Summary
Производство здоровых лабораторными выращены клещи необходимо исследования по клещу биологии, и тик-патоген взаимодействий. Здесь мы демонстрируем простой протокол для незрелого кормления клеща, что является экономически эффективными и менее напряженным для мышей.
Abstract
Ixodes scapularis , вектор болезни Лайма, является одним из наиболее важных переносчиков заболеваний в восточной и среднезападной части Соединенных Штатов. Этот вид представляет собой трёхмерный клещ, для которого требуется кровь из позвоночного хозяина для каждой стадии развития, а взрослым самкам требуется кровь для размножения. Клещи личинок прикрепляются к хозяину в течение 3 - 5 дней для кормления и высадки хозяина при полном насыщении. Эта зависимость от нескольких разных хостов и длительное время присоединения для нагрубания затрудняет выращивание клещей в лабораторных условиях. Тем не менее, чтобы понять биохимию клещей и клещевые патогенные взаимодействия, производство здоровых, лабораторно выращенных клещей очень важно. Здесь мы демонстрируем простой, рентабельный протокол для незрелого клещевого кормления на мышах. Мы модифицировали существующие протоколы для снижения стресса у мышей и увеличили успех клещей и выживаемость, используя одноразовые клетки без дна сетки, чтобы избежать контакта клещей wiЙ воды, загрязненной мочой мышей и фекалиями.
Introduction
Клещи являются обязательными гематофагическими эктопаразитами позвоночных и распространены во всем мире. В Соединенных Штатах, по крайней мере, 11 видов клещей являются переносчиками патогенов, имеющих важное значение для общественного здоровья 1 . Ixodes scapularis ответственен за передачу нескольких патогенов, таких как возбудители болезни Лайма ( Borrelia burgdorferi ), рецидивирующая лихорадка ( B.miyamotoi), гранулоцитарный анаплазмоз человека ( Anaplasma phagocytophilum ) и бабезиоз (Babesia spp.). Несмотря на важность I. scapularis как вектор болезни, сбор этих паукообразных в изобилии из дикой природы для исследований в лаборатории не всегда возможен. Таким образом, производство здоровых лабораторных клещей имеет важное значение для изучения биологии клещей и клещевого патогенного взаимодействия.
Жизненный цикл всех тяжелых клещей (семейство Ixodidae), включая I. scapularis, состоит из яйца и трех активныхЕ стадии: личинка, нимфа и взрослый. Каждая активная стадия питается позвоночным хозяином. Сложные взаимодействия, которые происходят между клещами и их хозяевами в течение нескольких дней прикрепления и кормления, почти невозможны для репликации с использованием искусственных фидеров, и вряд ли они обеспечат достаточное количество сытых клещей для массового выращивания 2 , 3 , 4 . Поэтому живые мыши и кролики чаще всего используются в качестве хозяев для выращивания незрелых (личинок и нимф) и зрелых стадий (взрослых) клещей, соответственно. Требование множественных хостов для кроветворения в течение каждой стадии развития усложняет клещевое разведение и требует значительных затрат времени и средств 5 , 6 , 7 . Большинство протоколов размножения клещей требуют удерживания мышей в клетке 7 или 8 в подвесной проволочной сетке или в цилиндрическом саGE таких размеров , что животное не может свободно перемещаться и жених себя 6, 9, 10.
Эти цилиндрические клетки, которые затем переносили в обувной коробке клетку с проволочной сеткой. Напитавшиеся, отдельные клещи затем собирает из воды под ним. Тем не менее, этот метод приводит к обнажая кормили клещей воды , загрязненной мочой и калом , которые могут увеличить рост грибковой и тикают смертность 9. Кроме того, это увеличивает возможность клеща выхода из воды желоба, а также вызывает стресс у мышей. Чтобы обойти эти проблемы, мы здесь демонстрируем личиночное кормление клеща на мышах в течение пластик коробки типа одноразовых клеток. Этот метод позволяет нормальное поведение мышей, увеличивается напитавшихся восстановление тик, тик и уменьшает смертность вследствие загрязнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол (Номер-00682), описанный ниже, одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Университете Невады Рено и соответствует принципам Университета штата Невада, комитета по этическим исследованиям животных Рено. Короче говоря, мышей анестезировали изофлураном, а носовой конус использовался для поддержания непрерывного уровня изофлурана в течение 20 мин. Мазь ветеринара использовалась для предотвращения высыхания глаз под наркозом. Для определения уровня анестезии использовали уровень пальцев стопы, а во время процедуры измеряли интенсивность дыхания. Мышей держали в отдельных клетках и контролировали до тех пор, пока сознание не было восстановлено. Мыши использовались только один раз для кормления клещей и подвергались эвтаназии после восстановления клеща. Эвтаназия была проведена сотрудниками лаборатории лабораторной медицины. CO 2 и дислокация шейки матки использовались для эвтаназии животных.
ПРИМЕЧАНИЕ. Работа с клещами требует использования полного персонального защитного эквалайзераНАС ТРОЙКА. Для подсчета незрелых клещей, носить белые халаты, длинные нитриловые перчатки, чтобы покрыть рукав открытие лаборатории пальто с крышкой с резинками и закрытым носок обувь. Для паразитирующего мышея с клещами, используйте сетку для волос, одноразовые комбинезоны, с длинными рукавами, перчатки на рукава и охватывает ножной. Используйте белый или светлый цвета комбинезона для обнаружения своенравных тиков. Периодически проверяйте перчатки и рукав для клещей.
1. Подготовка номеров для содержания животных
- Назначьте отдельную комнату для домовых мышей, зараженных клещами. Поместите липкий коврик или двухсторонний ковер ленту снаружи и внутри двери для предотвращения случайного побега клеща.
2. Подсчет Кусачки для мыши зараженности
- Поместите двухстороннюю ленту вокруг верхних краев х 5" х 14" пластмассовой тары 7" и заполняют водой до приблизительно 2 см.
- Поместите еще один небольшой ящик или чашку Петри в центре контейнера и залить водой до 1 см создавая &# 34; ров»вокруг этого контейнера
- Храните флакон, содержащий личинки или нимфы в чашке Петри.
- Используйте тонкую кисть для удаления личинок или нимф из флакона и подсчета под микроскопом. Количество 50 личинок или 25 нимф в отдельные сцинтилляционные флаконы. Накройте чаши сразу с нейлоновой сеткой или органди экран ткани и близко с резинками.
3. Заполнять Мыши с незрелыми тиками
- Используйте белый или светло-окрашенный верстак и наклеить двухсторонний скотч по периметру рабочей зоны.
- Обезболить мышь с изофлураном. Проверьте уровень анестезии схождения крайнем случае. После того, как наркоз, передать мышь на грелку, покрытой бумажным полотенцем и приложите к конусообразной для продолжения изофлурановым питания.
- Применение вазелина на основе глазную мазь, чтобы избежать сухости. Обратите внимание на шаблон дыхания мыши, чтобы регулировать уровни изофлурана (80 -. 230 вдохов в мин нормально, Снижение уровня изофлурана, если ушСкорость выедания менее 80 вдохов в минуту, чтобы избежать убийства животного).
- Возьмите один флакон из 50 личинок или 25 нимф и поместите клещей под шерсть на голове между ушами с помощью кисти ( рис. 1 ). Держите мышь под анестезией в течение 20 минут после размещения, чтобы дать достаточно времени для прикрепления клещей.
- Переместите мышь в стандартную пластиковую коробку с одноразовой пластиковой коробкой для обуви с статическими крышками и белыми постельными принадлежностями. Обеспечьте игрушки, воду и пищу ad libitum в соответствии с нормальным уходом за мышью.
- Храните клетку для мыши внутри большей клетки крысы или песчанки, выложенной двухсторонней липкой лентой вокруг верхних краев. Заполните внешнюю клетку 3 см воды ( рис. 2 ).
4. Сбор мышей от мышей
- Незрелые клещи отделяются между 3 и 6 днями кормления. Проверяйте клетки и водный ров для насыщенных клещей каждый день после третьего дня.
- Соберите отдельные клещи из клетки между 4 и 6 днями. Используйте больКисть или мягкие щипцы для сбора насыпных клещей и хранения в чистых сцинтилляционных флаконах, увенчанных нейлоновой сетчатой тканью, закрепленной резинками.
- Анестезируйте и проверьте мышь на 7-й день для всех остальных прикрепленных клещей.
- Проверьте постельные принадлежности, кормушку и бутылку с водой для насыщенных клещей на 7-й день. Усыпейте мышей, следуя процедуре, описанной выше. Автоклавируйте одноразовые клетки, подстилку, бутылку с водой и кормушку для продуктов питания, чтобы избежать вылета с голодных клещей.
5. Хранение тиков ФРС
- Поддерживать насыщенные клещи при влажности 90%, 20 ° C и 12:12 светлого-темного цикла в инкубаторе с контролируемой влажностью и температурой до тех пор, пока не произойдет линька. Это может занять от 12 до 18 недель.
- В то время как высокая влажность способствует выживанию клещей, это также делает клещей, склонных к разрастанию грибков. Проверяйте подкожные клещи под микроскопом не реже одного раза в неделю для плесени. Если обнаружено, вымыть оставшихся в живых в 70% этанола для 5мин., промыть в воде, переносят в фильтровальную бумагу, чтобы высушить и перенести на новые, чистые флаконы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы модифицировали существующие протоколы Tick выращивания 6, 10 для улучшения эффективности кормления и снижение нагрузки на хосте мыши. Полученные результаты показывают, что стандартные садки коробки типа мышей хорошо подходят для клеща выращивания. Белое постельное белье обеспечивает хорошую контрастность для удобного сбора сытых клещей. Большинство клещей взобрались стенка контейнеров после кормления и были легко собрать. Кроме того, плотно установлена крышка из одноразовых пластиковых коробок (обычно используется для мышей жилья по УНР) предотвращало тик побег из коробки. Кроме того, мы не брить мышей для заражения клещи (рис 1). Эти изменения в опубликованных протоколах привели к значительному крепежного клеща, нагрубанию и выживанию.
Этот протокол является экономически эффективным, поскольку он не требует каких-либо специальных клеток мыши за пределами этих alreadY в использовании. Это также менее трудоемко, поскольку нам не приходилось каждый день собирать насыпные клещи. Мы собирали клещей между днями 4 и 6 после заражения. Большинство клещей отделяется к 4-му дню, а несколько оставшихся отделяются к 5-му дню. К седьмому дню все мыши были свободны от клещей. Мы смогли восстановить в среднем 67% (от 52 до 92%) заросших личиночных клещей ( табл. 1 ). Все мыши были здоровы и не проявляли никаких признаков дискомфорта.
Рисунок 1: Кормление личинок Ixodes scapularis на мышах. Мышам заражали 50 личиночных клещей. Захваченные клещи падали с мышей между днями 4 - 6. Клетки проверяли оставшиеся клещи на 7-й день и затем отбрасывали. A: Заражение мышей личиночными клещами. B: личиночный клещ прикрепляется к уху мыши. C:Насыщенный личиночный тик, прикрепленный к уху мыши, через 3 дня после заражения. D: Необработанные и полностью насыщенные клещи личинки.
Рисунок 2: Мышиная клетка для заражения клещей. Две одноразовые клетки для мышей содержались внутри клетки песчанки. Приблизительно 3 см. Вода была добавлена в клетку песчанки, чтобы сделать ров. Двусторонняя липкая лента ковра была прикреплена вокруг верхних краев клетки песчанки, чтобы избежать выхода клещей.
| Животное (мышь) | Общее количество восстановленных клеточных личинок | Процент личинок в процентах восстановлен |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| В СРЕДНЕМ | 66,8% |
Таблица 1: Количество наливается черноногим клещ Личинки Оправившись после Laboratory зараженности на Хостах Анастезированной мыши. Каждая мышь была заражена 50 личинок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Важно иметь несколько уровней мер безопасности при выращивании клещей, чтобы избежать случайного выхода. Использование липкой ленты и водяного рва имеет решающее значение для обеспечения безопасности. Важно держать анестезированную мышь на грелке, чтобы поддерживать постоянную температуру тела. Мы также обнаружили, что бритье мыши не дает никаких дополнительных преимуществ при прикреплении клещей. Отдельную мышь можно держать в одной клетке в течение одной недели в обозначенном «тике», что дополнительно ограничивает контакт клещей с персоналом.
Модификации и устранение неполадок
Производство высококачественных лабораторных клещей необходимо для изучения биологии клещей и клещевого патогенного взаимодействия. Предыдущие протоколы кормления использовали подвесной пол 8 или цилиндрические клетки, чтобы держать мышей неподвижными 6 , 10 , который повлечет за собой дополнительные расходы, а также стресс для животного. Кроме того, клетки суспендируют проволоки позволяет напитавшихся тиков падать через проволоку в воду загрязненной с мочой и калом мыши, таким образом, увеличивая риск роста плесени.
Ограничения техники
Как показано в данных, мы успешно восстановлены в среднем на 65% (до 92%) тиков. Иногда мы нашли тиков в воде рва вне клетки мыши, но ни один не спасся. Липкая лента на наружных стенках второго контейнера предотвратить клещ от побега.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативные методы
Наш протокол использования обуви в стиле коробки одноразовой мышей клетки позволяет свободный диапазон движения и показывает, что мышь не должна быть сдержанным, чтобы обеспечить подачу клеща. Большинство кормили клещ легко видеть и собраны из прозрачных стенок клетки и любые оставшиеся клещи легкообнаружено среди постельного белья в конце цикла кормления. Этот протокол не требует какой-либо клетки пользовательской мыши, таким образом, она является экономически эффективным.
Литература показывает, что менее 50% от клещей прикрепить к мыши, а не все подключенные к нему клещи питаются до завершения. В среднем, мы собрали 60% ~ наливается личиночные тики. Мы не нашли какие-либо бежали голодные или кормили тики. Иногда мы нашли одну или две наливаются личиночные тиков в воде рве, но ни на липкой ленте. Наши результаты свидетельствуют о том, что не все клещи прикрепляются к хозяину и могут умереть без кормления. Голодные, мертвые клещи были трудно найти в помете. Иногда мы также обнаружили пятна крови на белом подстилки, который наводит на мысль, что либо мышь убили наливается клеща после прерывают или соскребают. Наши данные и ежедневные наблюдения клеток свидетельствуют о том, что супернакачка клещей либо двигаться вверх на стенках клетки и верхняя часть клетки или спрятаться под подстилкой от досягаемости мыши. Таким образом, прилагаемая клетка не имеету негативное влияние на выживаемость клеща.
Будущие применения или направления освоив эту технику
Наш протокол обеспечивает упрощенную альтернативу для массового разведения клещей без добавления дополнительных расходов или снижения уровня безопасности персонала обработки животных. Будущие эксперименты будут сосредоточены на совершенствовании методов кормления взрослых I. scapularis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
