراد بسبب التلوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الموافقة على البروتوكول (رقم 00682) المبينة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة نيفادا رينو ويتبع المبادئ التوجيهية من جامعة نيفادا والحيوان جنة أخلاقيات البحث رينو. باختصار، كانت تخدير الفئران مع isoflurane وكانت تستخدم مخروط الأنف للحفاظ على مستويات الأيزوفلورين مستمرة لمدة 20 دقيقة. تم استخدام مرهم بيطري لمنع جفاف العيون تحت التخدير. وقد استخدم قرصة اصبع القدم للتأكد من مستوى التخدير وتم قياس معدل التنفس في جميع أنحاء الإجراء. تم الاحتفاظ بها الفئران في أقفاص الفردية ومراقبتها حتى استعاد وعيه. واستخدمت الفئران مرة واحدة فقط لتغذية القراد وكان الموت الرحيم آخر القراد الانتعاش. تم تنفيذ القتل الرحيم من قبل مختبر الموظفين العاملين الطب الحيواني. واستخدمت CO 2 والتفكك عنق الرحم عن القتل الرحيم للحيوانات.
ملاحظة: العمل على القراد يتطلب استخدام مكافئ الحماية الشخصية كاملةuipment. لعد القراد غير الناضجة، وارتداء معاطف المختبر الأبيض، وقفازات النتريل طويلة لتغطية فتح الأكمام من معطف المختبر توج مع العصابات المطاطية، وأحذية مغلقة اصبع القدم. لإصابة الفئران مع القراد، واستخدام شبكة الشعر، والمآزر المتاح، وقفازات طويلة الأكمام على الأكمام، ويغطي القدم. استخدام المآزر البيضاء أو الخفيفة الملونة للكشف عن القراد الضال. افحص القفازات والأكمام بشكل دوري للقراد.
1. إعداد غرفة للإسكان الحيوان
- تعيين غرفة منفصلة لإيواء الفئران المصابة بالقراد. وضع حصيرة لزجة أو على الوجهين الشريط السجاد خارج وداخل الباب لمنع عرضي الهروب القراد.
2. عد القراد للماوس الإصابة
- وضع الشريط على الوجهين في جميع أنحاء حواف أعلى من 7 "× 5" × 14 "حاوية بلاستيكية وملء بالماء إلى حوالي 2 سم.
- وضع مربع صغير آخر أو طبق بتري في وسط الحاوية وملء بالماء إلى 1 سم خلق &# 34؛ خندق "حول هذه الحاوية
- تخزين القارورة التي تحتوي على اليرقات أو الحوريات داخل طبق بتري.
- استخدام فرشاة الطلاء غرامة لإزالة اليرقات أو الحوريات من قارورة والعد تحت المجهر. عد 50 اليرقات أو 25 الحوريات في قوارير التلألؤ منفصلة. تغطية قارورة على الفور مع شبكة النايلون أو شاشة قماش الأورجانزا وإغلاق مع العصابات المطاطية.
3. إصابة الفئران مع القراد غير ناضجة
- استخدم مقعد عمل أبيض أو خفيف اللون وقم بإحكام الشريط على الوجهين حول محيط منطقة العمل.
- تخدير الماوس مع إيسوفلوران. التحقق من مستوى التخدير من قبل أخمص القدمين قرصة. مرة واحدة تخدير، ونقل الماوس إلى وسادة التدفئة مغطاة المناشف الورقية ونعلق على مخروط الأنف لاستمرار إيسوفلوران العرض.
- تطبيق مرهم النفط القائمة على هلام العين لتجنب جفاف. لاحظ نمط التنفس من الماوس لضبط مستويات الأيزوفلورين (80 - 230 الأنفاس في الدقيقة أمر طبيعي.، خفض مستوى الأيزوفلورين إذا برإيثينغ معدل أقل من 80 نفسا في الدقيقة لتجنب قتل الحيوان).
- تأخذ قارورة واحدة من 50 اليرقات أو 25 الحوريات ووضع القراد تحت الفراء على الرأس بين الأذنين مع فرشاة الطلاء ( الشكل 1 ). الحفاظ على الماوس تحت التخدير لمدة 20 دقيقة بعد التنسيب لإعطاء ما يكفي من الوقت للقراد نعلق.
- حرك الماوس إلى معيار، حذاء من البلاستيك مربع من نوع قفص الماوس القابل للتصرف مع الأغطية الساكنة والفراش الأبيض. توفير اللعب والماء، والغذاء ليبيتوم الإعلانية وفقا للرعاية الماوس العادية.
- تخزين قفص الماوس داخل الفئران أكبر أو قفص جيربيل اصطف مع شريط لاصق على الوجهين حول حواف أعلى. ملء القفص الخارجي مع 3 سم من الماء ( الشكل 2 ).
4. جمع القراد من الفئران
- القراد غير الناضجة فصل بين أيام 3 و 6 من التغذية. تحقق من الأقفاص وخندق المياه للقراد إنغورجد كل يوم بعد يوم 3.
- جمع القراد منفصلة من القفص بين أيام 4 و 6. استخدام الألمر فرشاة أو ملقط لينة لالتقاط القراد إنغورجد وتخزينها في قوارير التلألؤ نظيفة توج مع شبكة قماش النايلون المضمون مع العصابات المطاطية.
- تخدير وفحص الماوس في يوم 7 عن أي القراد المتبقية المرفقة.
- تحقق من الفراش، الحوض الغذائي، وزجاجة المياه للقراد إنكورجيد في يوم 7. الموت ببطء الفئران بعد الإجراء كما هو موضح أعلاه. الأوتوكلاف أقفاص القابل للتصرف، والفراش، وزجاجة المياه، وحوض الغذاء لتجنب أي الهروب القراد أونفيد.
5. تخزين الاحتياطي الفيدرالي القراد
- الحفاظ على القراد إنكورجد في 90٪ الرطوبة، 20 ° C، و 12:12 ضوء: دورة مظلمة في الرطوبة ودرجة الحرارة حاضنة تسيطر حتى يحدث مولتينغ. قد يستغرق ذلك ما بين 12 و 18 أسبوعا تقريبا.
- في حين أن الرطوبة العالية تعزز البقاء على قيد الحياة القراد، كما أنه يجعل القراد عرضة للفرط الفطري. تحقق القراد تغذية تحت المجهر مرة واحدة على الأقل في الأسبوع للعفن. إذا تم الكشف عنها، وغسل الناجين في الايثانول 70٪ لمدة 5دقيقة، شطف في الماء، ونقل إلى ورقة مرشح لتجف، وينقل إلى قارورة نظيفة جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتعديل بروتوكولات تربية القراد الحالية 6 ، 10 لتحسين كفاءة التغذية وخفض الضغط على المضيف الماوس. وأظهرت النتائج أن أقفال الماوس نمط صندوق الأحذية القياسية هي مناسبة تماما لتربية القراد. وفرت الفراش الأبيض تباين جيد لسهولة جمع القراد تغذية. صعدت معظم القراد جدران الحاويات بعد التغذية وكان من السهل جمعها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الغطاء المجهز الضيق من الصناديق البلاستيكية التي يمكن التخلص منها (التي تستخدم بشكل روتيني لإسكان الفئران في أونر) منع هروب القراد من الصندوق. بالإضافة إلى ذلك، نحن لم يحلق الفئران للقراد إصابة ( الشكل 1 ). وقد أدت هذه التغييرات في البروتوكولات المنشورة إلى ارتباط ملحوظ بالقرع، والحنش، والبقاء على قيد الحياة.
هذا البروتوكول هو فعالة من حيث التكلفة لأنها لا تتطلب أي أقفاص الماوس الخاصة خارج تلك الصفحاتy في الاستخدام. بل هو أيضا أقل كثافة في اليد العاملة كما لم يكن لدينا لجمع القراد إنغورجد كل يوم. جمعنا القراد بين أيام 4 و 6 آخر إصابات. معظم القراد منفصلة بحلول يوم 4 وعدد قليل منها المتبقية منفصلة بحلول يوم 5. بحلول يوم 7 جميع الفئران كانت خالية من القراد. لقد تمكنا من استعادة متوسط 67٪ (مجموعة 52 - 92٪) محشور القراد اليرقات ( الجدول 1 ). كانت جميع الفئران صحية ولم تظهر أي علامات عدم الراحة.
الشكل 1: تغذية إيكسوديس سكابولاريس اليرقات على الفئران. الفئران كانت مصابة بشكل فردي مع 50 القراد اليرقات. القراد انغورجد انخفض الماوس بين أيام 4-6. تم فحص الأقفاص عن أي علامات المتبقية في يوم 7 وتجاهل بعد ذلك. ج: تصيب الفئران مع القراد اليرقات غير المؤكدة. B: القراد اليرقات تعلق على الأذن من الماوس. C: أنانكورجد القراد اليرقات تعلق على الأذن من الفأر، 3 يوم آخر الإصابة. D: غير مؤكدة و إنكورجد تماما اليرقات القراد.
الشكل 2: قفص الماوس اقامة لقراد الإصابة. تم الاحتفاظ اثنين من أقفاص الماوس القابل للتصرف داخل قفص جيربيل. حوالي 3 سم. تمت إضافة المياه إلى قفص جيربيل لجعل خندق. تم تثبيت الشريط السجاد لزجة على الوجهين حول حواف أعلى من قفص جيربيل لتجنب الهروب القراد.
| حيوان (ماوس) | إجمالي عدد القراد اليرقات تعافى | نسبة القراد اليرقات تعافى |
| 1 | 34 | 68٪ |
| 2 | 32 | 64٪ |
| 3 | 38 | 76٪ |
| 4 | 28 | 56٪ |
| 5 | 39 | 78٪ |
| 6 | 26 | 52٪ |
| 7 | 46 | 92٪ |
| 8 | 29 | 58٪ |
| 9 | 29 | 58٪ |
| 10 | 33 | 66٪ |
| معدل | 66.8٪ |
الجدول 1: عدد محتقن اللبود الكتفي يرقات المستردة بعد مختبر الإصابة على العوائل تخدير ماوس. كانت موبوءة كل فأر مع 50 اليرقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
من المهم أن يكون لديك عدة مستويات من تدابير السلامة عند تربية القراد لتجنب هروب عرضي. استخدام شريط لاصق وخندق المياه حاسمة لضمان السلامة. فمن المهم للحفاظ على الماوس تخدير على وسادة التدفئة للحفاظ على ثبات درجة حرارة الجسم. كما وجدنا أن حلق الماوس لا تقدم أي فائدة إضافية لمرفق القراد. يمكن الاحتفاظ الماوس الفردي في نفس القفص لمدة أسبوع واحد في المعينة "غرفة القراد" الذي فرض المزيد من القيود الاتصال القراد مع الموظفين.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
إنتاج عالية الجودة، والقراد تربى مختبر ضروري لإجراء دراسات عن علم الأحياء القراد والتفاعلات القراد الممرض. بروتوكولات التغذية السابقة استخدمت علقت الطابق الأسلاك 8 أو أقفاص أسطواني للحفاظ على الفئران متحرك 6، 10 التي تكبد تكلفة إضافية وكذلك الإجهاد للحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قفص الأسلاك المعلقة يسمح القراد إنغورجد أن تسقط من خلال الأسلاك في الماء الملوثة بالبول والبراز من الماوس وبالتالي زيادة خطر نمو العفن.
قيود التقنية
كما هو مبين في البيانات، نجحنا في استرداد 65٪ (ما يصل إلى 92٪) من القراد. وجدنا في بعض الأحيان القراد في خندق المياه خارج قفص الماوس ولكن لا أحد هرب. وكان الشريط اللاصق على الجدران الخارجية للحاوية الثانية يمنع القراد من الفرار.
أهمية التقنية فيما يتعلق بالطرق القائمة / البديلة
بروتوكول لدينا من استخدام الأحذية مربع نمط أقفاص الفئران المتاح تصاريح حرية مجموعة من الحركة ويوضح أن الفئران لا تحتاج إلى ضبط النفس للسماح القراد التغذية. كان ينظر بسهولة معظم القراد تغذية وجمعها من جدران قفص شفافة وأية علامات المتبقية هي بسهولةيتم الكشف عنها بين الفراش في نهاية دورة التغذية. هذا البروتوكول لا يتطلب أي قفص الماوس مخصص، وبالتالي، فمن فعالة من حيث التكلفة.
ويشير الأدب إلى أن أقل من 50٪ من القراد تعلق على الماوس وليس كل القراد المرفقة تغذية إلى الانتهاء. في المتوسط، جمعنا ~ 60٪ إنكورجد القراد اليرقات. لم نجد أي هرب غير مؤهل أو تغذية القراد. في بعض الأحيان وجدنا واحد أو اثنين من القراد اليرقات محفورة في خندق المياه ولكن لا شيء على الشريط اللاصق. نتائجنا تشير إلى أن ليس كل القراد تعلق على المضيف، ويمكن أن يموت دون تغذية. لم يكن من الصعب العثور على القراد الميتة في القمامة. في بعض الأحيان، وجدنا أيضا بقع الدم على الفراش الأبيض مما يشير إلى أن إما الماوس قتلوا القراد إنغورجد بعد السقوط أو خدش. بياناتنا والمراقبة اليومية للأقفاص تشير إلى أن القراد محفورة إما تتحرك صعودا على جدران القفص وأعلى من القفص أو إخفاء تحت الفراش بعيدا عن متناول الماوس. ولذلك، فإن قفص المغلقة ليس لديهاتأثير سلبي على ذ بقاء القراد.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
يوفر بروتوكول لدينا بديل مبسط للتربية الجماعية من القراد دون إضافة تكاليف إضافية أو الحد من سلامة التعامل مع الحيوانات الموظفين. وستركز التجارب في المستقبل على تحسين طرق تغذية الكبار I. الكتفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
