Summary

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em> Tribolium castaneum</em> עובר

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

Abstract

Castaneum Tribolium חיפושית הקמח האדום הפך אורגניזם מודל חרקים חשוב בגנטיקה התפתחותית ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית. התצפית של עוברי Tribolium עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון יש יתרונות רבים על פני widefield הקונבנציונלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. בשל המאפיינים הייחודיים של מיקרוסקופ גיליון מבוסס אור, שלוש תמונות ממדיות של דגימות חיות יכולות להיות מוקלטות עם יחס אות לרעש גבוה באופן משמעותי הלבנת תמונה וכן צילום רעיל לאורך כיוונים מרובים לאורך תקופות שנמשכות מספר ימים. עם יותר מארבע שנים של פיתוח מתודולוגיות ועלייה רציפה של נתונים, הפעם נראה מתאים להקים נהלי עבודה סטנדרטיים עבור השימוש בטכנולוגית גיליון אור בקהילת Tribolium כמו גם בקהילת החרקים רחבים. פרוטוקול זה מתאר שלוש טכניקות הרכבה מתאימות Fאו למטרות שונות, מציגות שתי שורות מחוייטת רומן מהונדסות Tribolium מתאימים הדמיה חי לטווח ארוך, מציעה חמישה צבעי ניאון לתייג מבנים תאיים של עוברים קבועים ומספקות מידע על עיבוד פוסט נתונים להערכה בזמן של הנתונים שנרשמו. תוצאות נציג להתרכז הדמיה חיה לטווח ארוך, חתך אופטי ואת התצפית של אותו העובר לאורך כיוונים מרובים. מערכי נתוני בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. לבסוף, הפרוטוקול דן בקרות איכות עבור מבחני הדמיה חיים, מגבלות נוכחיות ואת תחולת ההנחיות המתוארות כדי מינים של חרקים אחרים.

פרוטוקול זה מיועד בעיקר עבור ביולוגים התפתחותיים המבקשים פתרונות הדמיה כי להכות ציוד מעבדה סטנדרטי. זה מקדם את הניסיון המתמשך כדי לסגור את הפער בין / קהילות מעבדות חוקיות מבחינה הטכנית, אשר לפתח ולשכלל microsלהעתיק מתודולוגית, ואת מעבדות מדעי חיים / קהילות, אשר דורשות פתרונות "plug-and-play" אל אתגרים טכניים. יתר על כן, הוא תומך בגישה אקסיומטית שזזה השאלות הביולוגיות למרכז תשומת לב.

Introduction

חיפושית קמח אדום Tribolium castaneum, אשר שייך למש' הגדולה של חיפושיות אפלוליות (Tenebrionidae), יש היסטוריה ארוכה בתחום מדעי החקלאות וחיים והוא האורגניזם השני הכי טוב לומד מודל חרקי המודל אחרי זבוב הפרות תסיסנית. במהלך ארבעת העשורים האחרונים, זה הפך אורגניזם מודל החרק חזק ופופולרי בגנטיקה התפתחותית, בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, במהלך עשרים השנים האחרונות, ב morphogenesis העוברי עבור מגוון רחב של סיבות:

תסיסנית Tribolium שניהם שייכים Holometabola, אך נפרדו כ -300 מיליון שנים לפני 1, 2, 3, 4. בעוד ההתפתחות העוברית של תסיסנית נחשבה בכינויו נגזר מאוד, Tribolium מציגה מצב אבות יותר של development שנמצא שיעור גבוה יותר משמעותית של מיני חרקים 5, 6, 7, 8, 9. ראשית, Tribolium מציג פיתוח הראש הלא involuted, כלומר איברי הפה המחושים שלה לצוץ כבר במהלך העובר 10, 11, 12, 13, 14, 15. שנית, Tribolium מלווה את העקרונות של פיתוח קצר נבט, כלומר קטעי בטן מתווספים ברצף מאזור הגידול האחורי במהלך התארכות germband 16, 17, 18, 19. שלישית, Tribolium מפתחת מדרדרת מאוחרשתי ממברנות חוץ עוברי כלומר את amnion, אשר מכסה את העובר רק ventrally, ואת serosa, שעוטף את העובר לחלוטין 20, 21, 22. ממברנות שניהם ממלאים המוךפו"גנטי שהולך מכריע 23 כמו גם תפקיד המגן נגד מיקרואורגניזמים 24, 25 ו 26 התייבשות. רביעית, הרגליים מתפתחות בעוברים פועלים באופן תקין לחלוטין בשלב בחיים הזחל לשמש primordia עבור הרגליים הבוגרת במהלך המטמורפוזה גלמי 27, 28, 29, 30, 31.

בשל דרישות הגודל צנוע הקטנות שלהם, טיפוח Tribolium במעבדה הוא פשוט למדי. תרבויות של wild-type (WT) זנים או קווי מהונדס מכילים בדרך כלל סביב 100-300 מבוגרים יכולים להישמר בתוך בקבוקי זכוכית חד ליטר (טביעת 80 ס"מ 2) מילא שלושה כדי בארבעה סנטימטרים גבוה (כ 50 גרם) עם מדיום הגידול הכולל של חיטה דגנים מלאים קמח בתוספת שמרים יבשים פעילים. צינור לאספקת מים אין צורך. זה מאפשר גם מעבדות קטנות כדי לשמור על עשרות תרבויות חיפושית בתוך אינקובטורים חרקים קטנים או בינוניים זמינים מסחרית. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר Tribolium (זחלים אחרי בערך instar הרביעיים, גלמים ומבוגרים) מופרדים בקלות מן מדיום הגידול ידי סינון. עובר מסונכרן מתקבלים על ידי דוגרי מבוגרים לתקופות קצרות על מדיום הטלה. עבור פיתוח מהיר, תרבויות חיפושית נשמרות 32 ° C (כארבעה שבועות לכל דור), תוך שמירה על מניות מבוצעת בדרך כלל ב- C ° 22-25 (כעשרה שבועות לכל דור).

במשך העשור האחרון, tec סטנדרטי רבhniques הותאמו בהדרגה אופטימיזציה עבור Tribolium, כפי שמסוכם הספרים אורגניזמים מודל Emerging 32. חשיבות רבה הם מתקדמים בשיטות גנטיות כגון 33 עובריים, 34 זחל, 35 או 36 הורית, 37 RNA מציאת גן מבוסס הפרעה, טרנספורמציה germline גם עם 38 piggyBac, 39 או מערכת מינוס 40 transposase ו קריספר / בגנום מבוסס Cas9 הנדסה 41. יתר על כן, הגנום Tribolium כבר רצף לפני כעשור 42, והיום הוא בסיבוב השלישי של הגנום הרכבה לשחרר 43, אשר מאפשר זיהוי יעיל הגנום כולו וניתוח שיטתי של גנים 44 </sעד> או אלמנטים גנטיים אחרים 45, 46. בנוסף, את הגנומים של ארבעה מינים קשים כנפיים התפוצצו בפניו אחרים זמינים עבור גישות גנטיות השוואתיות 47, 48, 49, 50. בשיתוף עם הגנום הרצף, שני ניתוחים גנטיים גדולים בוצעו, כלומר מסך mutagenesis insertional 51 ו RNA השיטתית הפרעה מבוססת מציאת גן מסך 52, 53.

דימות פלואורסצנטי חיה עם widefield, confocal או מיקרוסקופ מבוסס גיליון אור (LSFM) מאפשרת לבחון את המורפולוגיה העוברית של Tribolium כפונקציה של זמן (כלומר morphogenesis) בהקשר רב-ממדים (לוח 1). בשנת widefield הקרינה confocal מיקרוסקופ, את Excitאור ation והפליטה מונחה דרך העדשה האובייקטיבית. בשתי הגישות, הדגימה כולו מוארת לכל מטוס דו ממדי רשם. לפיכך, הדגימות חשופות לרמות אנרגיה גבוהות מאוד. בשנת LSFM, רק fluorophores במישור המוקד נרגש בשל ביטול צימוד של תאורה וזיהוי באמצעות שתי עדשות אובייקטיביות סודר בניצב (איור 1). LSFM מגיע בשני מימושים הקאנוני – למיקרוסקופ תאורת המטוס הבודד (SPIM) ואור הליזר הדיגיטלי סרוק מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס הגיליון (DSLM, איור 2) – ומציע מספר יתרונות מכריעים על פני גישות מסורתיות: (i) יכולת חתך אופטית פנימית, (ii) רזולוציה צירית טוב, (iii) ברמה מופחתת מאוד של הלבנת צילום, (iv) צילום רעילות נמוכה מאוד, (נ) יחס אות לרעש גבוה, (vi) מהירות רכישה גבוהה יחסית, (vii) הדמיה לאורך כיוונים מרובים (viii) חדיר לרקמות עמוקות יותר בשל השימוש של עדשות אובייקטיביות תאורת מספרי צמצם נמוכה 54, 55, 56.

LSFM כבר יושם בהצלחת Tribolium לתעד כמעט המורפוגנזה העוברי כולו 57 ו לנתח את העקרונות של קרע קרום חוץ עוברי בתחילת גב סגר 23. כדי להעלות את האטרקטיביות של LSFM בקהילת Tribolium ועבור מדע חרקים בכלל, זה הוא בעל חשיבות רבה להקמת נהלי עבודה ועל מנת לשפר את השיטות, פרוטוקולים בברכה של משאבים לרמה שבה מיקרוסקופ הופך קל -השתמש כלי סטנדרטי במעבדות הביולוגיה ההתפתחותית, ואת השאלות ביולוגי להישאר במרכז תשומת הלב.

פרוטוקול זה מתחיל עם יסודות של Tribolium </ em> טיפוח, תחזוקה כלומר, רבייה ואיסוף עובר. הבא, שתי אסטרטגיות ניסיוני מומחשות: (i) הדמית חיה של קווים מהונדסים מחוייט (ii) הדמיה של עוברים קבועים כי הוכתמו צבעי ניאון (לוח 2). כתוצאה מכך, שלוש טכניקות הרכבה עם מטרות שונות מעט מוסברים בפירוט (איור 3 ולוח 3): (i) בעמודה agarose, (ii) בחצי הכדור agarose ו (iii) בעל קורי עכביש הרומן. הפרוטוקול ואז מסביר את הליך רכישת נתונים עם LSFM. שיטות הדמיה ושיקולים מרכזיים מתוארות. לבסוף, חזר עובר מוסבר והצעות לעיבוד נתונים בסיסיים מסופקות. בתוצאות הנציג, נתוני הדמיה חיים משני רומן מחוייט הקווים המהונדסים 58-כחולת גליה מוצגים ואת מערכי נתוני הדמית בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. בנוסף, תמונהנתונים של עוברים קבועים כי הוכתמו במגוון צבעי קרינה מוצגים. הדיון מתמקד בקרת איכות, מגבלות נוכחיות של גישת ההדמיה חי ואת ההסתגלות של פרוטוקול מינים אחרים.

הפרוטוקול נכתב עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון המצוידות בתא מדגם מנגנון מהדק rotatable עבור מחזיקי מדגם סטנדרטיים 54, 59, 60, שהן בדרך כלל אלמנטים בצורת גליל עשויים מתכת, פלסטיק או זכוכית בקוטר בטווח המילימטר. הפרוטוקול מתאים גם הוא מימושים הקאנוני, כלומר SPIM ו DSLM, כמו גם עבור setups עם לפחות שתי זרועות תאורה וזיהוי 61, 62, 63. התוצאות נציג להראות נתונים בשני ערוצי ספקטרלי, ירוק (illumination עם לייזר 488 ננומטר, זיהוי באמצעות 525/50 bandpass מסנן) ואדום (תאורה עם לייזר 561 ננומטר, זיהוי באמצעות 607/70 bandpass מסנן), אבל הפרוטוקול ניתן להרחיב לערוצים ספקטרלי שלוש או ארבע.

Protocol

בעלי 1. של תרבויות Tribolium הערה: תנאים סטנדרטיים מוגדרים טמפרטורת דגירה של 25 מעלות צלזיוס ו 70% לחות יחסית בתוך 12 h בהיר / 12 h מחזור כהה. לקבלת מידע נוסף על בעלי Tribolium, הנחיות מתאימות זמינות 64. פרוטוקול זה דורש שנייה ב…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר מסגרת ניסיונית עבור דימות פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתם עובר Tribolium עם LSFM. בשל הרמות הנמוכות של הלבנת תמונה-רעילות צילום, תוצאה ישירה של יכולת החתך האופטית שלה, LSFM הוא גם מתאים במיוחד עבור הדמית חיה ארוך טווח. <p class="jove_content" fo…

Discussion

בקרת איכות

מבחני הדמיה חיים, הליך כנת הקלטה חייב להיות בלתי-פולשנית, כלומר לא את הטיפול המכאני וכימי (האוסף, dechorionation, הרכבה על בעל המדגם) ולא את עומס האנרגיה המשולב במהלך התצפית צריך לפגוע בכדאיויות של הדגימה. עבור מח…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים סוון פלאת לקבלת תמיכה טכנית. השורה המהונדסת-כחולת גליה הייתה מתנה מסוג מ הגרגור בוכר (גטינגן, גרמניה). המחקר מומן על ידי האשכול של פרנקפורט המצוינת המיין עבור מכלולי Macromolecular (CEF-MC, EXC 115, הרמקול וולקר Dötsch) העניקו בחלקו EHKS במכון ע"ש בוכמן עבור מדעי חיים מולקולריים (BMLS, מנהל אנריקו Schleiff) בבית גתה Universität פרנקפורט ידי (DFG).

Materials

full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 ml B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on “Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on “Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head–a beetle’s view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap’n’collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity–Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -. M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -. M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. . . Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, &. #. 2. 7. 2. ;., Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a., Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It’s a bug’s life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Play Video

Cite This Article
Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

View Video