골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런
Summary
우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 – 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.
Abstract
신경 세포 염색의 골지 – 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 – 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.
Introduction
조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 – 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 (1)에 의해 개발 콕스 2에 의해 수정, 연구자들은 또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 3, 4 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 5, 6, 7, 8, 9,.
뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 기술적 인 고려 사항은 가능한 고배율 / 고해상도 현미경 목표의 작동 거리에 의해 제한되는 최대 슬라이스 두께입니다. 60 공통 오일 침지 목표 – 100X는 뛰어난 해상도를 제공 범위하지만, 일반적으로 200 μm의보다 크지 않습니다 자신의 작업 거리에 의해 제한됩니다. 200 ㎛의 범위로 잘라 뇌 절편 대뇌 피질 (10),의 CA1 영역 11, 12, 피라미드 신경의 얕은 층에서의 예시적인 피라미드 신경이 슬라이스 두께 내에 포함될 수있는 소정의 신경 세포 유형을 시각화하기 적합 할 수 해마 (15)의 치아 이랑에서 해마 13, 14, 및 과립 세포. 상대적으로 이상과 뉴런이러한 뇌 전체 수지상 트리를 포함하는 완벽한 각도로 구분 될 필요가 있기 때문에 셀 본체 (16)에서 800 μm의를 확장 할 수 있습니다 마우스, 더 큰 도전을 제공하는 대뇌 피질의 깊은 층에서 피라미드 신경 세포로 수지상 나무, 200 개 μm의 슬라이스 내의. 수지상 또는 분기 중 입쪽 또는 꼬리 방향으로 연장되는 경우에도 실현 될 수 없다. 그것은 다수의 뇌에 인접 섹션에 걸쳐 신경을 추적하여 이러한 제약을 해결하는 것이 가능하지만,이 방식은 17 정확하게 추적하는 섹션을 정렬하는 데 중요한 기술적 도전을 소개한다. 더 실용적인 접근 방식은 더 큰 두께로 잘라 뇌 섹션에 포함 된 전체 뉴런을 시각화하는 것입니다.
골지 – 콕스 방법을 사용하여 마우스의 500 μm의 두께 뇌 부분, 그들의 개월을 시각화 – 우리는 여기에 (400) 내에서 신경 세포를 염색하는 기술을보고rphology 800 μm의 작동 거리를 갖는 고해상도 실리콘 오일 침지 목적을 사용. 우리가 설명하는 골지 – 콕스 함침 처리 프로토콜은 문헌 (6)에 가장 많이 인용 된 현대 프로토콜 중 하나에서 수정됩니다. 두꺼운 뇌 섹션 우리의 접근 방식은 완전히 섹션에 포함 된 모든 유형의 뉴런을 식별의 가능성을 증가시키는 장점을 제공한다. 기본 프로토콜뿐만 아니라, 또한 독특한 장점 제공 본 개의 변형 : 위해 장착 섹션의 표면 상 크레 실 바이올렛 Counterstain과 함께 (1) 골지 – 콕스 염색 뇌 영역의 경계를 정의하고, 레이어를 식별 할 단면 처리 및 최종 처리 이전에 함침 전체 뇌의 장기 저장을위한 중간 제빙 단계와 대뇌 피질, (2) – 골지 콕스 염색.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 – 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 프로젝트 번호 30381)에서 CDCB에 존 R. 에반스 지도자 기금 연구 인프라 보조금, 그리고에 의해에서 CDCB에 발견 그랜트에 의해 지원되었다 NSERC에서 NJM에 발견 그랜트. ELL는 온타리오 대학원 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다. CDS는 NSERC에서 학부 학생 연구 조교에 의해 지원되었다. ALM은 NSERC에서 알렉산더 그레이엄 벨 (Alexander Graham Bell) 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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