Summary

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Published: February 24, 2017
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Summary

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Abstract

Un programa de regeneración endógena es iniciada por las células de Müller en el pez cebra adulto (Danio rerio) retina después del daño neuronal y la muerte. Las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular y producen células progenitoras neuronales que se someten a las siguientes rondas de división celular y se diferencian en los tipos de células neuronales perdidos. Tanto las células de Müller y de células progenitoras neuronal núcleos replican su DNA y se someten a la mitosis en lugares distintos de la retina, es decir, que migran entre el basal capa interior Nuclear (INL) y la capa exterior Nuclear (ONL), respectivamente, en un proceso descrito como interkinetic La migración nuclear (INM). INM predominantemente se ha estudiado en la retina en desarrollo. Para examinar la dinámica del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra en detalle, se requiere imágenes de células vivas de las células marcadas con fluorescencia las células de Müller / progenitoras neuronales. Aquí, proporcionamos las condiciones para aislar y retinas cultura dorsalesde Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 que fueron expuestos a una luz intensa constante durante 35 h. También se muestra que estos cultivos de retina son viables para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas, la adquisición de imágenes de forma continua z-stack en todo el espesor de la retina explante para un máximo de 8 h utilizando microscopía multifotónica para monitorear el comportamiento migratorio de GFA: células positivas nGFP . Además, se describen los detalles para realizar el análisis posterior a la proyección de imagen para determinar la velocidad del INM apical y basal. En resumen, hemos establecido las condiciones para estudiar la dinámica del INM en un modelo adulto de la regeneración neuronal. Esto hará avanzar nuestra comprensión de este proceso celular crucial y nos permitirá determinar los mecanismos que controlan el INM.

Introduction

A diferencia de los seres humanos, el pez cebra (Danio rerio) exhiben una robusta respuesta de regeneración después de la muerte celular de neuronas de la retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrosis tumoral α, una molécula de señalización que se libera de la muerte las neuronas de la retina induce las células de Müller residente en el basal capa interior Nuclear (INL) de la retina, a proliferar 5 y producir células progenitoras neuronales que siguen proliferando antes de la diferenciación en la célula neuronal tipos que murieron 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa de la respuesta de la regeneración, los núcleos de las células de Müller y sus células progenitoras neuronales derivadas se someten a un patrón migratorio repetitivo en fase con el ciclo celular (interkinetic migración Nuclear, INM) 6 </sup > 7. Los núcleos posicionado en la INL basal replicar su ADN antes de migrar a la capa exterior Nuclear (ONL) donde se dividen antes de que surjan los núcleos vuelven basalmente a la INL. Este proceso fue descrito por primera vez durante el desarrollo neuroepitelial utilizando métodos histológicos, mientras que los enfoques de formación de imágenes de células vivas después confirmaron la interpretación por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambos enfoques de imagen histoquímicos y de células vivas se han utilizado para determinar los mecanismos INM y su función en el desarrollo de la retina incluyendo neuroepithelia 9, 11, 12, 13 subyacentes. Sin embargo, los mecanismos que regulan INM en el adulto regeneración de retina no han sido estudiados en mayor detallexref "> 6, 7. Células vivas imágenes será una forma muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las vías de señalización que controlan el INM en la retina adulta regeneración.

Hasta hace poco tiempo, imágenes de células vivas del INM en la retina se limita a cualquiera de embriones de pez cebra en vivo o embriones de pollo o postnatal ratón explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mientras que los explantes de retina de animales adultos de una variedad de especies, incluyendo ratones, ratas y pez cebra han sido utilizados para diferentes enfoques biológicos celular 17, 18, 19, 20, experimentos de imágenes de células vivas utilizando explantes de retina jahan estado restringidos a breves períodos de tiempo y no han sido ejecutados de forma continua durante varias horas 21, 22. A continuación, describimos un protocolo detallado para la cultura retinas de pez cebra adultos de luz dañadas para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas monitoreo INM usando microscopía multifotónica 6. Enfoques imágenes de células vivas son ventajosas respecto a los métodos inmunohistoquímicos en la investigación de los mecanismos que controlan el INM, como la dinámica del INM, por ejemplo, las velocidades pueden verse afectados en lugar de la ubicación de la mitosis, lo que potencialmente no ser detectado mediante inmunocitoquímica.

En el futuro, este método tiene también el potencial de ser modificado para estudiar otros procesos dinámicos durante la regeneración de la retina, tales como fagocitosis de morir fotorreceptores por las células de Müller o el comportamiento de microglia.

Protocol

Nota: El pez cebra fueron criados y mantenidos en las instalaciones de Notre Dame de pez cebra en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito son aprobados por la Universidad de Notre Dame Cuidado de Animales y el empleo Comisión y están en conformidad con la declaración para el uso de animales en investigación de la visión por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología. 1. Soluciones Preparar 70% de etanol para e…

Representative Results

El aislamiento de la retina de acuerdo con el procedimiento descrito en el esquema de la Figura 1 permite que el cultivo de una retina dorsal aplanado de adulto-luz dañado Tg [GFAP: nGFP] mi2004 pez cebra durante un período de al menos 24 h en un 5% de CO 2 / ambiente de aire. Estos explantes de retina montados en plano-se pueden utilizar para planos focales de imagen a nivel de tejidos profundos. Un ejemplo es las células de Müller / n…

Discussion

Los estudios que investigan los mecanismos que regulan la regeneración de la retina del pez cebra adulto dañado fundamentalmente métodos usados inmuno 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El establecimiento de las condiciones de cultivo de explantes de retina a y para realizar imágenes de célula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo proporcionado por William Archer y el Servicio Integrado de Notre Dame de imagen. Gracias especiales se dirigen a los técnicos Freimann Ciencias de la Vida por su continua ayuda y su cuidado y la cría del pez cebra. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de los NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) y el Centro de Investigación de pez cebra, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN.

Materials

Dumont forceps size #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps size #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 ml Luer-lok syringe VWR BD309604
60 ml Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

References

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Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

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