Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Summary

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Abstract

Um programa de regeneração endógena é iniciada por Müller glia no peixe-zebra adulto (Danio rerio) retina seguintes danos e morte neuronal. As Müller glia re-entrar no ciclo celular e produzir células progenitoras neuronais que são submetidos a ciclos subsequentes de divisões celulares e diferenciar em tipos de células neuronais perdidas. Ambos Müller glia e células progenitoras neuronais núcleos replicar o seu ADN e sofrem mitose em locais distintos da retina, ou seja, elas migram entre o basal camada interna Nuclear (INL) e a camada exterior Nuclear (ONL), respectivamente, em um processo descrito como Interkinetic Migração nuclear (INM). INM foi predominantemente estudados na retina em desenvolvimento. Para examinar a dinâmica do INM no adulto regenerar retina zebrafish em detalhe, processamento de imagem de células vivas de células fluorescentes marcado Müller glia / neuronais progenitoras é necessária. Aqui, nós fornecemos as condições para isolar e retinas cultura dorsaisde Tg [GFAP: nGFP] ^mi2004 peixe-zebra que foram expostos à luz intensa constante por 35 h. Também mostram que estas culturas de retina são viáveis para efectuar experiências de imagiologia ao vivo de células, a aquisição de imagens continuamente Z-pilha, através da espessura do explante da retina por até 8 h, usando microscopia multifotônica para monitorar o comportamento migratório das GFAP: células -positivas nGFP . Além disso, descrevemos os detalhes para realizar a análise pós-imagem para determinar a velocidade do INM apical e basal. Para resumir, nós estabelecemos condições para o estudo da dinâmica do INM em um modelo adulto da regeneração neuronal. Isto irá avançar nossa compreensão deste processo celular crucial e nos permitem determinar os mecanismos que controlam INM.

Introduction

Ao contrário dos humanos, peixe-zebra (Danio rerio) apresentam uma resposta regeneração robusta sobre a morte celular dos neurônios da retina ^{1, 2, 3, 4.} Factor de necrose tumoral α, uma molécula de sinalização que é libertado a partir de morrer neurónios retinais induz Müller glia residente no basal camada interna Nuclear (INL) da retina, a proliferar ⁵ e produzir células progenitoras neuronais que continuam a proliferar antes de se diferenciar em a célula neuronal tipos que morreram ^{2, 3, 4.} Durante a fase proliferativa da resposta de regeneração, os núcleos de células da glia Müller e suas células progenitoras neuronais provenientes passam por um padrão repetitivo migratório em fase com o ciclo celular (migração nuclear Interkinetic, INM) ⁶ </sup ^{>, 7.} Núcleos posicionado no INL basal replicar o seu DNA antes de migrar para a camada exterior Nuclear (ONL), onde se dividem antes de retornar os núcleos resultantes basalmente para o INL. Este processo foi descrito pela primeira vez durante o desenvolvimento neuroepithelial usando métodos histológicos, enquanto abordagens de imagens ao vivo de células mais tarde confirmado a interpretação por Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Ambas as abordagens de imagem histoquímicos e em células vivas, foram usadas para determinar os mecanismos subjacentes INM e a sua função no desenvolvimento neuroepithelia incluindo a retina ^{9, 11, 12, 13.} No entanto, os mecanismos que regem INM no adulto regenerar retina não foram estudadas em grande detalhexref "> ^{6, 7.} imagens ao vivo de células será uma abordagem de valor inestimável para avançar o nosso conhecimento sobre as vias de sinalização que controlam o INM na retina regenerar adulto.

Até recentemente, a criação de imagens de células vivas de INM na retina foi limitada a qualquer embriões de peixe-zebra ao vivo ou para pinto embrionário ou o rato pós-natal explantes de retina ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} Enquanto explantes de retina de animais adultos de uma variedade de espécies, incluindo ratinhos, ratos e peixes-zebra foram utilizadas para diferentes células abordagens biológicas ^{17, 18, 19, 20,} experimentos com imagens em células vivas a partir de explantes de retina have sido restrita a breves períodos de tempo e não foram executadas de forma contínua ao longo de várias horas ^{21, 22.} Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura adultos retinas de peixe-zebra danificado de luz para realizar experimentos com imagens em células vivas, monitoramento INM usando microscopia multi-fotão ^6. Abordagens de imagem de células vivas são vantajosos em relação aos métodos de imuno-histoquímica ao investigar os mecanismos que controlam INM, como a dinâmica do INM, por exemplo, as velocidades podem ser afetadas em vez de a localização da mitose, o que não seria potencialmente ser detectada usando imunocitoquímica.

No futuro, este método tem também o potencial de ser modificado para estudar outros processos dinâmicos durante a regeneração da retina, tais como fagocitose de morrer fotorreceptores por Muller glia ou o comportamento da microglia.

Protocol

Nota: Os peixes-zebra foram criados e mantidos na instalação de Notre Dame Zebrafish na Freimann Life Sciences Center. Os métodos descritos neste manuscrito são aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e estão em conformidade com a instrução para o uso de animais em pesquisa visão pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia. 1. Soluções Preparar 70% de etanol para esterilizar o capuz de cultura de tecidos e qualquer equipamento / …

Representative Results

O isolamento da retina de acordo com o procedimento delineado no esquema na Figura 1 permite a cultura de uma retina dorsal achatada de luz-danificado adulto Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra ao longo de um período de pelo menos 24 horas numa atmosfera de 5% de CO 2 ambiente / ar. Estes explantes de retina montados plana pode ser usado para planos focais imagem em níveis tecidos profundos. Um exemplo é Müller glia / núcleos neuronais …

Discussion

Estudos investigando os mecanismos que regem a regeneração do adulto danificado retina zebrafish métodos utilizados predominantemente imunocitoquímicos ^{5, 25, 26, 27, 28, 29, 30.} Estabelecer condições para a cultura de explantes de retina e para realizar processamento de imagem de cé…

Materials

Dumont forceps size #5	World precision instruments	14098
Dumont forceps size #5, 45° angle	World precision instruments	14101
McPherson-Vannas scissors	World precision instruments	501233
Fluordishes	World precision instruments	FD35-100
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-1B	similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2	Labconco		equivalent type will work
tissue culture incubator	Thermoscientific	HEPA-class 100	equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter	VWR	4192
10 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309604
60 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309653
NaHCO3	FischerScientific	S233-500
CaCl2	ThermoScientific	C79-500
MgCl2	EMD Millipore	5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	5100-038
Horse serum, heat-inactivated	ThermoScientific	26050-070
penicillin/streptomycin	VWR	16777-164
Ultrapure low melting point agarose	ThermoScientific	16520-100
ethanol, absolute	ThermoScientific	BP2818-4
2-phenoxyethanol	Sigma	77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive	VWR	354240
refractive index liquid	Cargille Lab	1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser	Nikon		equivalent system will work
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes	Okolab		equivalent system will work
NIS analysis software	Nikon