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Cancer Research

ट्यूमर सेल व्यवहार और ड्रग रिस्पांस के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए प्रतिरक्षा-सक्षम होस्ट में ज़ेफराफीश बाल रोग के ट्यूमर का प्रत्यारोपण

Published: May 17, 2017 doi: 10.3791/55712
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Oncological Sciences and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine, 2Department of Dermatology, University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City
* These authors contributed equally

Summary

कैंसर तंत्रों और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं की पहचान के लिए कैंसर की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण एक महत्वपूर्ण उपकरण है। वर्तमान तकनीक प्रतिरक्षा-अक्षम जानवरों पर निर्भर करती हैं। यहां, हम ट्यूमर सेल व्यवहार के दीर्घकालिक विश्लेषण और विवो औषधि प्रतिक्रियाओं में प्रतिरक्षा-सक्षम भ्रूण में zebrafish ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

ट्यूमर सेल ट्रांसप्लांटेशन कैंसर सेल विकास, प्रवासन, और मेजबान प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने के साथ ही चिकित्सा के लिए संभावित रोगी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। ट्यूमर भ्रष्टाचार की अस्वीकृति से बचने के लिए मौजूदा तरीकों का मुख्य कारण सिग्नेनिक या प्रतिरक्षा-समझौता जानवरों का उपयोग करने पर निर्भर करता है। इस तरह के तरीकों को विशिष्ट आनुवांशिक उपभेदों के उपयोग की आवश्यकता होती है जो प्रायः प्रतिरक्षा-ट्यूमर सेल के विश्लेषण के विश्लेषण को रोकते हैं और / या विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए सीमित हैं। Zebrafish में एक वैकल्पिक विधि 3 दिनों से पहले भ्रूण के मस्तिष्क में एक अपूर्ण विकसित प्रतिरक्षा प्रणाली का लाभ लेता है, जहां ट्यूमर कोशिकाओं को अल्पावधि assays ( यानी, 3 से 10 दिनों) में उपयोग के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों का कारण होस्ट व्यथा है, जो ट्यूमर सेल व्यवहार और दवा की प्रतिक्रिया के दीर्घकालिक अध्ययन को रोकता है। इस प्रोटोकॉल में ज़ेबराफिश ब्रेन ट्यूमर के ऊतक के दीर्घकालिक ऑर्थोपीक प्रत्यारोपण के लिए एक सरल और कुशल विधि का वर्णन किया गया है।एक 2 दिवसीय पुरानी प्रतिरक्षा-सक्षम zebrafish के चौथे वेंट्रिकल को इस पद्धति की अनुमति है: 1) ट्यूमर कोशिका व्यवहार का दीर्घकालिक अध्ययन, जैसे कि आक्रमण और प्रसार; 2) ड्रग्स के टिकाऊ ट्यूमर प्रतिक्रिया; और 3) ट्यूमर के विकास और / या विभिन्न मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव के अध्ययन के लिए ट्यूमर के पुन :प्रदान। संक्षेप में, यह तकनीक कैंसर के शोधकर्ताओं को कई महीनों में रासायनिक पट्टियों और सेल प्रतियोगिता के एशेज के साथ-साथ दूर-दूर तक साइटों पर इंग्रग्रेटमेंट, आक्रमण और विकास का आकलन करने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल को अन्य ट्यूमर प्रकारों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है और इसका उपयोग रसायनज्ञता और मेटास्टेसिस के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

ट्यूमर कोशिकाओं में प्रतिरक्षा-समझौता जानवरों में प्रत्यारोपण, विशेष रूप से माउस एक्सनोग्राफ्ट, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है जो कि कैंसर सेल प्रसार 1 , 2 , अस्तित्व, आक्रमण और मेटास्टेसिस 3 , 4 को नियंत्रित करने के साथ-साथ एक मंच प्रदान करने के लिए तंत्र का अध्ययन करता है 5 , 6 , 7 की स्क्रीनिंग दवाओं के लिए हाल ही में, प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों की प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में प्रत्यारोपण रोगी-व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल को नैदानिक ​​और पूर्व-क्लिनिक दवा स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए उपयोग करने के लिए किया गया है और यह व्यक्तिगत चिकित्सा पहल की रीढ़ है 8 , 9 , 10 , 11 । हालांकि, महत्वपूर्ण साक्ष्य से पता चलता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली modulatingस्टेम ट्यूमर के व्यवहार और रोगी परिणाम 12 , 13 पर एक नाटकीय प्रभाव हो सकता है। इसने "मानवीकृत" चूहों को शामिल करने के लिए एक्सनोग्राफ्ट आधारित तकनीकों का नया डिज़ाइन प्रेरित किया है, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सह-प्रत्यारोपण द्वारा माउस की प्रतिरक्षा प्रणाली का पुनर्गठन किया गया है। हालांकि, यह तरीका तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, चरणीय प्रजनन क्षमता और तकनीक से जुड़ी विषाक्तता, 14 , 15 की महत्वपूर्ण लागत के अलावा। इस प्रकार, प्रतिरक्षा-सक्षम जानवरों में नई प्रत्यारोपण तकनीक की आवश्यकता होती है जो कि कैंसर की प्रगति और नशीली दवाओं की प्रतिक्रिया के प्रतिरक्षा-और ट्यूमर-विशिष्ट तंत्र की खोज में तेजी लाने की आवश्यकता होती है।

ज़ेबराफिस मानव कैंसर के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक पशु मॉडल हैं, जिसमें से 20 से अधिक कैंसर के मॉडल अब 16 की स्थापना कर चुके हैं, जिनमें अत्यधिक घातक मस्तिष्क 17 , मेला नमा 18 , 1 9 , 20 , और अग्नाशय के कैंसर 21 , 22 , साथ ही साथ कई ल्यूकेमिया 23 , 24 , 25 , 26 , 27 Zebrafish प्रणाली के दो विशेषताओं कैंसर अनुसंधान के लिए विशेष रूप से इसे सक्षम बनाता है: 1) पारदर्शी जानवरों की ऑप्टिकल स्पष्टता सरल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग कर कैंसर सेल व्यवहार ( यानी, प्रसार, अस्तित्व, आक्रमण और प्रसार) के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है 2) महिला zebrafish प्रति दिन 200 भ्रूण पैदा कर सकता है, जिससे कम लागत पर आनुवांशिक या दवा स्क्रीनिंग के लिए पशु संख्याओं में तेजी से स्केलिंग की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, zebrafish और मनुष्यों के कैंसर जीनोम अत्यधिक संरक्षित हैं (ओंकोजिन और ट्यूमर-दमनकारी जीन सहित)28 ", जिससे तंत्रज्ञानी और ड्रग की खोजों को तेजी से स्तनधारी प्रणालियों में अनुवादित किया जा सके। इन विशेषताओं में भी प्रत्यारोपण तकनीक के लिए zebrafish एक आदर्श पशु मॉडल बनाते हैं, जो इमेजिंग, स्केलेबिलिटी और सिस्टम की कम लागत का लाभ लेते हैं।

प्रतिरक्षा-समझौता zebrafish में पिछले ट्यूमर प्रत्यारोपण के अध्ययन ने आत्म-नवीकरण क्षमता, ट्यूमर की दुर्दशा, और आक्रमण / प्रसार 11 , 2 9 की पहचान में सहायता की है । ट्यूमर कोशिका व्यवहार का अल्पकालिक अध्ययन γ- विकिरणित वयस्कों में निम्नलिखित प्रत्यारोपण के लिए किया जा सकता है, जिनकी प्रतिरक्षा प्रणाली ~ 20 दिन 11 , 30 के लिए प्रभावी रूप से दब गई है। अस्वीकृति के साथ वयस्क zebrafish के इलाज के साथ 30 दिन तक बी- और टी-कोशिकाओं को खारिज कर दिया जाता है। एक और कम आम रणनीति क्लोनल ज़ेबराफिश उपभेदों को रोजगार देती हैजो प्रतिरक्षा-सक्षम होस्ट 32 में दीर्घकालिक जांच को सक्षम करता है हालांकि, केवल सीमित संख्या में क्लोनल उपभेदों का निर्माण किया गया है और कम उर्वरता के कारण बनाए रखना मुश्किल है। इसके अलावा, अधिकांश स्थापित जैबराफिश ट्यूमर मॉडल अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि में उत्पन्न होते हैं, इसलिए इन ट्यूमर को प्रतिरक्षा तंत्र 11 , 33 , 34 को दबाने के बिना क्लोनल नस्लों में प्रत्यारोपित नहीं किया जा सकता है। लंबे समय तक प्रत्यारोपण के अध्ययन में सुधार के लिए हाल के दृष्टिकोणों में शामिल हैं, आरजी 2 E450fs उत्परिवर्ती लाइन का विकास, जिसमें समझौता बी- और टी-सेल फ़ंक्शंस शामिल हैं, जिसका इस्तेमाल कई कैंसर 35 , 36 को सफलतापूर्वक ट्रांसप्लांट करने के लिए किया गया है। क्लोनल ज़ेब्राफिश लाइनों या प्रतिरक्षा-समझौता मेजबान के लिए आवश्यकता को दरकिनार करने के लिए, कई समूहों ने प्रारंभिक चरण के भ्रूण ( यानी, > 72 एचपीमानव ट्यूमर कोशिका प्रत्यारोपण के लिए उप-निषेचन (एचपीएफ)) के रूप में, इन भ्रूणों ने अभी तक पूरी तरह से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली 37 , 38 , 3 9 , 40 , 41 , 42 , 43 नहीं विकसित की है। हालांकि, ये पद्धति ट्यूमर सेल व्यवहार या दवा प्रतिक्रिया (आमतौर पर कम से कम 2 सप्ताह) के अल्पकालिक विश्लेषण तक सीमित होती हैं क्योंकि मानव कैंसर कोशिकाओं या ट्रांसप्लांटेशन तकनीक स्वयं मेजबान को मारता है, दीर्घकालिक अध्ययन और पुन: प्रत्यारोपण को रोकता है।

इस प्रोटोकॉल में एक संशोधित भ्रूण प्रत्यारोपण विधि का विवरण दिया गया है जो 2 दिन के बाद निषेचन (डीपीएफ) भ्रूण मस्तिष्क के चौथे वेंट्रिकल के लुमेन में है। यह मेजबान को विषाक्तता को कम करता है और ट्यूमर कोशिकाओं के दीर्घकालिक engraftment के लिए zebrafish ब्रेन ट्यूमर मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, यह तकनीक अलट्यूमर कोशिकाओं के पुन: प्रत्यारोपण के लिए कई पीढ़ियों में नए मेजबानों के लिए चढ़ाव, ट्यूमर विविधता, मेजबान / प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, दवा प्रतिक्रियाओं, या मेटास्टैटिक क्षमता पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा देता है। यह पद्धति भी सरल, कुशल और स्केलेबल है, क्योंकि प्रति दिन एक एकल उपयोगकर्ता द्वारा 300 प्रत्यारोपण किए जा सकते हैं, जिसमें 9 0% इंग्रैमेंटमेंट हैं। इससे आनुवंशिक या दवा स्क्रीनिंग परियोजनाओं के लिए 2 डीपीएफ पर भ्रूण के सैकड़ों भ्रूण में एकल प्राथमिक ट्यूमर के तीव्र प्रचार की अनुमति मिल सकती है या कई महीनों में अलग-अलग मेजबान पृष्ठभूमि में सीधे ब्रेन ट्यूमर सेल व्यवहार की कल्पना कर सकता है।

Protocol

यूटा इंस्टीट्यूशनल एनीमेयर केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीसीयूसी # 16-03019) के पशु देखभाल दिशानिर्देशों की सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई और उनका पालन किया गया।

1. माइक्रोएन्जेन्सी के लिए उपकरण की तैयारी

  1. इंजेक्शन प्लेट तैयार करना
    1. अंडे के पानी में भंग होने वाले 1.2% agarose के एक 50 एमएल समाधान तैयार करें (रिवर्स ऑसमॉसिस पानी + 0.01 एमजी / एल मेथिलिन ब्लू में 0.6 ग्राम / एल एक्वायरम नमक)। जब तक agarose घुल न हो तब समाधान निकालें और फिर 0.05 मिलीग्राम / एल मेथिलिन नीले जोड़कर पूरक। 10 सेमी पेट्री डिश में अंतिम समाधान के 25 एमएल डालो और इसे मजबूत करने की अनुमति दें चरण 1.1.2 के लिए तैयार होने तक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के नल में शेष 25 मिलीलीटर agarose समाधान रखें।
    2. ठोस सतह के केंद्र में 2 इंच व्यास बीकर सेट करें और शेष 1.2 एमएएल 1.2% एगरोज़ डालें।
      नोट: यह प्लेट की परिधि पर एक इंजेक्शन सतह बनाता है और केंद्र में एक कोर होता है, जो किसुई आकार और ट्यूमर निलंबन स्थिरता का परीक्षण करने के लिए एक क्षेत्र प्रदान करता है।
      1. इंजेक्शन से पहले या कम से कम 30 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन प्लेट को दीर्घकालिक भंडारण के लिए बनाए रखें।
  2. इंजेक्शन सुइयों की तैयारी
    1. एक सुई खींचने पर दो सुई में 10 सेमी केशिकाओं को 1.2 मिमी के बाह्य आयाम और 0.9 मिमी (एक रेशा के बिना) का एक आंतरिक आयाम खींचकर सुई लें।
      नोट: प्रत्येक सुई को कुल लंबाई में 6 सेमी मापा जाना चाहिए, जहां लगभग 1.5 सेंटीमीटर अंतराल पतला होता है।
    2. प्लास्टिक पैराफिन फिल्म में लिपटे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सुई को सावधानीपूर्वक रखें। टिप पर एक उद्घाटन के साथ सुई बनाने के लिए 45 डिग्री कोण पर सुई के अंत में कटौती करने के लिए एक रेज़र ब्लेड का उपयोग करें।
      नोट: आमतौर पर, 0.1 मिमी से सुई के अंत में 0.3 मिमी निकाल दिया जाता है। इंजेक्शन करने के लिए एक बीगल टिप की आवश्यकता नहीं है।
  3. माइक्रोिनेंस सेटअप तैयार करें
      <Li> एक मानक माइक्रोइन्जेक्शन सेटअप व्यवस्थित करें, जिसमें एक स्टिरिओमिकोरोस्कोप, मैनिपुलेटर और ट्रांस्प्लामेंटेशन के लिए एक माइक्रोइन्ग्जर भी शामिल है।

2. प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण की तैयारी

  1. 45 से ऊपर वर्णित के रूप में और 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बनाए रखने के रूप में 500 mitfa w2 भ्रूण 44 (या उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किसी अन्य zebrafish जीनोटाइप का भ्रूण) तक एकत्रित करें।
  2. अंडे के पानी में पतला 100 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीज कॉकटेल समाधान और लगभग 20 मिनट के लिए धीरे से चट्टान के 100 μL जोड़कर 24 एचपीएफ पर भ्रूण को हटा दें। अवशिष्ट प्रोटीज को निकालने के लिए भ्रूण को ताजे अंडा के पानी के साथ 3 बार कुल्ला।
  3. उचित विकास चरण के लिए 48 एचपीएफ पर भ्रूण को स्क्रीन करें, जैसा कि मानक स्टेजिंग श्रृंखला मानदंड 45 द्वारा परिभाषित किया गया है।
    नोट: प्रत्यारोपण के लिए केवल सही तरीके से व्यवस्थित और morphologically सामान्य भ्रूण का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  4. चतनाशून्य करनापेटी डिश में 0.002% ट्राइकेन-एस युक्त अंडा पानी में लगभग बीस 48-एचपीएफ भ्रूण। आंदोलन की समाप्ति को देखते हुए उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें

3. एक ट्यूमर सेल निलंबन बनाना

नोट: जेबराफिश ब्रेन ट्यूमर मॉडल आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग संयोजनों द्वारा ओंकोजिन और ट्यूमर शमन दांतों 17 , 46 , 47 से उत्पन्न हो सकते हैं। यहां, सोक्स 10 प्रमोटर संचालित एनआरएएस डब्ल्यूटीटी , पी 53 ज़डएफ 1 / ज़डएफ 1 सीएनएस-पीएनईटी ज़ेब्राफिश मॉडल का इस्तेमाल किया गया था, जैसा कि हाल ही में 17 में वर्णित है।

  1. एक मस्तिष्क ट्यूमर असर मछली का ईयूथैन करें, जिसका ट्यूमर का बोझ कुल शरीर के आकार का लगभग 20% है, जो 0.4% ट्राइकेन-एस ओवरडोस का उपयोग करता है IACUC- अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार बर्फ के पानी में विसर्जन के बाद।
  2. प्रतिदीप्ति के तहत एक रेज़र ब्लेड और चिमटी के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूमर काटनासूक्ष्मदर्शी बाँझ तकनीक का इस्तेमाल करते हैं और इसे 5 एमएल 1x फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) में रख देते हैं।
    नोट: सटीक विच्छेदन के तरीकों उपयोगकर्ता परिभाषित और ट्यूमर प्रकार और ऊतक स्थान पर निर्भर होगा। विभिन्न zebrafish अंगों और मस्तिष्क ट्यूमर 17 , 48 के विच्छेदन के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए सूचीबद्ध संदर्भ देखें।
  3. मैन्युअली ट्यूमर द्रव्यमान को एक p1000 पिपेट का उपयोग करते हुए एक समान, ढीले समाधान तक विकसित हो जाता है। विंदुक टिप के साथ बड़े सूक्ष्म पदार्थों को निकालें या 40 माइक्रोन सेल झरनी (यह ट्यूमर पर निर्भर है) का उपयोग कर। कमरे के तापमान पर 2 मिनट 290 xg के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
    नोट: ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लूरोसेन्स-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) नहीं किया जाता है इससे स्ट्रॉमल, प्रतिरक्षा, और ट्यूमर कोशिकाओं की विषम जनसंख्या के प्रत्यारोपण के लिए अनुमति मिलती है।
  4. 100 μL बाँझ पीबीएस में ट्यूमर सेल गोली को दोबारा resuspend और एक 1.5 एमएल सूक्ष्मअपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन के 5 μL लें और पीबीएस के 250 μL में इसे पतला करें। एक हेमोसिटामीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें 3 मिनट के लिए 290 xg पर निलंबन अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और वांछित सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ पीबीएस में गोली resuspend।
    नोट: आमतौर पर, बालों वाली पीबीएस के 30-40 μL में कोशिकाओं को पुन: पेश किया जाता है जो चिपचिपा और अपारदर्शी (सेल एकाग्रता ≥100 कोशिकाओं / एनएल) का समाधान करता है और सबसे सफल प्रत्यारोपण उत्पन्न करते हैं। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन नहीं किया गया है।
  5. प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान 28 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर ट्यूमर निलंबन को स्टोर करें।

4. 2-डीपीएफ भ्रूण के चौथे वेंट्रिकल में ट्यूमर सस्पेंशन को इंजेक्शन करना

  1. ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके इंजेक्शन प्लेट की परिधि में 10-20 संवेदी भ्रूण (चरण 2.4 से) को ट्रांसफर करें; भ्रूण को इंजेक्शन प्लेट पर बाद में गिरना चाहिए, वेंट्रिकल्स स्पष्ट रूप से दिखाई देने और पहुंचने के साथ। आवश्यक रूप से भ्रूण को समायोजित करने और इंजेक्शन प्लेट के बाहरी किनारे से उन्हें दूर करने के लिए एक एग्लेग जांच का उपयोग करें।
  2. जेल लोडिंग विंदुक युक्तियों का उपयोग करके इंजेक्शन सुई में ट्यूमर सेल निलंबन के 1-2 μL लोड करें और मैनिपुलेटर में सुई डालें।
  3. मैन्युअलकर कम से कम 45 डिग्री के कोण पर सुई पकड़े हुए एक्स, वाई, और जेड निर्देशों में सुक्ष्ममापक पर knobs को समायोजित करें जब तक कि सुई अभी ऊपर नहीं है और भ्रूण के सिर के दायरे में लगभग 5 मिमी। स्टिरिओमिकोरोस्कोप की आंखों के माध्यम से देखो और धीरे-धीरे एक्स-दिशा में सूक्ष्म-नियामक को समायोजित करें जब तक कि सुई भ्रूण के चौथे वेंट्रिकल को छेद न करे। सुई को दिल या जर्दी को छिड़कने की अनुमति न दें।
    1. ट्यूमर सेल निलंबन इंजेक्षन करने के लिए माइक्रोइन्ग्जर से जुड़ी पैडल को पुश करें।
      नोट: इंजेक्शन का दबाव और समय सुई बोर आकार के आधार पर भिन्न होगा, लेकिन एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 5-10 एसएसआई और 50 - 100 एमएस है।इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा मानक तेल बूंद तकनीकों के साथ इंजेक्शन के माध्यम से खनिज तेल में मूल्यांकन की जा सकती है, यदि वांछित 49 0.1 पीपी के ड्रॉप व्यास के साथ 500 पीएल के इंजेक्शन आमतौर पर सर्वश्रेष्ठ परिणाम देते हैं।
  4. धीरे इंजेक्शन प्लेट से इंजेक्ट भ्रूण को कुल्ला और पेट्री डिश में ताजा अंडे के पानी का उपयोग करें। शेष प्रक्रियाओं के लिए या जब तक वे टैंकों में उगाए जाते हैं (जैसा चरण 4.9.1 में वर्णित है) के लिए अंडे के पानी में भ्रूण को बनाए रखें।
  5. एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत इंजेक्शन भ्रूण का निरीक्षण करें। पुष्टि करें कि इंजेक्शन का दबाव, कोण, सुई आकार, और सेल निलंबन चिपचिपाहट के परिणामस्वरूप ट्यूमर कोशिकाओं में वेंट्रिकल स्पेस का 25-50% भरना है। आवश्यक रूप से इन पैरामीटर को समायोजित करें
  6. किसी भी शेष भ्रूण के लिए चरण 4.1-4.5 दोहराएं। आवश्यक अतिरिक्त भ्रूणों को एन्स्थेटेज़ करना (चरण 2.4 में वर्णित है)।
    नोट: एक अनुभवी उपयोगकर्ता 300 से अधिक भ्रूण तक 3-4 घंटे तक इंजेक्ट कर सकता है।
  7. भ्रूण को वापस में रखें28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर रातोंरात।
  8. अगले दिन morphological और शारीरिक विशेषताओं, जैसे सामान्य हृदय और मस्तिष्क के विकास की जांच के द्वारा भ्रूण के अस्तित्व का मूल्यांकन, 45 वर्णित है।
  9. स्क्रीनिंग के लिए, भ्रूण को एनेस्थेटेज़ करें, जैसा चरण 2.4 में वर्णित है, 1 दिन के बाद ट्रांसप्लांट (डीपीटी) पर।
    1. एक पेट्री डिश के बीच 4% मिथाइल सेल्यूलोज को जोड़ने के लिए ट्रांसफ़्रेंस विंदुक का प्रयोग करें और भ्रूण को मेथिलसेललोज ड्रॉप को जोड़ दें। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए अनुरूप इंग्रैमेंटमेंट साइज़ के लिए एग्लीड जांच और स्क्रीन का उपयोग करके भ्रूण (उदरीय पक्ष प्रकाश का सामना करना पड़ता है) ओरिएंट। वेंट्रिकल तक सीमित न होने वाले ट्यूमर कोशिकाओं वाले किसी भी भ्रूण को निकालें या जिनके ट्यूमर कोशिकाएं हैं, वे वेंट्रिकल स्पेस के 25% से कम का सामना कर रहे हैं।
      नोट: संगत engraftment एक एकल ट्यूमर द्रव्यमान के साथ भ्रूण के रूप में परिभाषित किया गया है जो कि वेंट्रिकल स्पेस 17 के 25-50% शामिल करता है। स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए, एक प्रतिदीप्ति एस का उपयोग करेंएक 1 एक्स उद्देश्य के साथ टेरेमोइक्रोस्कोप, 0.15 संख्यात्मक एपर्चर, 0.7-1.6 एक्स से लेकर एक आवर्धन, और 1 एस से 50 एमएस का एक्सपोजर टाइम सभी छवियों के लिए, GFP या RFP चैनल के अलावा उज्ज्वल फील्ड चैनल का उपयोग करें
    2. ट्यूमर के रखरखाव के लिए, टैंकों में प्रत्यारोपित भ्रूण को 45 डिग्री 8 डीपीएफ (6 डीपीटी) बढ़ने के लिए रखें।

5. सेलुलर व्यवहार के लिए इमेजिंग प्रत्यारोपित भ्रूण

  1. 3-8 डीपीएफ (1-6 डीपीटी) पर भ्रूण को एनेस्थेटेज़ करें और 1.2% कम पिघला हुआ एगरोज़ में माउंट (कंडोली का सामना करने वाला पृष्ठीय पक्ष)। 38 , 43 , 53 की आवश्यकता के अनुसार सेलुलर व्यवहार जैसे माइग्रेशन, सेल डिवीजन या सेल-सेल इंटरैक्शन को देखने के लिए इच्छित समय के लिए लेज़र स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करते हुए घुड़सवार भ्रूण का समय चूक इमेजिंग करें।
    नोट: 1,024 x 1,024 के एक पहलू अनुपात का उपयोग करें, स्कैन की गति 8 और #181 की / पिक्सेल। पूरे ट्यूमर द्रव्यमान (1,000-1,500 माइक्रोन) के कब्जे को सुनिश्चित करने के लिए औसत स्कैन करें और z- गहराई के आयाम को परिभाषित करें। इसके अतिरिक्त, 4-एच समय-व्यतीत प्रयोग करने के लिए, इनवेसिव व्यवहार को मॉनिटर करने के लिए प्रत्येक 10-15 मिनट का उपयोग करके एक 40x उद्देश्य का उपयोग करना। डिटेक्टर संवेदनशीलता ट्यूमर द्रव्यमान की तीव्रता के आधार पर अलग-अलग होगी, और लेजर शक्ति माइक्रोस्कोप-निर्भर होगी, लेकिन आम तौर पर यह 15 से 40% के बीच होने की सिफारिश की जाती है।
  2. एक बार इमेजिंग पूरी हो जाने पर, एंग्लो जांच से एग्रोस से घुड़सवार भ्रूण को मुक्त करें और इसे ताजे अंडे के पानी से पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।

6. प्रत्यारोपित भ्रूणों के लिए दवा प्रशासन और ट्यूमर भार 17 का आकलन

  1. 3 डीपीएफ में भ्रूण anesthetize और उन्हें 4% मिथाइल सेलुलोज में ओरिएंटेशन, उदर की ओर प्रकाश स्रोत का सामना करना पड़ रहा है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप 17 का उपयोग कर पूर्व-उपचार भ्रूण छवि।
  2. प्लाएक 12-अच्छी तरह से थाली में 3 डीपीएफ पर प्रत्यारोपित भ्रूण के साथ, 0.5 मिलीलीटर अंडे के पानी में 10 भ्रूण प्रति अच्छी तरह से। वांछित अंतिम एकाग्रता ( जैसे, 50 सुक्ष्ममापी एमईके अवरोधक) प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में दवाएं जोड़ें और भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटा दें। अगले दिन, एक पतली-बोर हस्तांतरण विंदुक के साथ नशीली दवाओं के इलाज वाले अंडे के पानी को हटा दें और ताजा उपचार जोड़ें। भ्रूण तक 8 डीपीएफ तक पहुंचने तक रोजाना दोहराएं।
  3. 8 डीपीएफ में, भ्रूण को दवा के उपचार से हटा दें और उन्हें ताजे अंडे के पानी में डाल दें। 4% मिथाइल सेलुलोज में भ्रूण और ओरिएंट (प्रकाश स्रोत की ओर उकसाव वाला पक्ष) एनेस्थेटेट करें। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए छवि भ्रूण के बाद उपचार। उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ट्यूमर क्षेत्र को बढ़ाएं, जैसा कि 17 वर्णित है।
  4. इलाज के अनुसार उचित भ्रूण को अलग करें और उन्हें टैंकों में बढ़ने के लिए जगह दें। 4- 9 सप्ताह के बाद, मछली को संवेदनाहट करते हैं और उन्हें मानक ट्यूमर बोझ के लिए एक मानक प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग करने के लिए आकलन, डी के रूप मेंउठी 17

Representative Results

ट्यूमर ट्रांसप्लांटेशन और इंग्रैमेंटमेंट

प्रक्रिया की एक schematized रूपरेखा चित्रा 1 में दर्शाया गया है। फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को प्राथमिक अंग साइट से निकाला जाता है, और 2- डीपीएफ माइटफा डब्लू 2 जैब्राफिश भ्रूण 44 के चौथे वेंट्रिकल में प्रत्यारोपण के लिए एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न होता है। चित्रा 2 चित्रा 2 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र आदिम तंत्रिका एक्टोडर्मल ट्यूमर (सीएनएस-पीएनईटी) के एक zebrafish मॉडल का उपयोग करके इस पद्धति के प्रतिनिधि परिणामों को दिखाता है, जिसमें सोक्स 10 प्रमोटर ने वाइंड-टाइप एनआरएएस या सक्रिय एनआरएएस को पी 3-डीफ़िशियंट ओलिगोनियल पूर्ववर्ती कोशिकाओं में एमकेरी से जोड़ा है। 17 मैइटोफ़ा w2 zebrafish 44 म्यूटेंट, जो मेलेनोफोर्स का अभाव है, अधिक आसानी से कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाप्रत्यारोपण और / या वयस्कता में ट्यूमर कोशिकाओं के बाद। अन्य वर्णक म्यूटेंट का उपयोग अतिरिक्त इमेजिंग स्पष्टता प्रदान करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कैस्पर 50 प्रत्यारोपण के बाद 24 घंटे के रूप में, ट्यूमर कोशिकाओं को आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों ( चित्रा 2 ए , 3 डीपीएफ, तीर) में आक्रमण देखा जा सकता है। अगले सप्ताह ( चित्रा 2 ए , 8 डीपीएफ) में वेंट्रिकल और आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों में ट्यूमर ग्राफ्ट बढ़ना जारी है। इस समय, गुर्दे के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति भी देखा जा सकता है ( चित्रा 2 ए , तारांकन)। यह प्रत्यारोपण से सेलुलर मलबे को छानने वाले गुर्दे की वजह से हो सकता है, जो पहले के अध्ययन के अनुरूप है जो गुर्दा समारोह 51 का मूल्यांकन करने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करता है। ट्यूमर कोशिकाओं को प्रजनन और आक्रमण करना जारी है, इसलिए 28 डीपीएफ से, एक ट्यूमर द्रव्यमान पूरे ज़ेब्राफिश्ड मस्तिष्क ( चित्रा 2 ए , 28 डीपीएफ) में देखा जा सकता है।

चित्रा 2 बी के शीर्ष पैनल में दिखाया गया है। ट्यूमर इंग्रैमेंटमेंट आम तौर पर 80-90% भ्रूण में प्राप्त होता है, और ट्यूमर ट्रांसप्लांट वयस्कता में जारी रहता है; चित्रा 2 बी के तल पैनलों में तीन प्रतिनिधि उदाहरण दिखाए गए हैं यह कई पीढ़ियों तक ट्यूमर ट्रांसप्लांट को काटा और जमे हुए या फिर से प्रत्यारोपित करने की अनुमति देता है।

ट्यूमर आक्रमण और दवा प्रतिक्रियाएं

चित्रा 3 ए एक सह-प्रत्यारोपण योजना को दर्शाता है जिसमें जीएफपी (ट्यूमर ए) या एमकेरी (ट्यूमर बी) के साथ लेबल किए गए दो अलग-अलग ट्यूमर पूरे-टूमया हदबंदी (ध्यान दें कि एफएसीएस का उपयोग यहां नहीं किया गया है, लेकिन यदि आवश्यक हो तो एफएसीएस-सॉर्ट किया गया ट्यूमर कोशिका का उपयोग किया जा सकता है)। ट्यूमर ए और बी अलग-अलग स्थानों से हो सकता है, अलग-अलग ऑक्सीजन के साथ प्रेरित हो सकता है, या विभिन्न आनुवांशिक पृष्ठभूमि में प्रेरित हो सकता है। प्रत्येक ट्यूमर को एकल-सेल निलंबन में संसाधित किया जाता है, और ट्यूमर कोशिकाओं को फिर 1: 1 अनुपात में मिलाया जाता है और 2-डीपीएफ भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जाता है। ट्यूमर ए बनाम ट्यूमर बी के इंग्रैमेंटमेंट, ग्रोथ, आक्रमण और प्रसार जैसे ट्यूमर के गुणों को उसी मेजबान में देखा जा सकता है जो तकनीक और आनुवांशिक पृष्ठभूमि के लिए आंतरिक नियंत्रण की अनुमति देता है।

चित्रा 3 बी में , एनआरएएस-ड्रायवन, सेरेबेलम से ऑप्टिकल टेक्टम और एक जीएफपी-लेबल सीएनएस-पीएनईटी से एमकेरी लेबल वाली जैबराफिश सीएनएस-पीएनईटी का उत्पादन किया गया और एकल-सेल निलंबन में संसाधित किया गया। कोशिकाओं की गणना की गई, और प्रत्येक ट्यूमर से एक समान संख्या में कोशिकाओं को मिलाकर मिलाया गया और 2-डीपीएफ भ्रूण में प्रत्यारोपित किया गया। चार डीप्रत्यारोपण के बाद एआईएस, भ्रूण confocal माइक्रोस्कोपी के साथ imaged थे। दिखाया गया एक प्रतिनिधि भ्रूण है जो ग्रंथि ट्यूमर कोशिका (लाल) अनुमस्तिष्क ट्यूमर की तुलना में मेजबान मस्तिष्क (तीर) में अधिक व्यापक रूप से माइग्रेट करता है।

फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित भ्रूण औषधि उपचार के नियमों में इस्तेमाल किया जा सकता है जो ट्यूमर के विकास को रोकते हैं। चित्रा 3C उपचार और इमेजिंग ट्यूमर ट्रांसप्लांट्स के लिए एक विशिष्ट समय है। 24 घंटे के बाद ट्रांसप्लांटेशन, भ्रूण को सुसंगत engraftment आकार के लिए उपयोग किया जाता है और उपचार समूहों में विभाजित किया जाता है। प्रदान किए गए उदाहरण में, एनआरएएस-ड्रायवन के साथ प्रत्यारोपित भ्रूण, एम-शेरी-लेबल वाले zebrafish सीएनएस-पीएनईटी का इलाज 50 माइक्रोन डाइमिथाइल सल्फोक्सीड (डीएमएसओ) या एमईके अवरोधक (एजेडी 6244) के साथ किया जाता है। भ्रूण का इलाज 5 दिनों के लिए किया जाता है और चित्रा 3 सी में उल्लिखित 8 डीपीएफ पर इमेज किया जाता है। चित्रा 3 डी (बायां पैनल) दिखाता है दो उपचार समूहों से ई जानवरों। एमईके अवरोधक के इलाज वाले भ्रूण में डीएमएसओ के इलाज के मुकाबले प्रतिदीप्ति की काफी कम मात्रा है, जैसा कि 17 वर्णित है। जानवरों को इमेज किए जाने के बाद, उन्हें निक्षेपों के बिना टैंकों में स्थानांतरित किया जाता है और दो महीनों तक ट्यूमर के विकास के लिए निगरानी की जाती है। दिए गए उदाहरण में, एमईके अवरोध करनेवाला उपचार वयस्क मछली में एक टिकाऊ प्रतिक्रिया ( चित्रा 3 डी , सही पैनल) में परिणाम। दवा के उपचार, इमेजिंग और मात्रा का ठहराव पर अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 17 देखें।

आकृति 1
चित्रा 1: ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण की प्रोटोकॉल योजनाबद्ध 2-डीपीएफ ज़ेबराफिश भ्रूण के चौथे वेंट्रिकल में। वैकल्पिक समापन बिंदु विश्लेषण (अनुभाग 4.9-6) सहित प्रोटोकॉल के 3 से 4 अनुभागों के सामान्य योजनाबद्ध।/55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: ट्यूमर इंग्रग्रेटमेंट और प्रगति। (ए) ज़ेबरिफ़िश प्राथमिक सीएनएस-पीएनईटी 17 ट्यूमर कोशिकाओं को एम-फेरी के साथ लेबल किया गया जो 2-डीपीएफ भ्रूण के चौथे वेंट्रिकल में प्रत्यारोपित किया गया था। 3 डीपीएफ में, ट्यूमर कोशिकाएं आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों (तीरों) में आक्रमण में आती हैं। 8 डीपीएफ में, वेंट्रिकल में ट्यूमर कोशिकाएं बढ़ रही हैं; लाल ट्यूमर कोशिका भी आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों और गुर्दे (तारांकन) में मौजूद हैं। 28 डीपीएफ में, ट्यूमर कोशिकाओं ने आक्रमण किया और मेजबान मस्तिष्क में बढ़ने लगा। (बी) शीर्ष पैनल MCherry- लेबल zebrafish ब्रेन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित सात 3-डीपीएफ भ्रूण। ट्यूमर की कोशिकाओं को सैकड़ों भ्रूण में लगातार ट्रांसप्लांट किया जा सकता है, जिसमें उच्च इंग्राममेंट रेट ( अर्थात, आमतौर पर 85/100 भ्रूण) होते हैं। मध्य औरनीचे पैनल प्रत्यारोपित ट्यूमर के साथ तीन प्रतिनिधि वयस्क मछली 4-8 सप्ताह के बाद निषेचन (डब्ल्यूपीएफ)। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्यूमर को देखा जा सकता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: ट्यूमर आक्रमण और ड्रग रिस्पांस की तुलना करना। ( ए ) सीएनएस-पीएनईटी 17 ऑप्टिक टेक्टम या सेरिबैलम से क्रमशः एम-फेरी या जीएफ़पी के साथ लेबल किया जाता है, जो एकल सेल निलंबन में संसाधित होता है, 1: 1 अनुपात में मिश्रित होता है, और 2-डीपीएफ भ्रूण में सह-प्रत्यारोपित होता है। ( बी ) जीपीपी-लेबल अनुमस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के एक मिश्रित निलंबन के साथ 6-डीपीएफ भ्रूण को ट्रांसप्लाटा और ऑप्टिक टेक्टम से एमकेरी-लेबल ट्यूमर कोशिकाएं। टी में प्रत्येक ट्यूमर के आक्रामक गुणों में अंतरवह उसी प्राप्तकर्ता को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखा जा सकता है। इस उदाहरण में, mCherry- लेबल ट्यूमर कोशिकाओं GFP (तीर) के साथ लेबल की तुलना में अधिक बड़े पैमाने पर माइग्रेट। ( सी ) ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित भ्रूणों पर दवा के उपचार के लिए समयरेखा। ( डी ) उपचार आहार के अंत में प्रतिनिधि जानवरों की छवियों (8 डीपीएफ) और 8 सप्ताह के बाद उपचार (8 डब्ल्यूपीएफ) में, या तो एक डीएमएसओ नियंत्रण या 50 माइक्रोन एमईके अवरोधक के साथ। ट्यूमर के बोझ को प्रतिदीप्ति बढ़ाकर मापा जा सकता है, जैसा कि 17 वर्णित है। इस प्रयोग में, एमकेरी-लेबल ट्यूमर कोशिकाओं का विकास एमईके अवरोधक-इलाज वाले भ्रूण में कम हो जाता है और वयस्कों में टिकाऊ प्रतिक्रिया में अनुवाद करता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

यह प्रोटोकॉल एक साधारण और कुशल प्रत्यारोपण परख का विवरण देता है जिसमें 2 डीपीएफ भ्रूण के निलय में zebrafish ट्यूमर कोशिकाओं का इंजेक्शन शामिल होता है जो पूरी तरह से सक्षम प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित करेगा। अब तक, सीओएन-पीएनईई 17 और मेलेनोमा (डेटा नहीं दिखाया गया है) को सफलतापूर्वक ट्यूमर सेल व्यवहार और आक्रमण के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए ट्रांसप्लांट किया गया है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदमों में उचित सुई बोर आकार और उचित ट्यूमर सेल निलंबन सुनिश्चित करने और मेजबान भ्रूण पर्याप्त रूप से anesthetizing सुनिश्चित करना शामिल है। प्रत्येक व्यक्ति के शोधकर्ता के लिए, इस तकनीक के आगे अनुकूलन में ट्यूमर सेल एकाग्रता, इंजेक्शन दबाव, और भ्रूण अभिविन्यास के समायोजन शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग ट्यूमर से होने वाली निलंबन की चिपचिपाहट में विविधता हो सकती है, इसलिए अलग-अलग ट्यूमर प्रकार पुनः-निलंबित और प्रत्यारोपण के लिए अधिक या कम मुश्किल हो सकता है। हालांकि, सुई बोर आकार का समायोजन करके और diffe का उपयोग करकेट्यूमर के निलंबन के किरायों का किराया, ट्यूमर चिपचिपापन से जुड़े कठिनाइयों को दूर करना संभव है

हमारे अनुभव में, वेंट्रिकल में विरल कोशिकाओं / असंगत कोशिकाओं के लिए सबसे सामान्य कारण इस प्रकार हैं: 1) ट्यूमर सेल निलंबन बहुत पतला है; 2) सुई बोर आकार बहुत छोटा है; 3) इंजेक्शन का समय और दबाव बहुत कम है; और / या 4) शेष ऊतक ट्यूमर से फ़िल्टर नहीं किए गए थे और सुई में दर्ज किए गए थे। जब ट्यूमर सेल निलंबन इंजेक्शन के बाद वेंट्रिकल से बहता है, तो यह होने की संभावना है: 1) वेंट्रिकल के तल के खिलाफ सुई का स्थान; 2) एक उच्च इंजेक्शन दबाव और समय; और / या 3) एक सुई बोर आकार जो बहुत बड़ा है प्रत्यारोपित भ्रूणों का निम्न अस्तित्व निम्न कारण हो सकता है: 1) समय की विस्तारित अवधि के लिए भ्रूण को संवेदनाहट करना; 2) इंजेक्शन प्लेट पर भ्रूण छोड़कर सूखने के लिए; 3) वायुमंडल में हवा के बुलबुले का इंजेक्शन; और / या 4) महत्वपूर्ण अंगों को छेदना, जैसे कि मस्तिष्क औरदिल, क्योंकि सुई वेंट्रिकल के माध्यम से चला गया।

प्रौढ़ या भ्रूणीय zebrafish मस्तिष्क में ट्यूमर प्रत्यारोपण के पूर्व तरीकों वयस्कों में immunosuppression (आनुवंशिक रूप से, फार्माकोलॉजिकल या विकिरण के माध्यम से ) पर निर्भर हैं या 38 , 43 , 52 , 53 , 54 के भ्रूण में मानव या माउस कोशिकाओं के अल्पकालिक अध्ययन तक ही सीमित हैं । उदाहरण के लिए, अल्पावधि (~ 2 दिन) प्री-क्लिनिकल ड्रग एशेज 54 में प्रयोग के लिए माउस ब्रेन ट्यूमर को इंटैनैसल से डेक्सैमेथेसोन-इम्युनोसप्रेसेड, 30-डीपीएफ, किशोर zebrafish में इंजेक्ट किया जा सकता है। हालांकि, इन प्रयोगों में इंजेक्शन की साइट खोपड़ी और मस्तिष्क के ऊतकों और सामान्य मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान में संभावित परिणाम से छिपा हुआ है, जो मेजबान व्यवहार्यता और इंजेक्शन क्षमता को कम करता है। एक अन्य हाल में वर्णित विधि में मानवीय ग्लिब का इंजेक्शन शामिल हैफिजोमा कोशिका लाइनें ज़ेबराफिश भ्रूण के मध्य-मध्य क्षेत्र में, जिससे विकास, आक्रमण और ड्रग की प्रतिक्रिया 43 के अल्पकालिक विश्लेषण को सक्षम किया गया। फिर, इंजेक्शन साइट का सटीक स्थान चर और संभावित नुकसान सामान्य ऊतक है। इस प्रकार, भ्रूण मस्तिष्क प्रत्यारोपण के पिछले तरीकों में अक्सर मेजबानों की व्यवहार्यता का समझौता किया जाता है, इन अध्ययनों को अल्पावधि विश्लेषण ( यानी, 2 से 14 दिनों) तक सीमित कर दिया जाता है, जिससे अस्पष्ट इंजेक्शन साइटों के कारण व्यक्तिगत इंजेक्शन के बीच बढ़ती हुई परिवर्तनशीलता, और लंबे- सेल व्यवहार और दवा प्रतिक्रियाओं या कई पीढ़ियों भर में फिर से प्रत्यारोपण के लिए अवधि का विश्लेषण।

यहां वर्णित विधि में शोधकर्ताओं को अनुमति देने के द्वारा zebrafish भ्रूण और प्रतिरक्षा-समझौता प्रत्यारोपण तकनीकों में मौजूदा सीमाओं को संबोधित किया गया: 1) प्रतिकृत रूप से आसपास के ऊतकों को कम नुकसान के साथ, उसी स्थान में इंजेक्शन; 2) सीधे अधिकतम करने के लिए इंजेक्शन की साइट कल्पनाइंग्रीमेंटमेंट दक्षता; 3) प्रति दिन भ्रूण के सैकड़ों प्रत्यारोपण; 4) ट्यूमर को प्रतिरक्षा-सक्षम जानवरों में विकसित करने की अनुमति; 5) ट्यूमर सेल व्यवहार और टिकाऊ दवा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए zebrafish के जीवन पर अनुमति; और 6) ट्यूमर के विकास या ड्रग रिप्लस तंत्र पर संभावित अध्ययन के लिए कई पीढ़ियों तक ट्यूमर के पुन: प्रत्यारोपण की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रतिरक्षा आबादी सहित मेजबान प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए किसी भी zebrafish जीनोटाइप का उपयोग करने में सक्षम बनाता है। इन विशेषताओं ने इस विधि को किसी भी प्रयोगशाला द्वारा आसानी से अनुकूलनीय बनाया है जो पहले से ही zebrafish में मानक microinjections प्रदर्शन करता है। अंत में, जबकि यह विधि zebrafish ब्रेन ट्यूमर के orthotopic इंजेक्शन के लिए आदर्श है, जब अन्य ट्यूमर प्रकार, जैसे कि यकृत या अग्नाशयी, ट्रांसथ्लंटिक साइट, प्रतिरक्षा क्षमता की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण हो सकती है ( उदाहरण के लिए, यदि कोई शोधकर्ता स्ट्रॉमल के प्रभावों का अध्ययन कर रहा है ट्यूमर के विकास पर सूक्ष्म वातावरण) इस परिदृश्य में,नव विकसित, प्रतिरोधी ट्यूमर ट्रांसप्लांटेशन 11 के प्रदर्शन के लिए प्रतिरक्षा-कमी वाले ज़ेब्राफ़िश मॉडल अधिक उपयुक्त हो सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग ट्यूमर सेल प्रतियोगिता एशेज करने और दोहरे लेबल वाले ट्यूमर को इंजेक्षन करने के लिए किया गया है। ट्यूमोरिजिनेसिस पर रासायनिक यौगिकों की प्रभावशीलता के आकलन के लिए एक संभावित उपचार रणनीति, जिसमें दवाओं को पानी में जोड़ने के माध्यम से भ्रूण के बाद ट्रांसप्लांट का उपचार शामिल है, पर भी चर्चा की गई थी। प्रत्यारोपण से पहले ट्यूमर कोशिकाओं के पूर्व विवो उपचार के लिए एक विधि भी पहले 17 की सूचना मिली थी। इसके अतिरिक्त, प्रत्यारोपित ट्यूमर को पुन: प्रत्यारोपण के कई दौरों के लिए जोड़ा गया है, जो ट्यूमर के विकास और केमोरेसिस्टेंस 17 के अध्ययन के लिए फायदेमंद होगा। वर्तमान में, पूर्व-नैदानिक ​​अध्ययन संभावित रूप से यौगिकों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए माउस एक्सनोग्राफ्ट पर निर्भर हैं। हालांकि, ये अध्ययन समय-उपभोक्ता हैंऔर महंगा Zebrafish और मनुष्यों 28 के बीच ओंकोजेनिक संकेत मार्गों के उच्च स्तर के संरक्षण को ध्यान में रखते हुए, यह उम्मीद है कि इस पद्धति में पूर्व-नैदानिक ​​और नैदानिक ​​परीक्षणों में प्रवेश करने वाले प्रभावी यौगिकों की अधिक तेज़ पहचान की अनुमति देने के लिए पारंपरिक माउस और मानव कोशिका के अध्ययन को पूरा किया जाएगा। अंततः, यह विधि प्राथमिक रोगी ट्यूमर की तेजी से रासायनिक जांच के लिए उपयोगी साबित हो सकती है, जो व्यक्तिगत चिकित्सा पहल को आगे बढ़ा सकती है। हालांकि, zebrafish (वयस्क या भ्रूण) में मानव कोशिकाओं की दीर्घकालिक वृद्धि के लिए अभी भी पहचान की आवश्यकता है

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट समीक्षाओं और पांडुलिपि में सुधार के लिए दो समीक्षकों का धन्यवाद करते हैं। हम पशुपालन और रखरखाव के लिए हंट्समान कैंसर संस्थान / यूटा विश्वविद्यालय भी धन्यवाद करते हैं। यह काम अमेरिकी कैंसर सोसाइटी (# 124250- आरएसजी-13-025-01-सीएसएम), एनआईएच अनुदान (पी 30 सीए 0442014 सीआरआर प्रोग्राम), यूटा विश्वविद्यालय यूके बीज ग्रांट, और हंट्समान कैंसर फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg water in house maintaining embryos, making injection plate 
Methylene Blue  Sigma-Aldrich M9140 add to egg water to prevent fungal growth
Petri dish Thermo Fisher FB0875711Z  housing embryos, making injection plate
50 mL  beaker (2 inch diameter) Any commercial brand making injection plate
Agarose Denville CA3510-8 making injection plate
Glass Container Any commercial brand making injection plate
Tweezers Fine Science Tools 11295-10 tumor dissection
Razor Blade Thermo Fisher 12640 needle preparation, tumor dissection
Glass slide wrapped in parafilm Any commercial brand needle preparation
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 Life Technologies 10010023 tumor resuspension
Cell strainer, 40 µm Corning Falcon 352340 tumor resuspension
1,000 µL filter tips any commercial brand tumor resuspension
100 µL filter tips any commercial brand tumor resuspension
50 mL conical tubes Genesee Scientific  21-108 tumor resuspension
15 mL conical tubes Genesee Scientific  21-103  tumor resuspension
1.7 mL microtubes Genesee Scientific  24-281 tumor resuspension
Micropipettes Any commercial brand tumor resuspension and transplantation
Glass capillary (no filament) World Precision Instruments  TW120-4 tumor transplantation
Needle puller Sutter Instruments P-97 tumor transplantation
Microloader tips Eppendorf 930001007 tumor transplantation
Microinjector Harvard Apparatus PLI-90 tumor transplantation
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical TRS1 tumor transplantation, anesthetic
Angled Probe Fine Science Tools 10140-02 embryo manipulation
Transfer Pipette Any commercial brand embryo manipulation
Centrifuge Eppendorf 5810R required during tumor resuspension
Microcentrifuge Eppendorf 5424 required during tumor resuspension
Stereomicroscope Olympus SZ61 tumor transplantation
Fluorescent Stereomicroscope Olympus SZX16 imaging tumor transplants
Microscope Camera Olympus DP-72 imaging tumor transplants
Methylcellulose  Sigma-Aldrich M7140 imaging tumor transplants
Incubator Any commercial brand maintaining embryos, warming up injection plate
Microwave Any commercial brand making injection plate
Scale Any commercial brand making injection plate
Gloves Any commercial brand all aspects of the protocol
Low Melt Agarose Any commercial brand confocal imaging of embryos
Glass Bottom Dish Mattek Corporation P35G-1.0-20-C confocal imaging of embryos
Laser-scanning confocal microscope Olympus FLUOVIEW FV1200 confocal imaging of embryos
Pronase Roche Diagnostics 11459643001 dechorionate embryos
PBS Any commercial brand resuspend tumor/tumor cells
12-well plate Any commercial brand drug treatment of embryos
Thin-bore transfer pipette Any commercial brand drug treatment of embryos
Hemocytometer Any commericial brand For counting tumor cells in suspension
N2 Any commericial brand For microinjector set up

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References

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Casey, M. J., Modzelewska, K.,… More

Casey, M. J., Modzelewska, K., Anderson, D., Goodman, J., Boer, E. F., Jimenez, L., Grossman, D., Stewart, R. A. Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response. J. Vis. Exp. (123), e55712, doi:10.3791/55712 (2017).

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