Summary

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Abstract

Um programa de regeneração endógena é iniciada por Müller glia no peixe-zebra adulto (Danio rerio) retina seguintes danos e morte neuronal. As Müller glia re-entrar no ciclo celular e produzir células progenitoras neuronais que são submetidos a ciclos subsequentes de divisões celulares e diferenciar em tipos de células neuronais perdidas. Ambos Müller glia e células progenitoras neuronais núcleos replicar o seu ADN e sofrem mitose em locais distintos da retina, ou seja, elas migram entre o basal camada interna Nuclear (INL) e a camada exterior Nuclear (ONL), respectivamente, em um processo descrito como Interkinetic Migração nuclear (INM). INM foi predominantemente estudados na retina em desenvolvimento. Para examinar a dinâmica do INM no adulto regenerar retina zebrafish em detalhe, processamento de imagem de células vivas de células fluorescentes marcado Müller glia / neuronais progenitoras é necessária. Aqui, nós fornecemos as condições para isolar e retinas cultura dorsaisde Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra que foram expostos à luz intensa constante por 35 h. Também mostram que estas culturas de retina são viáveis para efectuar experiências de imagiologia ao vivo de células, a aquisição de imagens continuamente Z-pilha, através da espessura do explante da retina por até 8 h, usando microscopia multifotônica para monitorar o comportamento migratório das GFAP: células -positivas nGFP . Além disso, descrevemos os detalhes para realizar a análise pós-imagem para determinar a velocidade do INM apical e basal. Para resumir, nós estabelecemos condições para o estudo da dinâmica do INM em um modelo adulto da regeneração neuronal. Isto irá avançar nossa compreensão deste processo celular crucial e nos permitem determinar os mecanismos que controlam INM.

Introduction

Ao contrário dos humanos, peixe-zebra (Danio rerio) apresentam uma resposta regeneração robusta sobre a morte celular dos neurônios da retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrose tumoral α, uma molécula de sinalização que é libertado a partir de morrer neurónios retinais induz Müller glia residente no basal camada interna Nuclear (INL) da retina, a proliferar 5 e produzir células progenitoras neuronais que continuam a proliferar antes de se diferenciar em a célula neuronal tipos que morreram 2, 3, 4. Durante a fase proliferativa da resposta de regeneração, os núcleos de células da glia Müller e suas células progenitoras neuronais provenientes passam por um padrão repetitivo migratório em fase com o ciclo celular (migração nuclear Interkinetic, INM) 6 </sup >, 7. Núcleos posicionado no INL basal replicar o seu DNA antes de migrar para a camada exterior Nuclear (ONL), onde se dividem antes de retornar os núcleos resultantes basalmente para o INL. Este processo foi descrito pela primeira vez durante o desenvolvimento neuroepithelial usando métodos histológicos, enquanto abordagens de imagens ao vivo de células mais tarde confirmado a interpretação por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambas as abordagens de imagem histoquímicos e em células vivas, foram usadas para determinar os mecanismos subjacentes INM e a sua função no desenvolvimento neuroepithelia incluindo a retina 9, 11, 12, 13. No entanto, os mecanismos que regem INM no adulto regenerar retina não foram estudadas em grande detalhexref "> 6, 7. imagens ao vivo de células será uma abordagem de valor inestimável para avançar o nosso conhecimento sobre as vias de sinalização que controlam o INM na retina regenerar adulto.

Até recentemente, a criação de imagens de células vivas de INM na retina foi limitada a qualquer embriões de peixe-zebra ao vivo ou para pinto embrionário ou o rato pós-natal explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Enquanto explantes de retina de animais adultos de uma variedade de espécies, incluindo ratinhos, ratos e peixes-zebra foram utilizadas para diferentes células abordagens biológicas 17, 18, 19, 20, experimentos com imagens em células vivas a partir de explantes de retina have sido restrita a breves períodos de tempo e não foram executadas de forma contínua ao longo de várias horas 21, 22. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura adultos retinas de peixe-zebra danificado de luz para realizar experimentos com imagens em células vivas, monitoramento INM usando microscopia multi-fotão 6. Abordagens de imagem de células vivas são vantajosos em relação aos métodos de imuno-histoquímica ao investigar os mecanismos que controlam INM, como a dinâmica do INM, por exemplo, as velocidades podem ser afetadas em vez de a localização da mitose, o que não seria potencialmente ser detectada usando imunocitoquímica.

No futuro, este método tem também o potencial de ser modificado para estudar outros processos dinâmicos durante a regeneração da retina, tais como fagocitose de morrer fotorreceptores por Muller glia ou o comportamento da microglia.

Protocol

Nota: Os peixes-zebra foram criados e mantidos na instalação de Notre Dame Zebrafish na Freimann Life Sciences Center. Os métodos descritos neste manuscrito são aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e estão em conformidade com a instrução para o uso de animais em pesquisa visão pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia. 1. Soluções Preparar 70% de etanol para esterilizar o capuz de cultura de tecidos e qualquer equipamento / …

Representative Results

O isolamento da retina de acordo com o procedimento delineado no esquema na Figura 1 permite a cultura de uma retina dorsal achatada de luz-danificado adulto Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra ao longo de um período de pelo menos 24 horas numa atmosfera de 5% de CO 2 ambiente / ar. Estes explantes de retina montados plana pode ser usado para planos focais imagem em níveis tecidos profundos. Um exemplo é Müller glia / núcleos neuronais …

Discussion

Estudos investigando os mecanismos que regem a regeneração do adulto danificado retina zebrafish métodos utilizados predominantemente imunocitoquímicos 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Estabelecer condições para a cultura de explantes de retina e para realizar processamento de imagem de cé…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o apoio fornecido por William Archer e do Mecanismo de Notre Dame Integrado Imaging. Agradecimentos especiais são direcionados para os técnicos Freimann Ciências Biológicas por sua ajuda contínua e seus cuidados e criação de peixe-zebra. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Eye Institute dos NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) eo Centro de Zebrafish Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.

Materials

Dumont forceps size #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps size #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 ml Luer-lok syringe VWR BD309604
60 ml Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O’Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging–historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

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Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

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