Summary

Blootstelling van het varken voor CNS Histologische analyse: A Manual voor onthoofding, Schedel openen en Brain verwijdering

Published: April 13, 2017
doi:

Summary

Het doel van dit document en instructie video te beschrijven hoe bloot en verwijder de pig postmortem hersenen en hypofyse in intacte toestand, geschikt voor daaropvolgende macroscopische en histologische analyse.

Abstract

Varkens zijn steeds populairder geworden in grote dieren translationeel neurowetenschappelijk onderzoek als een economisch en ethisch haalbaar alternatief voor niet-menselijke primaten. De grote omvang van de hersenen van het varken maakt het gebruik van conventionele klinische hersenen imagers en de directe gebruik en het testen van neurochirurgische procedures en apparatuur uit de menselijke kliniek. Verdere macroscopische en histologische analyse vereist echter postmortem blootstelling van het varken centrale zenuwstelsel (CZS) en daaropvolgende verwijdering hersenen. Dit is niet eenvoudig, aangezien de pig CNS wordt ingekapseld door een dikke, benige schedel en wervelkolom. Het doel van dit document en instructie video te beschrijven hoe bloot en verwijder de pig postmortem hersenen en de hypofyse in intacte toestand, geschikt voor daaropvolgende macroscopische en histologische analyse.

Introduction

Translationele neurowetenschappen studies in varkens hebben steeds populairder geworden in de afgelopen twee decennia. De grote omvang van de varkenshersenen maakt het gebruik van conventionele klinische hersenen beeldschermen en direct gebruik en testen van neurochirurgische procedures en apparatuur uit de menselijke kliniek 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. In de laatste 20 jaar, varkens, minivarkens bijzonder (bijvoorbeeld minipig Göttingen), zijn gebruikt om neuromodulatory behandelingsmodaliteiten, zoals stamceltransplantatie te onderzoeken; virale vector transfectie; en diepe hersenstimulatie gericht ziekte van Parkinson, obesitas, depressie en ziekte van Alzheimer 2, 6,= "xref"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Dit werd gevolgd door de ontwikkeling van stereotaxische chirurgische benaderingen van het CNS minipig 3, 18, 19, 20, 21 te manipuleren. De ingestelde CNS wijzigingen zijn geëvalueerd in levende dieren met behulp van brain imaging (PET 10, 13, 22, 24 en 23 MR), cystrometrie 11, 12, 25, gangbeeldanalyse17, neurologisch onderzoek 9, 17 en autopsie basis van histologie en stereologische analyse 14, 15, 17, 26, 27, 31. Echter, postmortem analyse vereist de blootstelling en verwijdering van het varken hersenen, die geen gemakkelijke taak, als dikke, benige schedel en een vezelig durale die rondom de varkenshersenen.

Het doel van dit papier en instructievideo is om te beschrijven hoe de postmortem varken hersenen en de hypofyse kunnen worden blootgesteld en afgevoerd in een intacte toestand in 15-20 min met behulp van niet-gemotoriseerde chirurgische instrumenten. De instructie video en fotografische afbeeldingen tonen mannelijke minipigs (leeftijd: 6 maanden, lichaamsgewicht: 20-25 kg) gebruikt voor een anatomische studie over de minipig hypofyse.

Protocol

Dierlijke anesthesie en euthanesia werd uitgevoerd volgens "Principles of proefdier care" (NIH publicatie nr 86-23, herzien 1985) en door de Deense Raad voor dierlijke Research Ethics goedgekeurd. 1. Instrumenten Verzamel de instrumenten die in de video en in de tabel van Materialen vermeld. 2. Onthoofding OPMERKING: Anesthesie werd geïnduceerd door een intramusculaire injectie van 5 ml midaz…

Representative Results

Het weefselmateriaal uitdroging te voorkomen, wordt aanbevolen om de verwijderde hersenen en hypofyse slaan in een pot gevuld met lijm of isotone zoutoplossing onmiddellijk na macroscopische analyse is uitgevoerd. Het weefselmateriaal kan worden opgeslagen in het fixeermiddel jaren, terwijl opslag in isotone zoutoplossing, zelfs in de koelkast, leidt tot weefselverval tijd. De verwijderde hypofyse kan ook direct worden bevrore…

Discussion

Meest experimentele neurologie studies worden uitgevoerd in kleine diersoorten, zoals muizen en ratten, waarbij toegang tot het CNS wordt vergemakkelijkt door een dunne schedel- en durale dikte. In grote proefdieren als varkens 1, 4, 8, schapen 32 en niet-humane primaten, de aanzienlijke dikte van deze structuren is het gebruik van robuuste instrumenten (tabel van materialen) en goede ingangspunten voor …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen met dankbaarheid de bekwame hulp van Mrs. Trine W. Mikkelsen, mevrouw Lise M. Fitting, en het personeel in Påskehøjgaard. De Deense Medical Research Council, de Lundbeck Foundation, en de Novo Nordisk Foundation financieel ondersteund de studie.

Materials

Heavy Scalpel Handle #4 FST (Fine Science Tools) 10008-13 Good for skin incision and soft tissue removal
Non-Sterile Scalpel Blades #23 FST  10023-00
Scalpel Handle #7 FST  10007-12 Optimal for dural incision and precision work
Non-Sterile Scalpel Blades #11 FST  10011-00
Surgical Forceps FST  11024-18 The tip of the surgical forceps ensure a firm grip 
Kerrison Bone Punch Aesculap Neurosurgery FF713R Must be robust, bite size 3-5 mm
Bone Rongeur Aesculap Neurosurgery MD615 Must be robust, bite size 15 x 5 mm
Bone Rongeur Aesculap Neurosurgery FO551R Must be robust, bite size 25 x 15 mm 
Bone Chisel Lawton 67-0335 The size of the chisel head should not exceed 20 mm
Mallet (Hammer) Millarco 5624108 Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm
Micro-Scissor FST  14002-14  
Dissector Aesculap Neurosurgery OL165R
 Göttingen minipigs  Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark
Euthanimal pentobarbital
Ketamine Pfizer
Midazolam  Hameln Pharmaceuticals

References

  1. Lind, M. N., Moustgaard, A., Jelsing, J., Vajta, G., Cumming, P., Hansen, A. K. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31, 728-751 (2007).
  2. Bjarkam, C. R., et al. Neuromodulation in a minipig model of Parkinson disease. British J Neurosurg. 22 (Suppl. 1), S9-S12 (2008).
  3. Bjarkam, C. R., Cancian, G., Glud, A. N., Ettrup, K. S., Østergaard, L., Sørensen, J. C. MRI-guided stereotaxic targeting in pigs based on a stereotaxic localizer box fitted with an isocentric frame and use of SurgiPlan computer-planning software. J Neurosci Methods. 183 (2), 119-126 (2009).
  4. Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
  5. Bjarkam, C. R., et al. Safety and function of a new clinical intracerebral microinjection instrument for stem cells and therapeutics examined in the Göttingen minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 88 (1), 56-63 (2010).
  6. Fjord-Larsen, L., et al. Long-term delivery of nerve growth factor by encapsulated cell biodelivery in the minipig basal forebrain. Mol Therapy. 18 (12), 2164-2172 (2010).
  7. Sørensen, J. C., et al. Development of neuromodulation treatments in a large animal model – Do neurosurgeons dream of electric pigs?. Prog Brain Res. 194, 97-103 (2011).
  8. Dolezalova, D., et al. Pig models of neurodegenerative disorders: utilization in cell replacement-based preclinical safety and efficacy studies. J Comp Neurol. 522 (12), 2784-2801 (2014).
  9. Mikkelsen, M., Moller, A., Jensen, L. H., Pedersen, A., Harajehi, J. B., Pakkenberg, H. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  10. Danielsen, E. H., et al. The DaNEX study of embryonic mesencephalic, dopaminergic tissue grafted to a minipig model of Parkinson’s disease: Preliminary findings of effect of MPTP poisoning on striatal dopaminergic markers. Cell Transplant. 9 (2), 247-259 (2000).
  11. Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Jørgensen, T. M., Djurhuus, J. C. Effects of high frequency deep brain stimulation on urine storage and voiding function in conscious minipigs. Neurourol Urodyn. 23 (3), 265-272 (2004).
  12. Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Djurhuus, J. C. Stereotactic electrical stimulation of the pontine micturition center in the pig. Br J Urol. 95, 886-889 (2005).
  13. Andersen, F., Watanabe, H., Bjarkam, C. R., Danielsen, E. H., Cumming, P. Pig brain stereotaxic standard space: Mapping of cerebral blood flow normative values and effect of MPTP-lesioning. Brain Res Bull. 66 (1), 17-29 (2005).
  14. Glud, A. N., et al. Direct gene transfer in the minipig CNS using stereotaxic lentiviral microinjections. Acta Neurobiol Exp. 70 (3), 1-8 (2010).
  15. Glud, A. N., et al. Direct MRI-guided stereotaxic viral mediated gene transfer of alpha-synuclein in the minipig CNS. Acta Neurobiol Exp. 71 (4), 508-518 (2011).
  16. Ettrup, K. S., Sørensen, J. C., Rodell, A., Alstrup, A. K. O., Bjarkam, C. R. Hypothalamic deep brain stimulation influences autonomic and limbic circuitry involved in the regulation of aggression and cardiocerebrovascular control in the minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 90 (5), 281-291 (2012).
  17. Nielsen, M. S., et al. Continuous MPTP intoxication in the minipig results in chronic parkinsonian deficits. Acta Neurobiol Exp. 76, 198-210 (2016).
  18. Bjarkam, C. R., et al. A MRI-compatible stereotaxic localizer box enables high-precision stereotaxic procedures in pigs. J Neurosci Methods. 139 (2), 293-298 (2004).
  19. Bjarkam, C. R., Jorgensen, R. L., Jensen, K. N., Sunde, N. A. A., Sørensen, J. C. H. Deep brain stimulation electrode anchoring using BioGlue®, a protective electrode covering, and a titanium microplate. J Neurosci Methods. 168, 151-155 (2008).
  20. Ettrup, K. S., et al. Basic Surgical Techniques in the Minipig: Intubation, Transurethral Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion. J Vis Exp. (52), e2652 (2011).
  21. Ettrup, K. S., Tornøe, J., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. A surgical device for minimally invasive implantation of experimental deep brain stimulation leads in large research animals. J Neurosci Methods. 200 (1), 41-46 (2011).
  22. Danielsen, E. H., et al. Positron emission tomography of living brain in minipigs and domestic pigs. Scand J Lab Anim Sci Suppl. 25 (1), 127-135 (1998).
  23. Røhl, L., et al. Time evolution of cerebral perfusion and ADC measured by MRI in a porcine stroke model. J Magn Reson Imaging. 15 (2), 123-129 (2002).
  24. Cumming, P., Gillings, N. M., Jensen, S. B., Bjarkam, C. R., Gjedde, A. Kinetics of the uptake and distribution of the dopamine D2/3 agonist (R)-N-[1-11C]n-propylnorapomorphine in brain of healthy and MPTP-poisoned Gottingen miniature pigs. Nucl Med Biol. 30 (5), 547-553 (2003).
  25. Jensen, K. N., Deding, D., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. Long-term implantation of deep brain stimulation electrodes in the pontine micturition centre of the minipig. Acta Neurochir. 151 (7), 785-794 (2009).
  26. Rosendal, F., et al. Does chronic low dose treatment with ciclosporin influence the brain? A histopathological study in pigs. Transplantation Proc. 37 (8), 3305-3308 (2005).
  27. Nielsen, M. S., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. The substantia nigra pars compacta of the minipig: An anatomical and stereological study. Brain Struct Funct. (4-5), 481-488 (2009).
  28. Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R., Simonsen, C. Z., Danielsen, E., Geneser, F. A. Oriented sectioning of irregular tissue blocks in relation to computerized scanning modalities. Results from the domestic pig brain. J Neurosci Methods. 104, 93-98 (2000).
  29. Bjarkam, C. R., Pedersen, M., Sørensen, J. C. New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology. J Neurosci Methods. 108, 153-159 (2001).
  30. Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Geneser, F. A. Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus proper. Hippocampus. 13 (1), 21-37 (2003).
  31. Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. , (2016).
  32. Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model. Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).
  33. Jortner, B. S. The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation. Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).

Play Video

Cite This Article
Bjarkam, C. R., Orlowski, D., Tvilling, L., Bech, J., Glud, A. N., Sørensen, J. H. Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal. J. Vis. Exp. (122), e55511, doi:10.3791/55511 (2017).

View Video