Summary
Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.
Abstract
De immuun SYNAPS is het gebied van communicatie tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen (APCs). T-cellen polariseren oppervlakte receptoren en eiwitten naar de immuun SYNAPS signaal uitwisseling te verzekeren van een stabiele binding. Klassieke confocal, TIRF of Super resolutie microscopie zijn gebruikt om het bestuderen van de immuun synaps. Aangezien deze methoden handmatige Beeldacquisitie en tijdrovende kwantificering vereisen, is de beeldvorming van zeldzame gebeurtenissen uitdagend. Hier beschrijven we een workflow waarmee de morfologische analyse van tientallen duizenden cellen. Immuun synapsen veroorzaakt tussen primaire menselijke T-cellen in pan-leukocyte preparaten en Staphylococcus aureus enterotoxine B SEB-geladen Raji cellen als APCs. Beeldacquisitie wordt uitgevoerd met imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie, die eigenschappen van de cytometer van een stroom en een fluorescentie Microscoop combineert. Een complete gating strategie voor de identificatie van T-cel/APC paren en analyseren van de immuun synapsen wordt verstrekt. Als deze werkstroom kan de analyse van immune synapses in ongezuiverde pan-leukocyte preparaten en vandaar vereist slechts een kleine hoeveelheid bloed (dat wil zeggen, 1 mL), het kan worden toegepast op monsters van patiënten. Nog belangrijker is, kunnen verschillende monsters worden voorbereid, gemeten en geanalyseerd in parallel.
Introduction
T-cellen zijn grote regulatoren van het adaptieve immuunsysteem en worden geactiveerd door middel van antigene peptiden die worden gepresenteerd in het kader van grote comptabiliteit complexen (MHC). Volledige T-cel activatie vereist twee signalen, de bevoegdheid signaal via de antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) / CD3 complex en het costimulatory signaal via accessoire receptoren. Beide signalen worden gegenereerd door de directe interactie van T cellen met antigeen-presenteren cellen (APCs). Volwassen APCs geven het signaal van de bevoegdheid voor T-cel activatie door MHC-peptide complexen, en zij uiten costimulatory liganden (bijvoorbeeld, CD80 of CD86) om te verzekeren van de progressie van T-cel activatie1. Een belangrijke functie van costimulatie is de omlegging van de actine cytoskelet2,3,4. De corticale F-actine is tamelijk statisch in de rust van T-cellen. T-cel stimulatie door antigeen-bevattende APCs leidt tot een ingrijpende herinrichting van het cytoskelet actine. Actin dynamics (dwz, snel actine polymerisatie/depolymerization cirkels) kunnen de T-cellen maken van troepen die worden gebruikt voor het vervoer van proteïnen of organellen, bijvoorbeeld. Het cytoskelet actine is bovendien belangrijk voor de ontwikkeling van een speciale contact zone tussen T-cellen en APCs, genaamd de immuun synaps. Vanwege het belang van het cytoskelet van de actine aan de immuun SYNAPS, het essentieel geworden methoden kwantificeren van veranderingen in het actine cytoskelet van T cellen5,6,7,8 te ontwikkelen , 9.
Door middel van actine cytoskeletal hulp, worden oppervlakte receptoren en signalering eiwitten gescheiden in supramoleculaire activering clusters (SMACs) binnen de immuun synaps. De stabiliteit van de immuun SYNAPS wordt verzekerd door de binding van de receptoren naar F-actine bundels, waardoor de elasticiteit van het cytoskelet van actine. Immuun synapse formatie is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor de generatie van de adaptive immuunrespons. De nadelige gevolgen van een defecte immuun synapse formatie in vivo werden voor het eerst besefte bij patiënten met van Wiskott Aldrich syndroom (WAS), een ziekte in de polymerisatie van welke actine en, gelijktijdig, immuun synapse formatie worden verstoord10 . WAS patiënten kunnen lijden aan eczeem, ernstige recidiverende infecties, auto-immune ziekten en melanomen. Ondanks deze bevinding, is het op dit moment niet bekend of immuun synapse formatie verschilt in de T-cellen van gezonde individuen en patiënten met een immuun afwijkingen of auto-immune ziekten.
Fluorescentie microscopie, confocal waaronder, TIRF en super resolutie microscopie, werden gebruikt om te ontdekken de architectuur van de immuun synapse11,12,13,14. De hoge resolutie van deze systemen en de mogelijkheid om live-cel imaging kunnen de collectie van exacte, spatio-temporele informatie over het cytoskelet actine en oppervlakte of intracellulaire eiwitten in de immuun synaps. Veel resultaten worden gevonden, zijn echter gebaseerd op de analyse van slechts enkele tientallen T-cellen. Bovendien moeten de T-cellen worden gezuiverd voor deze soorten fluorescentie microscopie. Voor veel onderzoeksvragen echter het gebruik van ongezuiverde cellen in plaats van de hoogst mogelijke resolutie van het grootste belang. Dit is relevant als T-cellen van de patiënten worden geanalyseerd, aangezien het bedrag van donorbloed beperkt is en er de noodzaak wellicht voor het verwerken van vele monsters in parallel.
We gevestigde microscopische methoden waarmee de analyse van het cytoskelet van actine in de immuun SYNAPS in de menselijke systeem15,16,17. Deze methoden zijn gebaseerd op imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie18. Als een hybride tussen multispectrale stroom cytometry en fluorescentie microscopie, imaging stroom cytometry heeft zijn sterke punten in het analyseren van morfologische parameters en eiwit localisatie in heterogene cel populaties, zoals pan-leukocyten van de perifeer bloed. We introduceerden een methodologie waarmee we kunnen kwantificeren F-actine in T-cel/APC geconjugeerde van menselijke T-cellen van de volbloed monsters, zonder de behoefte aan tijdrovende en dure zuivering stappen17. De techniek die hier gepresenteerd omvat de gehele werkstroom, van het krijgen van het bloedmonster naar de kwantificering van F-actine in de immuun synaps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de Pan-leukocyten
- 1 mL van perifeer bloed trekken van een gezonde donor (of patiënt) in een heparinized spuit. Zorg ervoor dat de goedkeuring door de verantwoordelijke Ethische Commissie voor het doneren van bloed.
- Meng 1 mL van menselijke perifere bloed met 30 mL lysisbuffermengsel ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3en 0.1 mM EDTA, pH 7.0) in een tube van 50 mL en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
- Vul de buizen met PBS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 6 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 mL ACK lysis-buffermengsel.
- Herhaal stap 1.2 en 1.3 totdat het supernatans helder is. Ten slotte, de cellen in PBS, centrifuge op 300 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur, wassen en resuspendeer de pellet cel in 2 mL gestolde voedingsbodem (RPMI1640 + 10% FCS). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
2. laden van Raji cellen met SEB
- Bereiden twee 15 mL Falcon buizen met 1.5 x 106 Raji cellen per buis. Spin down de cellen (300 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur) en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in de resterende medium (ongeveer 50-100 µL), voeg 1.9 µL (1,9 µG) SEB, Incubeer bij kamertemperatuur voor 15 min. toevoegen 5 mL gestolde voedingsbodem, spin down de cellen (300 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur) en resuspendeer de pellet in een kweekvloeistof (RPMI 1640 + 10% FCS) bij een dichtheid van 1 x 106 cellen/mL.
3. de inductie van immuun synapsen en vlekken Protocol
- Pipetteer 500 µL van het preparaat van SEB-geladen Raji cellen in een buis FACS en 500 µL van de voorbereiding van gelost Raji cellen in een ander FACS buis. 650 µL van pan-leukocyten aan elke buis en spin down de cellen (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur) toevoegen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 150 µL cultuurmedium (RPMI1640 + 10% FCS). Incubeer bij 37 ° C (typisch voor 45 min).
- Zachtjes vortex de cellen (10 s bij 1000 omwentelingen per minuut) en voeg 1,5 mL paraformaldehyde (1,5%) tijdens de vortex te lossen van de cellen. Stop de fixatie door toevoeging van 1 mL PBS + 1% BSA. Pellet van de cellen (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en resuspensie de cel pellet in 1 mL PBS + 1% BSA na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Pellet (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur) en resuspendeer de cellen in 100 µL van PBS 1% BSA + 0,1% saponine gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur tot permeabilize van de cellen (96-wells-plaat, U-vormige).
- Wassen van de cellen in PBS, 1% BSA + 0,1% saponine met centrifugeren (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur) en resuspendeer de pellet cel in 50 µL van PBS, 1% BSA + 0,1% saponine bevattende fluorophore-gelabelde antilichamen of verbindingen (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), en de DAPI (1:3, 000)).
- Incubeer de cellen bij kamertemperatuur in het donker voor 30 min. Wash de cellen 3 keer door toevoeging van 1 mL PBS, 1% BSA + 0,1% saponine. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Re-resuspendeer de cellen in 60 µL van PBS voor imaging cytometry van de stroom.
4. Beeldacquisitie met behulp van een stroom Cytometer
Opmerking: De volgende afbeelding overname procedure en data analyse zijn gebaseerd op imaging cytometry van de stroom met behulp van software zoals imagestream (IS100), INSPIRE en ideeën. Andere flow cytometers en analyse software kan echter ook worden gebruikt.
- Open de analysesoftware op de computer is verbonden met de beeldvorming stroom cytometer en klik op initialiseren Fluidics van het Instrument-menu. De kralen zijn van toepassing op de juiste poort wanneer gevraagd dit te doen.
- De standaardsjabloon laden in het menu bestand en klik op Run/Setup. Kralen kiezen in het dropdown-menu Beeld.
- Het hulplicht helder-veld aanpassen door te klikken op intensiteit ingesteld als de aangegeven waarde lager dan 200 is.
- Voer de kalibratie en routine in het Assist-tabblad test door te klikken op Start alle.
- Klik op Flush/Lock/laden en toepassen van de monsters in de linker haven wanneer gevraagd dit te doen. Na het laden van de cellen in de cytometer van de stroom, de classificatie van de cel open en wijzig de waarden als volgt: piek intensiteit bovengrens op 1,022 voor elk kanaal, piek intensiteit ondergrens op 50 voor kanaal 2 (DAPI) en kanaal 5 (CD3-Pe-TxR), de ondergrens van het gebied op 50 voor kanaal 1 (kant spreiding) en de bovengrens op 1.500.
- De kracht van de laser excitatie omzetten in 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), en 647 nm (90 mW) in het tabblad Setup.
- Schakel het dropdown-menu Beeld tussen cellen en kralen om te evalueren van de cel classificatie en laser de aanpassingen van de macht.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle cellen en cel paren de mobiele weergave te vinden zijn en dat cel klontjes, puin en beelden met verzadigde pixels in de weergave van het puin worden gevonden door het veranderen van de cel classificaties en/of de bevoegdheden van de laser excitatie. - Definieert de naam van het monster en de hoeveelheid beelden te verwerven (15.000-25.000 voor monsters) en 500 voor compensatie besturingselementen in de Setup tab. Klik op Run/Setup om te beginnen met de overname.
5. de gegevensanalyse
- Overbrengen van de raw-afbeeldingsbestanden (.rif) naar de data analyse computer en open de analysesoftware.
- Het produceren van een matrix van de vergoeding volgens de instructies van de compensatie-dropdown. Sla de compensatie-matrix als comp_Date.ctm.
- Open een voorbeeldbestand voor raw-afbeeldingen (.rif) en toepassing van de comp_Date.ctm in het venster dat verschijnt om de gecompenseerd afbeeldingsbestanden (.cif) en het hulpprogramma voor het analyse van het standaard-gegevensbestand (.daf) te produceren.
- Open de gecompenseerd spiegelbeeld vijl. De beelden omzetten in kleurmodus en aanpassen van de opzoektabellen met het oog op een optimale zichtbare kleuren in de werkbalk afbeeldingseigenschappen van fotocollage. Het verkrijgen van een RGB-samengevoegde beeld met behulp van de samengestelde tabblad van de werkbalk afbeeldingseigenschappen van fotocollage.
-
Open de masker Manager in de vervolgkeuzelijst van de analyse. Het maken van maskers om te definiëren van de T-cellen en de immuun SYNAPS, als volgt:
- Selecteer de T-cel-masker: "(opvulling (Threshold_Ch05, 60)." Selecteer de vallei masker: "Valley(Ch02,3)." Selecteer de T-cel synapse masker: "T-cel masker en Valley (M02, Ch02, 3)."
-
Open de functie Manager in de vervolgkeuzelijst van de analyse. Bereken de volgende functies:
- Voor de totale CD3 meningsuiting in T-cellen, selecteert u "Intensity_T-cells_Ch5." Voor de totale hoeveelheid F-actine in de T-cellen, selecteert u "Intensity_T-cells_Ch6." Voor CD3 expressie in de immuun SYNAPS, selecteert u "Intensity_T-cel synapse_Ch5." Voor het bedrag van F-actine in de immuun SYNAPS, selecteer "Intensity_T-cel synapse_Ch6."
- Als u wilt berekenen van de oppervlakte van de T-cel, selecteert u "Area_T-cellen." Als u wilt berekenen van de oppervlakte van de immuun synapse T-cel, selecteert u "Area_T-cel synaps."
- De F-actine en CD3 verrijking in de immuun SYNAPS bepalen met behulp van de vergelijking in de Manager van de functie:
-
De volgende gating strategie toepassen met behulp van histogrammen en dot plots uit het analysegebied (voor verdere details, zie verwijzingen 17 en 19):
- Out-of-focus cellen negeren door het uitzetten van de "Gradient RMS_M2_Ch2" in een histogram; de drempel vastgesteld op 15.
- De WS versus CD3 intensiteit in een dot plot plot. Een poort aangezet CD3-positieve gebeurtenissen.
- Uitzetten van de "Aspect ratio" van M02 (DAPI vlek) ten opzichte van het gebied van M02 (Dapi vlek). Gate op onderhemden T-cel en cel paren dienovereenkomstig. Voor echte cel paren met behulp van het gebied van de synaps masker, zoals eerder beschreven17,19corrigeren.
- Het bepalen van het bedrag van F-actine in onderhemden T-cel en T-cellen van T-cel/APC paren en het percentage van de F-actine in de immuun synaps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een belangrijk doel van de hier beschreven methode is de kwantificering van eiwitverrijking (b.v., F-actine) in de immuun SYNAPS tussen surrogaat APCs (Raji cellen) en T cellen in ongezuiverde pan-leukocyten ontleend aan menselijke bloedmonsters van laag-volume (1 mL). De screenshot in Figuur 1 geeft een overzicht van de kritische gating strategie van deze methode. Het toont de image gallery op de linker- en het analysegebied aan de rechterkant (Figuur 1). De image gallery toont de poort "In Focus". De afgebeelde beelden zijn voornamelijk granulocyten en twee T-cel/APC koppels. F-actine en CD3 zijn verrijkt met paar celaantal 30272. De gating strategie te kwantificeren van het bedrag van de cel paren met dergelijke verrijking wordt weergegeven in het analysegebied en wordt beschreven in het protocol (zie stap 5,8) of elders17,19. Het laatste punt perceel in het analysegebied wordt weergegeven met hoeveel (procent eiwit) CD3 (x-as) en F-actine (y-as) in de immuun synaps. Als meer dan 30% van het eiwit gelegen binnen het immuun synapse masker was, werd het beschouwd als eiwitverrijking in de immuun synapse20. Stip percelen met verrijking gegevens werden gebruikt voor de productie van een typische eindresultaat (figuur 2A). Het beeld aan de linkerkant toont sample images van T-cel/APC geconjugeerde, met een lage hoeveelheid CD3 en F-actine in de immuun SYNAPS, overwegende dat aan de rechterkant, T-cel/APC geconjugeerde worden afgebeeld met een sterke verrijking van CD3 en F-actine. De hoeveelheid CD3 in de immuun SYNAPS (percentage eiwit) wordt uitgezet op de x-as, en het bedrag van F-actine in de immuun SYNAPS op de y-as uitgezet. Het percentage in de poort vertegenwoordigt het bedrag van de T-cellen met een verrijking van CD3 en F-actine in de immuun SYNAPS in aanwezigheid van een superantigen. Bij gebrek aan superantigen, 15% procent van de T-cellen toonde een verrijking op de immuun Synaps van CD3 zowel F-actine. De hoeveelheid cellen verhoogd tot 29% in aanwezigheid van superantigen. Een enkele kwantificering van CD3 verrijking (figuur 2B) of F-actine verrijking (figuur 2C) wordt weergegeven in de aanwezigheid en de afwezigheid van superantigen. Deze resultaten tonen aan dat, in de afwezigheid van superantigen, 18.3 ± 3,5% en, in het bijzijn van superantigen, op de immuun SYNAPS 34.3 ± 4,0% van het totaalbedrag van de F-actine in de cellen waren opgebouwd. Interessant, was er al CD3 accumulatie in de afwezigheid van superantigen (16.6 ± 2,1% van het totaalbedrag van CD3), die werd aanzienlijk verhoogd door de toevoeging van superantigen (24.6 ± 3,0% van het totaalbedrag van CD3). Met deze methode kunt de kwantificering van hoe veel eiwit is opgebouwd in de immuun SYNAPS tussen T-cellen en APCs.
Figuur 1: strategie voor de identificatie van immuun synapsen in pan-leukocyte preparaten Gating. De figuur toont een schermafbeelding van de software en bevat een volledige analyse workflow voor de evaluatie van CD3 en F-actine verrijking in de immuun Synaps van T cellen geconjugeerd met APCs in aanwezigheid van SEB. Afbeeldingen worden weergegeven in de galerie van de afbeelding aan de linkerkant (Ch2 = DAPI; H5 = CD3-PETxR; H6 = Phalloidin AF647; en samenvoegen = gecombineerde afbeelding met Ch2, H5 en H6). De software verstrekt een werkbalk weergave afbeeldingen aanpassen aan opzoektabellen en masker scherm modus Kleur/grijswaarde. Het rechtergedeelte van de screenshot toont het analysegebied en de werkbalk analyse. Het analysegebied bevat histogrammen en dot plots als volgt: 1) Histogram te vinden van cellen in focus volgens de kleurovergang RMS-functie van de DAPI kleuring. 2) gating op T-cellen volgens de uitdrukking van CD3 (Intensity_MC_Ch05, x-as) en de kant scatter Profiel (Intensity_MC_Ch01, y-as). 3) Gating op potentiële T-cel/APC paren volgens de hoogte-breedteverhouding van de vlek van de DAPI (Aspect ratio_M02, y-as) en de kant scatter Profiel (Intensity_MC_Ch01, x-as). 4) gating op waar T-cel/APC paren volgens het gebied synapse masker (x-as) en de oppervlakte van de vlek CD3 (y-as). 5) gating op volwassen immuun synapsen gedefinieerd door verrijking (> 30% eiwitgehalte in de interface) van CD3 (x-as) en F-actine (y-as) in de immuun synaps. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Imaging stroom cytometry gegevens op CD3 en F-actine verrijking in de immuun synaps. (A) de stip percelen in het midden het percentage van CD3 tonen (x-as) en F-actine (y-as) in de immuun synaps. T-cel/APC conjugaten met een volwassen immuun synapse bij afwezigheid (bovenste deel) of aanwezigheid (onderste gedeelte) van SEB zijn afgebeeld. De beelden op de linker show T-cel/APC paren met een lage graad van verrijking van CD3 en F-actine, overwegende dat de afbeeldingen aan de rechterkant T-cel/APC paar met een hoge mate van CD3 en F-actine verrijking (volwassen immuun synapse weergegeven). Schaal bar = 10 µm (linksonder). Het resultaat is vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten. (B-C) Bedoel CD3 (B) of F-actine (C) verrijking in de immuun SYNAPS in de aanwezigheid of afwezigheid van SEB wordt weergegeven als percentage eiwit (n = 3; SE). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde workflow maakt de kwantificering van immuun synapsen tussen menselijke T cellen (ex vivo) en APCs. Met name werden erytrocyt-lysed pan-leukocyten gebruikt als T-cel-bronnen, T-cel zuivering stappen overbodig maken. De B-cel lymfoom cellijn Raji diende als surrogaat APCs. Dit draagt aanzienlijke voordelen, omdat het maakt vergelijkingen tussen bloeddonoren van de kant van de T-cel van de immuun synaps. Autologe DCs kunnen bovendien nauwelijks rechtstreeks vanaf het perifere bloed. De productie van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDCs) duurt enkele dagen, uitdagende opstellen van het verzoek aan klinische studies. Echter kunnen imaging cytometry van de stroom en de strategie van de analyse die hier gepresenteerd worden toegepast op andere APCs (b.v., transdifferentiated neutrofielen)20. Bovendien werd aangetoond dat de immuun SYNAPS tussen CD4 T-cellen en ex vivo DCs9 of B cellen21 voor muizen met behulp van imaging stroom cytometry kan worden beoordeeld. Dus, deze methode kan worden uitgebreid met APC functie naast de T-cel-kant van de immuun SYNAPS beoordelen.
De belangrijkste stappen van deze methode zijn de pan-leukocyten en APCs mengen in een klein volume en het uitvoeren van de juiste gating strategie om uit te sluiten van vals-positieve gebeurtenissen en tegelijkertijd het minimaliseren van het verlies van ware immuun synapsen. We beschrijven de meting van de accumulatie van CD3 en F-actine, deze methode is niet beperkt tot deze proteïnen en kan worden uitgebreid tot andere oppervlakte receptoren, zoals LFA-117,19. Bovendien zou de toevoeging van fluorophore-gelabelde antilichamen te identificeren van T-cel subgroepen (bijvoorbeeld een, CD4, CD8, CD45RA of chemokine receptoren) voor het onderzoek van de aard van T-cellen weer te geven van een bepaalde immuun synapse fenotype. Nog belangrijker is, de hoeveelheid bloed die nodig is voor een dergelijke analyse is laag (maximale: 1 mL). Terwijl de eerste generatie van imaging flow cytometers, zoals hier gebruikt (IS100), hebben laat overname een beeldsnelheid van ongeveer 100 cellen/s, de derde generatie van imaging flow cytometers (IsXMKII) veel hogere tarieven van de overname van de afbeelding (max. 2.000 cellen/SEC met behulp van een 40 x doelstelling). Dus, de workflow, van de vaststelling van het bloed bij data-analyse, vereist een aanzienlijk korte periode (dwz, een dag). Met name, terwijl de gepresenteerde beeldanalyse is gebaseerd op imaging stroom cytometry, kunnen voorbereiding van de cel en de inductie van immuun synapsen (dat wil zeggen, het eerste deel van de werkstroom) worden toegepast op andere beeldvormende technieken22.
In tegenstelling tot stroom cytometry bevatten imaging stroom cytometry-verkregen dot plots informatie over eiwit lokalisatie naast eiwit expressie gegevens. Een sterkte van imaging stroom cytometry is dat cellen (of cel paren) van elke geselecteerde poort kunnen worden geëvalueerd door het oog; de grenzen van de poort kunnen worden aangepast, simpelweg door te klikken op de puntjes en inspectie van de bijbehorende afbeelding. In onze experimenten vonden we dat 30% eiwitverrijking een betrouwbare waarde is te overwegen de respectieve cel paar zoals hebbend de proteïne van belang verrijkt. Nadat de poorten zijn ten slotte ingesteld, de functies en de gating strategie worden opgeslagen in een afzonderlijk bestand (.ast) en kunnen worden toegepast op elke volgende monster te verzekeren van een onpartijdige evaluatie.
De zwakke punten van de stroom cytometry imaging zijn de beperking in de resolutie (0,5 µm met behulp van een 40 x doel) en het feit dat slechts één focus vlak kan worden geanalyseerd. Deze methode is daarom niet geschikt voor het analyseren van de fijne structuur van de immuun synaps en het vóórkomen van microclusters14. Voor het analyseren van het platform-gerelateerde aspecten van de immuun SYNAPS, alternatieve technieken, zoals confocal, TIRF, of Super resolutie microscopie, nodig zijn. De kracht van imaging cytometry van de stroom is de hoeveelheid beelden die kan worden verkregen per monster (tot 25.000). Met name elke afbeelding is gesegmenteerd, wat betekent dat de achtergrond is uitgeschakeld, en er is meestal slechts één eenzame cel of cel paar per beeld. Deze kenmerken van de beeldvorming stroom cytometry vormen de basis voor geautomatiseerde analyses op het niveau van één cel. Het hoge bedrag van cellen die zijn geanalyseerd per monster is bovendien voorzien van een betrouwbare identificatie van zeldzame gebeurtenissen (dat wil zeggen, subpopulaties of cel paren met een frequentie minder dan 1%). Nog belangrijker is, de werkstroom hier gepresenteerd kan worden toegepast op de studie van immuun synapse formatie in ex vivo T-cellen in pan-leukocyten van patiënten met een immuun-gerelateerde ziekte (bijvoorbeeld, primaire immuundeficiëntie stoornissen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksraad (DFG) met subsidies Nee. SFB-938-M en SA 393/3-4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D.
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K.
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O'Gorman, M. R.
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
