Summary
Этот протокол обеспечивает анализ субпопуляций макрофагов в центральной нервной системе взрослого человека с помощью проточной цитометрии и полезен для изучения множественных маркеров, экспрессируемых этими клетками.
Abstract
Многочисленные исследования продемонстрировали роль иммунных клеток, в частности макрофагов, в патологиях центральной нервной системы (ЦНС). В ЦНС имеются две основные популяции макрофагов: (i) микроглия, которые являются резидентными макрофагами ЦНС и получены из предшественников желточного мешка во время эмбриогенеза, и (ii) макрофаги, полученные из моноцитов (MDM), которые могут проникать ЦНС во время болезни и происходят от предшественников костного мозга. Роли каждой субпопуляции макрофагов различаются в зависимости от исследуемой патологии. Кроме того, нет консенсуса относительно гистологических маркеров или отличительных критериев, используемых для этих субпопуляций макрофагов. Однако анализ профилей экспрессии маркеров CD11b и CD45 методом проточной цитометрии позволяет отличить микроглию (CD11b + CD45 med ) от MDM (CD11b + CD45 high ). В этом протоколе показано, что центрифугирование градиента плотностиИ анализ проточной цитометрии может быть использован для характеристики этих субпопуляций макрофагов ЦНС и изучения нескольких интересующих маркеров, выраженных этими клетками, как мы недавно опубликовали. Таким образом, этот метод может способствовать нашему пониманию роли макрофагов в мышиных моделях неврологических заболеваний и может также использоваться для оценки воздействия лекарств на эти клетки.
Introduction
Микроглия представляют собой паренхиматозные резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС). Они играют две ключевые функциональные роли: иммунную защиту и поддержание гомеостаза ЦНС. В отличие от MDM, которые постоянно обновляются из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, микроглиальные клетки дифференцируются от примитивных гемопоэтических клеток-предшественников, происходящих из желточного мешка (YS), которые колонизировали мозг во время эмбрионального развития 1 , 2 , 3 . У грызунов фактор транскрипции Myb играет решающую роль в развитии всех моноцитов и макрофагов, полученных из костного мозга, но для микроглии, полученной из YS, этот фактор невозможен и дифференциация остается зависимой от фактора транскрипции PU.1 4 .
В здоровой ЦНС микроглия являются динамическими клетками, которые постоянно пробовали окружающую среду, scaNning и съемки для инвазионных патогенов или повреждения тканей 5 . Обнаружение таких сигналов инициирует путь к разрешению травмы. Микроглия быстро переключается с разветвленной морфологии на амебоидную, за которой следуют фагоцитоз и высвобождение различных медиаторов, таких как про-или противовоспалительные цитокины. Таким образом, в зависимости от их микроокружения активированная микроглия может приобретать спектр различных состояний прайминга.
Микроглии глубоко влияют на развитие и прогрессирование многих неврологических расстройств. Показано, что в моделях грызунов болезни Альцгеймера (AD) 7 , амиотрофическом боковом склерозе (АЛС) 8 , рассеянном склерозе (РС) 9 или болезни Паркинсона (ПД) 10 микроглия играет двойную роль, либо индуцируя пагубную нейротоксичность, либо действуя В нейропротекторном режиме, который зависит отN конкретное заболевание, стадию заболевания и зависит ли заболевание от системного иммунного отделения 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Большинство поражений ЦНС, наблюдаемых при перечисленных выше заболеваниях, содержат гетерогенную популяцию миелоидных клеток, включая не только паренхиматозную микроглию, но также периваскулярные и менингиальные макрофаги, а также ЦНС, проникающие в МДМ. Эти типы клеток могут дифференциально вносить свой вклад в патофизиологические механизмы, связанные с травмой и восстановлением 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Нынешняя задача исследователей, изучающих эти модели болезней, заключается в том, чтобы установить, проникают ли периферические моноциты и макрофаги в ЦНС, и если да,Пахать резидентную микроглию из этих клеток. Действительно, микроглиальные клетки очень пластичны; Когда они активируются, микроглии повторно выражают маркеры, которые обычно экспрессируются периферическими моноцитами и макрофагами. Поэтому проблема связана с идентификационными маркерами, которые могут отличать резидентную микроглию от инфильтрирующих моноцитов и макрофагов.
Различение этих популяций на срезах мозга с помощью иммуногистологических применений ограничено из-за отсутствия специфических антител. Однако проточный цитометрический анализ является эффективным методом оценки экспрессии нескольких маркеров и различения клеточных популяций (например, лимфоцитов, макрофагов / MDM CD11b + CD45 и микроглии CD11b + CD45 med ), а также субпопуляций клеток 16 , 17 , 18 . В этом протоколе описаны процедуры выделенияМононуклеарных клеток из ЦНС у мышей в моделях неврологических заболеваний с использованием оптимизированной диссиации ферментативной ткани и центрифугирования градиента плотности; А также способ дифференциации популяций микроглии и МДМ в ЦНС с использованием проточной цитометрии.
Другой подход заключается в том, чтобы устранить миелин и очистить клетки с помощью магнитных гранул, конъюгированных с конкретными антителами 19 , 20 , 21 . Удаление миелина с использованием антимиелиновых магнитных шариков является более дорогостоящим и влияет на жизнеспособность и выход изолированных клеток 22 . Эта стадия и следующее иммуномагнитное разделение микроглии ограничивают дальнейшие исследования конкретных популяций иммунных клеток 21 , 22 .
Эти процедуры обеспечивают простой способ изучения субпопуляций макрофагов при развитии болезней иДля определения эффектов лекарственного средства или модификаций генов на фенотипах макрофагов и состояниях активации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных в Институте ICM и Дарвинским французским комитетом по этике животных и охватываются протоколом 01407.02.
1. Подготовка
- Подготовьте коктейль для пищеварения в пробирке объемом 1,5 мл, объединив для каждой мыши следующее: 1 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS); 123 мкл фермента пищеварения (см. Таблицу материалов) при 13 мкг / мл (исходный раствор), конечная концентрация 1,6 Вт / мл; И 5 мкл ДНКазы I (см. Таблицу материалов) при 100 мг / мл (исходный раствор), конечная концентрация 0,5 мг / мл.
2. Перфузия и рассечение
- Усыплять мышей смертельной дозой пентобарбитала (100 мкл при 400 мг / мл).
- Поместите животное в положение на спине и намочите тело 70% этанолом.
- Разрежьте брюшную кожу тонкими ножницами чуть ниже ксифоидного процесса, чтобы обнажить грудную кавитуу.
- Сделайте разрез в диафрагме и разрежьте боковые стороны грудной клетки с помощью тонких ножниц на каудальном ростральном направлении, чтобы выставить сердце (и не обрезать другие органы). Определите левый желудочек (LV) и правый атриум (RA).
- Вставьте катетер бабочки с иглой 25 G внутри LV. Сделайте разрез на RA с помощью тонких ножниц и в начале кровотока, начните перфузию со скоростью 10 мл / мин через LV с 20 мл PBS для удаления клеток и крови из сосудов; Успешная перфузия отмечена бланшированием легких и печени при смещении крови.
- Обезглавить животное средними ножницами. Рассекайте позвоночник с помощью тонких ножниц и отделите его от тела, вырезая мускулатуру брюшной стенки на вентральной стороне позвоночника и разрезая позвоночную колонку у основания хвоста.
- Вставьте 10 мл шприц, содержащий PBS, и установленный 200 мкл наконечник пипетки в поясничную сторонуПозвоночника и смыть спинной мозг со стороны шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Наконечник пипетки 200 мкл разрезают ножницами на самом широком конце (приблизительно 1 см) и плотно вставляют в 10 мл шприц, предварительно заполненный PBS. - Удалите кожу над черепом и используйте щипцы, чтобы обнажить мозг. Вставьте ножницу в основание черепа и разрежьте череп после сагиттального шва. Вставьте маленькие щипцы в разрез и осторожно поднимите череп. Превратите мозг из головы мыши и удалите обонятельную луковицу и мозжечок.
- Соберите мозг и спинной мозг в 1,5 мл пробирке, содержащей 1,128 мл PBS с пищеварительным коктейлем (с шага 1.1).
3. Диссоциация клеток
- Мелко разрезать мозг и спинной мозг в пробирке 1,5 мл (шаг 2.9) на 1-2 мм 3 шт. С маленькими ножницами ( рис. 1 ).
- Инкубируйте 1,5 мл пробирку, содержащую измельченные ткани, в течение 30 мин в инкубатореПри 37 ° С с 5% CO 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте градиент плотности на этом этапе. - Добавьте 20 мкл 0,5 М ЭДТА (исходный раствор), конечная концентрация 10 мМ, в пробирку объемом 1,5 мл, чтобы остановить ферментативную реакцию.
- Аккуратно сделайте клеточную суспензию пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки объемом 5 мл.
- Пропустите клеточную суспензию через нейлоновую сетку (размер пор 70 мкм) в трубке объемом 50 мл, используя плунжер из 10 мл шприца.
- Промыть нейлоновой сеткой 20 мл 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) -PBS.
- Центрифугируют в течение 7 мин (300 xg) при комнатной температуре (18 ° C). Отбросьте супернатант путем аспирации и перейдите к следующему шагу. Будьте предельно осторожны при удалении надосадочной жидкости; Не мешайте таблетке, которую можно легко отсасывать с помощью аспирационной пипетки.
4. Градиент плотности
- Подготовьте исходный раствор среды градиента плотности, добавив соответствующее количество 10х PBS к среде градиента плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ. Добавьте одну часть 10X PBS к девяти частям градиента плотности. - Разбавьте среду градиента плотности запаса с 1x PBS для разных процентных значений, как описано в таблице 1 .
- Ресуспендируют гранулу (с шага 3.7) с 4 мл 30% -ной плотности градиентной среды и переносят в пробирку объемом 15 мл.
- Поместите пипетку Пастера в нижнюю часть 15-миллилитровой трубки и медленно подложите 4 мл 37% -ной плотности градиентной среды.
- Добавить 4 мл 70% -ной плотности градиентной среды, как описано выше.
- Центрифугируют градиент в течение 40 минут (800 xg) при комнатной температуре (18 ° C). Убедитесь, что центрифуга останавливается с минимальным или отсутствующим торможением, так что интерфаза не нарушена.
ПРИМЕЧАНИЕ. Трубка будет выглядеть стратифицированной. Клетки, слоистые на границе градиента плотности 70% - 37%, представляют собой мононуклеарные иммунные клетки (подгруппы микроглии и макрофагов); Верхние уровни - это клеточный дебрис и миелин, соответственно ( рис. 2 ). - Соберите 3-4 мл 70-37% -ной градиентной градиентной плотности, содержащей клетки субпопуляций макрофагов, в чистую пробирку объемом 15 мл.
- Промыть клетки 3 раза с помощью PBS, общий объем 15 мл. Удостоверьтесь, что среда с градиентом плотности, содержащая клетки, разбавляется по меньшей мере три раза PBS и центрифугируется в течение 7 минут (500 xg, 4 ° C) при включенном торможении.
- Ресуспендируют клеточный осадок с 1 мл PBS для клеточной маркировки или для других функциональных анализов.
5. Маркировка клеток для проточной цитометрии
- Перенесите клетки (этап 4.10) в проточную цитометрию.
- Добавьте 1 мкл фиксируемого реагента для окрашивания мертвых клеток к каждому образцу ячейки, полученному на этапе 4.10. Инкубируйте в течение 30 мин на льду, защищенном от света.
- Промывают клетки один раз 2 мл PBS и центрифугируют в течение 5 минут (300 xg, 4 ° C).
- Удаляют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок с400 мкл PBS 1% BSA, 0,1% азида.
- Добавьте 1 мкг CD16 / CD32 антител к 100 мкл клеток, чтобы блокировать Fc-рецепторы. Инкубируйте 10-15 мин на льду, защищенный от света.
- Подготовьте смесь первичных антител в PBS 1% BSA, 0,1% азида или PBS 1% BSA, 0,1% азида, 0,25% сапонина, для клеточной пермеабилизации для внутриклеточного окрашивания.
- Добавьте 100 мкл первичных антител (2x) и инкубируйте в течение 30 мин на льду, защищенных от света.
ПРИМЕЧАНИЕ. Все антитела должны быть титрованы до проведения эксперимента для обеспечения оптимальных результатов. - Промывают клетки 2 мл PBS и центрифугируют в течение 5 минут (300 xg, 4 ° C). Повторите этот шаг три раза.
- Добавьте 100 мкл вторичного антитела, если первичные антитела непосредственно не конъюгированы с флуорофором и инкубируют в течение 30 мин на льду, защищенные от света.
- Промывают клетки 2 мл PBS и центрифугируют в течение 5 мин при 300 × g при 4 ° C). Повторите этот шаг три раза.
- ИсправьтеКлетки с 100 мкл 1% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре, защищенные от света.
ПРИМЕЧАНИЕ. Предупреждение: PFA токсичен. Используйте в вытяжном шкафу и надевайте средства индивидуальной защиты. - Промывают клетки 2 мл PBS и центрифугируют в течение 5 мин при 300 × g при 4 ° C. Повторите этот шаг три раза.
- Ресуспендируют клеточный осадок с помощью 200 мкл PBS и приступают к приобретению и анализу проточной цитометрии. Следуйте стратегии стробирования на рисунке 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После центрифугирования градиента плотности и окрашивания антител клетки были получены на проточном цитометре и проанализированы с использованием стратегии морфологического стробирования следующим образом. Первый затвор был определен в области прямой развертки (FSC-A) с точечной графикой по сравнению с форвардной-рассеянной-высотой (FSC-H), чтобы различать отдельные ячейки из дублетов ( рисунок 3A ). Затем одиночные клетки были закрыты на участках точек FSC-A и Side-Scattered-Area (SSC-A), чтобы исключить клеточный дебрис и пикнотические клетки на основе относительного размера клеток и гранулярности клеток ( фиг. 3B ). Затем микроглии и MDM были определены на основе их уровней экспрессии маркеров CD11b и CD45 ( рисунок 3C , 3D ). Наконец, другие экспрессирующие маркеры были проанализированы для каждой субпопуляции макрофагов ( рис. 3Е- 3G ). МикроглюСообщалось, что ia выражают CX3CR1, но не маркер CCR2, в отличие от MDM 23 . Недавно было продемонстрировано, что Tmem119 является специфическим маркером для микроглии 19 . Следующие метки (Tmem119, CX3CR1 и CCR2) оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием детекторных антител, специфичных для каждого маркера; Было показано, что все клетки CD11b + CD45 были положительными для маркеров Tmem119 и CX3CR1, но не для маркера CCR2, который подтверждает эту стратегию стробирования ( рисунок 3E -3G ).
В отсутствие изолированности градиента плотности субпопуляции макрофагов не могли быть определены на графике точек FSC-A по сравнению с SSC-A из-за присутствия многих клеток и миелинового мусора ( рис. 3H ). Следует отметить, что пермеабилизационная обработка индуцирует усадку клеток, и, таким образом, субпопуляции макрофагов появились см( Фиг.3I , J ), как описано ранее 24 . Жизнеспособность клеток определяли с использованием фиксированного набора для окрашивания мертвых клеток. После градиента плотности 85-95% клеток живы ( рис. 3K ). Микрокли и МДМ-популяции могут быть определены маркерами CD45 и CD11b на точечном участке после выделения клеток головного и спинного мозга в одном образце ( рис. 3L ), а также только от головного или спинного мозга ( рисунок 3M , 3N ).
Для мечения с проточной цитометрией важно знать, является ли белок и / или эпитоп, распознаваемый антителом, внутри- или внеклеточным. В случае внутриклеточных антигенов необходим буфер проницаемости. Tmem119 представляет собой трансмембранный белок, но распознанный эпитопПо пятнам антител как внутриклеточное 19 . В отсутствие проницаемости клеток не было никакой маркировки ( рис. 3O ). Отсутствие этого шага проницаемости может привести к ложным отрицательным результатам. Поскольку антитело Tmem119 не конъюгировано непосредственно с флуорофором, клетки были помечены вторичным антителом; Отрицательный контроль был только вторичным антителом (черная линия) ( фиг. 3Е , 3O-3R ). Когда используются антитела с прямым конъюгированием, существуют две основные стратегии для оценки специфической маркировки: антитела к изотипу как отрицательный контроль или контроль флуоресценции минус один (FMO). Органы управления FMO содержат все маркирующие антитела в смеси, за исключением контрольного антитела для этого образца. Таким образом, для каждого маркера необходим контроль FMO, тогда как для контроля изотипных антител требуется только одна меченая смесь. Для маркировки мозговых иммунных клеток мы выбрали изотYpe антитела, поскольку ограниченное количество клеток (400 000 клеток) получают после градиента плотности из одного мозга мыши.
Рисунок 1: Этапы процедуры диссоциации клеток. ( A ) Ткань помещалась в пробирку с ферментами для коктейлей с пищеварением. ( B ) Ткань была тонко нарезана на мелкие кусочки ножницами. ( C ) Маленькие кусочки ткани инкубировали в течение 30 минут (37 ° C) для эффективного расщепления тканей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема градиента плотности после CenTrifugation Step. После центрифугирования миелин присутствует в верхней части градиента плотности, а иммунные клетки, содержащие популяции макрофагов, находятся на межфазной границе между слоями градиента плотности 37% и 70%. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативный проточный цитометрический анализ макрофагов. Была применена логическая стратегия стробирования: ( A ) Двойная дискриминация относится к графику точек FSC-A по сравнению с FSC-H. ( B ) Стратегия морфологического стробирования относится к графику точек FSC-A по сравнению с SSC-A. ( C ) Субпопуляции макрофагов относятся к участку участка CD45 по сравнению с CD11b. ( D ) Точечный график клеток staС изотипными антителами в качестве контроля для окрашивания CD45 и CD11b. Анализ маркеров, выраженных этими двумя субпопуляциями макрофагов: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) и CCR2 ( G ) (100 000 событий в затворе P2 были получены). Точечные графики, показывающие размер ячейки (FSC-A) и зернистость (SSC-A) клеток головного и спинного мозга до градиента плотности ( H ) или после выделения градиента плотности и с пермеабилизирующей обработкой ( I ) или без ( J ) , ( K ) Гистограмма проточной цитометрии иллюстрирует процент мертвых клеток после градиента плотности. Ворота, показанные на точечных графиках, иллюстрируют популяцию микроглии CD11b + CD45 и большую долю МДМ CD11b + CD45 в головном и спинном мозге ( L ) или в мозге ( M ) или спинном мозге ( N ) отдельно. Анализ выраженного Tmem119Субпопуляциями макрофагов в клетках головного и спинного мозга, пермеабилизированных ( O ) или непермебализованных ( P ), и в мозге ( Q ) или в клетках, проницаемых для спинного мозга ( R ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Объем для 1 трубки (мл) | Плотность градиентной среды 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Плотность градиентной среды 30% | 1,5 | 0,15 | 3,35 |
| Плотность градиентной среды 37% | 1,85 | 0,185 | 2,965 |
| Плотность градиентной среды 70% | 3,5 | 0,35 | 1,15 |
Таблица 1: Состав разных процентов градиента плотности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Было продемонстрировано, что микроглия и МДМ имеют различные функции и фенотипы в ЦНС, и поэтому идентификация и анализ этих субпопуляций макрофагов необходимы для лучшего понимания неврологических заболеваний 9 , 18 , 25 . Анализ проточной цитометрии с использованием двух маркеров (CD11b и CD45) позволяет проводить различие между каждой субпопуляцией ( рис. 3C ). Ранее эта стратегия была проверена с использованием других специфических маркеров, таких как CCR2 для MDM и CX3CR1 для микроглии, и недавно разработанный подход с антителом к Tmem119 ( рисунок 3E - 3G ). Мы провели эксперименты с антителами CCR2 и CX3CR1 ( рис. 3F , 3G ), как мы ранее опубликовали 18 . CD11b + CD45Средняя популяция сильно выражена Tmem119 и CX3CR1, но не CCR2 в отличие от высокой популяции CD11b + CD45. Высокая популяция CD11b + CD45 состоит из различных субпопуляций с экспрессией CCR2 или без нее. Идентификация и характеристика этих субпопуляций макрофагов (периваскулярные макрофаги, инфильтрирующие макрофаги и т. Д. ) Являются обширной областью исследований. Кроме того, маркеры для этих популяций могут изменяться в зависимости от патологических процессов. Действительно, CCR2 снижается, когда моноциты пересекают гематоэнцефалический барьер 26 .
Антитела CD45 и CD11b распознают клеточные поверхностные антигены, поэтому пермеабилизация не нужна. Поэтому этот метод можно также использовать для очистки каждой субпопуляции макрофагов путем сортировки клеток для анализа мРНК или других функциональных анализов. Следует отметить, что использование фермента и градиента плотностиМожет вызвать, в определенной степени, активацию микроглии. Ранее мы отмечали, что после выделения микроглия и макрофаги экспрессируют индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS). Тем не менее, повышенный уровень экспрессии iNOS, наблюдаемый в патологическом и нормальном состоянии, можно выделить с помощью этого метода 18 . Кроме того, этот метод обеспечивает хорошо разделенную клеточную популяцию (синглеты) с высокой долей живых клеток.
Для успешной репликации этого протокола существует несколько критических параметров. Настройка градиента является наиболее важной. Наш опыт показывает, что подготовка градиентов в 15 мл пробирках по сравнению с 50 мл обеспечивает лучшее отделение. Если в интерфейсе 70-37% не видно клеток, следует рассмотреть количество ткани ЦНС, используемое для изоляции клеток. Обычно мы собираем ~ 400 000 клеток из одного мозга мыши. Хотя этот выход колеблется от различных условий экспериментаS, один для лучшей визуализации интерфейса 70-37% - это сделать слой градиента плотности с плотностью 37% с PBS и фенольным красным.
С помощью различных лазеров и фильтров в проточном цитометре этот протокол может количественно определять несколько маркеров, выраженных каждой из субпопуляций 18 макрофагов. Этот метод также полезен для оценки участия других иммунных клеток, таких как Т-клетки и В-клетки в одном и том же образце. Действительно, методы, использующие иммуномагнитное обогащение, допускают только изучение ранее отобранных популяций 21 .
В целом, этот метод представляет собой полезный инструмент для характеристики различных субпопуляций макрофагов на мышиных моделях неврологических заболеваний. Эта уникальная альтернатива может оценить влияние лечения на воспалительные процессы в патологических состояниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Ассоциации France Alzheimer и Bpifrance. Наша лаборатория также поддерживается Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie и программой «Investissements d'avenir» ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Мы хотели бы поблагодарить помощь основного объекта культуры CELIS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
