Sebrafisk retinal regenerasjon har for det meste blitt undersøkt ved hjelp av faste netthinner. Men dynamiske prosesser som interkinetic atom migrasjon oppstår under regenerativ respons og krever levende celle bildebehandling for å undersøke de underliggende mekanismene. Her beskriver vi kultur og bilde forhold til å overvåke Interkinetic Nuclear Migration (INM) i sanntid ved hjelp multiphoton mikroskopi.
En endogen regenerering Programmet er initiert av Müller gliaceller i den voksne sebrafisk (Danio rerio) hinnen etter neuronal skade og død. De Müller gliaceller re-gå inn i cellesyklus og produsere nevrale stamceller som gjennomgår påfølgende runder av celledelinger og differensiere inn de tapte nevronale celletyper. Både Müller gliaceller og nevronale stamfar cellekjerner kopiere deres DNA og gjennomgå mitose i forskjellige steder i netthinnen, dvs. de vandrer mellom basal Indre Nuclear Layer (INL) og Ytre Nuclear Layer (onl), henholdsvis i en prosess beskrevet som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM har hovedsakelig blitt studert i utviklingshinnen. For å undersøke dynamikken i INM i den voksne regenererende sebrafisk netthinnen i detalj, er levende celle avbildning av fluoresceinmerkede Müller gliaceller / nevrale stamceller nødvendig. Her gir vi betingelsene for å isolere og kultur rygg netthinnefra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 sebrafisk som ble utsatt for konstant intens lys for 35 timer. Vi viser også at disse retina kulturer er levedyktig for å utføre levende celle bildebehandling eksperimenter, kontinuerlig å anskaffe z-stack-bilder i hele tykkelsen av retinal eksplantat i opptil 8 timer under anvendelse av multiphoton mikroskopi for å overvåke vandringsadferd av GFAP: nGFP-positive celler . I tillegg beskriver vi detaljene til å utføre post-bildeanalyse for å bestemme hastigheten av apikale og basal INM. For å oppsummere, etablerte vi forutsetninger for å studere dynamikken i INM i en voksen modell av neuronal regenerering. Dette vil fremme vår forståelse av denne viktige cellulære prosessen og tillate oss å bestemme hvilke mekanismer som styrer INM.
I motsetning til mennesker, sebrafisk (Danio rerio) viser en robust regenerering svar på celledød av netthinnens nerveceller 1, 2, 3, 4. Tumornekrosefaktor α, et signalmolekyl som frigjøres fra å dø netthinnens nerveceller induserer Müller gliaceller bosatt i basal Indre Nuclear Layer (INL) av netthinnen, for å spre fem og produsere nevrale stamceller som fortsetter å spre seg før differensiere inn i nevronale celle typer som døde 2, 3, 4. Under den proliferative fase av regenereringen respons, kjerner av Müller gliaceller og deres avledet neuronal forløperceller gjennomgå et repeterende mønster trekkende i fase med cellesyklusen (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 </sup > 7. Kjerner plassert i basal INL kopiere deres DNA før migrere til ytre Nuclear Layer (onl) hvor de deler før de oppstår atomkjerner tilbake basalt til INL. Denne fremgangsmåten ble først beskrevet under neuroepithelial utvikling ved hjelp av histologiske metoder, mens levende celle bildedannende fremgangsmåter senere bekreftet tolkningen av Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Både histokjemiske og lever-cellebilde tilnærminger er blitt benyttet for å bestemme mekanismene bak INM og dens funksjon i å utvikle neuroepithelia herunder netthinnen 9, 11, 12, 13. Imidlertid har de mekanismene som styrer INM i voksen regenererende hinnen ikke blitt undersøkt i mye detaljxref "> 6, 7. Lev-cell imaging vil være en uvurderlig måte å fremme vår kunnskap om signalveier som styrer INM i voksen regenererende hinnen.
Inntil nylig var levende celle avbildning av INM i netthinnen begrenset til enten levende sebrafisk embryo eller foster dama eller postnatal mus retinal explants 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mens retinal explants fra voksne dyr av ulike arter, inkludert mus, rotte og sebrafisk har blitt utnyttet for annen celle biologiske tilnærminger 17, 18, 19, 20, live-cell imaging eksperimenter med retinal eksplanter hahar vært begrenset til korte perioder av gangen, og har ikke blitt utført kontinuerlig over flere timer 21, 22. Her beskriver vi en detaljert protokoll til kultur lys-skadet voksne sebrafisk netthinner å opptre live-celle bildebehandling eksperimenter overvåking INM ved hjelp av multi-foton mikroskopi 6. Levende celler bilde tilnærminger er fordelaktig i forhold immunhistokjemiske metoder når undersøke hvilke mekanismer som styrer INM, som dynamikken i INM, f.eks hastigheter kan bli påvirket snarere enn plasseringen av mitose, som ville potensielt ikke oppdages ved hjelp immunocytochemistry.
I fremtiden, har denne fremgangsmåte også potensiale til å bli modifisert for å studere andre dynamiske prosesser i løpet av retinal regenerasjon, slik som fagocytose av døende fotoreseptorene hos Müller gliaceller eller oppførselen til mikroglia.
Studier som undersøker de mekanismene som styrer regenerering av skadet voksen sebrafisk netthinnen hovedsakelig brukte immunocytokjemiske metoder 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Etablering forhold til kultur retinal explants og å opptre live-cell imaging på fenomener som INM, gi oss en tekni…
The authors have nothing to disclose.
Vi setter pris på støtten fra William Archer og Notre Dame Integrated Imaging Facility. Spesiell takk rettes til Freimann Life Sciences teknikere for deres kontinuerlig hjelp og deres omsorg og dyrehold av sebrafisk. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Eye Institute of NIH til DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) og Senter for Sebrafisk Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.
Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
NIS analysis software | Nikon |