Zebrafisk retinal regenerering er for det meste blevet undersøgt ved hjælp af faste nethinder. Imidlertid dynamiske processer såsom interkinetic nuklear migration forekomme under den regenerative respons og kræver live-cell imaging at undersøge de underliggende mekanismer. Her beskriver vi kultur og billedbehandling betingelser for at overvåge Interkinetic Nuclear Migration (INM) i realtid ved hjælp multifoton mikroskopi.
Et endogene regenerering program er initieret af Müller glia i den voksne zebrafisk (Danio rerio) nethinden efter neuronal beskadigelse og død. Müller glia genindtræde i cellecyklus og producere neuronale stamceller, der undergår efterfølgende runder af celledelinger og differentiere til de tabte neuronale celletyper. Både Müller glia og neuronal progenitor cellekerner replikere deres DNA og undergår mitose i forskellige steder i nethinden, dvs. de vandrer mellem den basale Inner Nuclear Layer (INL) og den ydre kernelag (ONL) henholdsvis i en fremgangsmåde beskrevet som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM er overvejende blevet undersøgt i udviklingslandene nethinden. For at undersøge dynamikken i INM i den voksne regenerere zebrafisk nethinden i detaljer, er live-cell imaging af fluorescensmærkede Müller glia / neuronale progenitorceller påkrævet. Her giver vi betingelserne for at isolere og kultur dorsale nethinderfra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk, der blev udsat for konstant intense lys for 35 timer. Vi viser også, at disse retina kulturer er rentabelt at udføre levende celle billeddannelse eksperimenter, løbende erhverve z-stak billeder i hele tykkelsen af nethinden eksplantatet i op til 8 timer ved hjælp multifoton mikroskopi til at overvåge vandrende adfærd GFAP: nGFP -positive celler . Derudover beskriver vi detaljerne til at udføre post-imaging-analyse for at bestemme hastigheden af apikale og basale INM. For at opsummere, vi etableret betingelser for at studere dynamikken i INM i en voksen model af neuronal regenerering. Dette vil fremme vores forståelse af denne vigtige cellulære proces og give os mulighed for at bestemme de mekanismer, der styrer INM.
I modsætning til mennesker, zebrafisk (Danio rerio) udviser en robust regenerering respons ved celledød af retinale neuroner 1, 2, 3, 4. Tumornekrosefaktor α, et signalmolekyle, der frigives fra døende retinale neuroner inducerer Müller glia bosiddende i den basale Inner Nuclear Layer (INL) af nethinden, at proliferere 5 og producere neuronale progenitorceller, der fortsat proliferere før differentiere til neuroncellen typer, der døde 2, 3, 4. Under den proliferative fase af regenereringen respons, kernerne i Müller glia og afledte neuronale progenitorceller undergår en gentagen trækmønster i fase med cellecyklussen (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 </sup > 7. Kerner placeret i den basale INL replikere deres DNA før overgangen til den ydre Nuclear Layer (ONL), hvor de deler før der opstår kerner tilbage basalt til INL. Denne fremgangsmåde blev først beskrevet under neuroepitel udvikling ved hjælp histologiske fremgangsmåder, mens live-cell billedteknik senere bekræftet fortolkningen af Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Både histokemiske og live-cell imaging fremgangsmåder er blevet anvendt til at bestemme mekanismerne bag INM og dens funktion i udviklingen neuroepithelia herunder nethinden 9, 11, 12, 13. Imidlertid har de mekanismer, der styrer INM i den voksne regenerere nethinden ikke undersøgt i mange detaljerxref "> 6, 7. live-cell imaging vil være en uvurderlig tilgang til fremme vores viden om de signalveje, der styrer INM i den voksne regenerere nethinden.
Indtil for nylig var live-cell imaging af INM i nethinden begrænset til enten levende zebrafisk embryoner eller embryonale kylling eller postnatal mus retinale eksplantater 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mens retinale eksplantater fra voksne dyr af forskellige arter, herunder mus, rotter og zebrafisk har været brugt i forskellige celle biologiske metoder 17, 18, 19, 20, live-celle eksperimenter imaging hjælp retinale eksplantater have blevet begrænset til korte perioder, og er ikke blevet gennemført kontinuerligt over flere timer 21, 22. Her beskriver vi en detaljeret protokol til kultur lys-beskadigede voksne zebrafisk nethinder at optræde live-cell imaging eksperimenter overvågning INM ved hjælp af multi-foton mikroskopi 6. Live-cell imaging tilgange er fordelagtige i forhold immunhistokemiske metoder, når undersøger de mekanismer, der styrer INM, da dynamikken i INM, fx hastigheder kan være påvirket i stedet for placeringen af mitose, hvilket ville potentielt ikke påvises ved anvendelse immuncytokemi.
I fremtiden, denne metode har også potentiale til at blive modificeret til at studere andre dynamiske processer i retinal regenerering, såsom fagocytose af døende fotoreceptorer af Müller glia eller adfærd mikroglia.
Undersøgelser undersøger de mekanismer for regenerering af beskadigede voksne zebrafisk nethinden overvejende brugte immuncytokemiske metoder 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Etablering betingelser til kultur retinale eksplantater og til at udføre live-cell imaging på fænomener, såsom INM, …
The authors have nothing to disclose.
Vi sætter pris på den støtte, som William Archer og Notre Dame Integrated Imaging Facility. En særlig tak rettes til Freimann Life Sciences teknikere for deres fortsatte hjælp og deres pleje og opdræt af zebrafisk. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Eye Institute of NIH til DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) og Center for zebrafisk Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.
Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
NIS analysis software | Nikon |