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Immunology and Infection

फ्लो साइटोमैट्री द्वारा सेंट्रल नर्वस सिस्टम से माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का विश्लेषण

Published: June 22, 2017 doi: 10.3791/55781
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3
1Inserm U 1227, CNRS UMR 7225, 2Sorbonne Universités, UPMC, University of Paris, 3Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 4AP-HP, Hôpital de la Pitié Salpêtrière;

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रवाह कोशिका द्वारा वयस्क माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में मैक्रोफेज उप-जनसांख्यिकी का एक विश्लेषण प्रदान करता है और इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए कई मार्करों के अध्ययन के लिए उपयोगी है।

Abstract

कई अध्ययनों ने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) विकृतियों में विशेष रूप से मैक्रोफेज में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का प्रदर्शन किया है। सीएनएस में दो मुख्य बृहतभक्षककोशिका आबादी हैं: (i) माइक्रोलिया, जो सीएनएस के निवासी मैक्रोफेज हैं और भ्रूणजनन के दौरान जर्दी कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, और (ii) मोनोसाइट डेरेक्टेड मैक्रोफेज (एमडीएम), जो घुसपैठ कर सकता है बीमारी के दौरान सीएनएस और अस्थि मज्जा प्रजनन से ली गई हैं। प्रत्येक मैक्रोफेज उप-जनसंख्या की भूमिका का अध्ययन किया जा रहा विकृति पर निर्भर करता है। इसके अलावा, हिस्टोलल मार्करों पर कोई आम सहमति नहीं है या इन मैक्रोफेज उप-जनसंख्या के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट मापदंड हैं। हालांकि, फ्लो साइटमैट्री द्वारा सीडी 11 बी और सीडी 45 मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण हमें एमडीएम (सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च ) से माइक्रोग्लिया (सीडी 11 बी + सीडी 45 एमडी ) में अंतर करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि घनत्व ढाल केन्द्रापरक्षाऔर प्रवाह साइटेमेट्री विश्लेषण का उपयोग इन सीएनएस बृहतभक्षककोशिका उप-पोपों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, और हाल ही में प्रकाशित किए गए इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए ब्याज के कई मार्करों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, यह तंत्र तंत्रिका संबंधी रोगों के माउस मॉडल में मैक्रोफेज की भूमिका को समझने के लिए और इन कोशिकाओं पर दवा प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

माइक्रोलिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के पैरेन्चिमल टिशू-निवासी मैक्रोफेज हैं वे दो प्रमुख कार्यात्मक भूमिकाएं निभाते हैं: सीएनएस होमोस्टैसिस की प्रतिरक्षा रक्षा और रखरखाव। एमडीएम के विपरीत, जो अस्थि मज्जा में हीमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं से लगातार नए सिरे हुए होते हैं, माइक्रोग्लियल कोशिकाएं ग्रीक विकास 1 , 2 , 3 के दौरान मस्तिष्क में उपनिवेश करते हुए जर्दी के थैली (वाईएस) में पैदा होने वाले आदिम हेमटोपोएटिक पूर्व कोशिकाओं से अंतर करती हैं। कृन्तकों में, प्रतिलेखन कारक मायब सभी अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन वाईएस व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया के लिए, यह कारक अवयव है और भेदभाव प्रतिलेखन कारक पर निर्भर करता है PU.1 4 ।

स्वस्थ सीएनएस में, माइक्रोलिया गतिशील कोशिकाएं हैं जो लगातार अपने पर्यावरण का नमूना करते हैं, स्कैरोगी या ऊतक क्षति पर हमला करने के लिए एनएनजी और सर्वेक्षण इस तरह के संकेतों का पता लगाने के लिए चोट को हल करने के लिए एक मार्ग की शुरुआत की गई। माइक्रोग्लिया तेजी से एक वर्गीकृत आकारिकी से एक एमोइबियस से स्विच करता है, जिसके बाद फॅगोसिटासिस और विभिन्न मध्यस्थों की रिहाई होती है, जैसे समर्थक या विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स। इस प्रकार, उनके microenvironment, सक्रिय microglia के आधार पर अलग भड़काना राज्यों के एक स्पेक्ट्रम प्राप्त कर सकते हैं 6

माइक्रोग्लिया कई न्यूरोलोलॉजिकल विकारों के विकास और प्रगति पर गहरा प्रभाव डालता है। अल्जाइमर रोग (एडी) 7 , एमीओट्रॉफ़िक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) 8 , मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) 9 या पार्किंसंस रोग (पीडी) 10 के कृंतक मॉडल में, माइक्रोग्लिया को दोहरी भूमिका निभाने के लिए दिखाया जाता है, या तो हानिकारक न्यूरोटॉक्सिसिटी या अभिनय एक न्यूरोप्रोटेक्टिव तरीके से, जो कि ओ पर निर्भर हैविशिष्ट बीमारी, बीमारी के चरण, और क्या यह रोग प्रणालीगत प्रतिरक्षा कम्पार्टमेंट 7 , 8 , 9 , 10 , 11 से प्रभावित था। ऊपर बताए गए रोगों में देखा गया सीएनएस घावों में से अधिकांश माइेलॉयड कोशिकाओं की विषम आबादी में शामिल हैं, जिसमें न केवल पैरेन्चिमल माइक्रोग्लिया शामिल है, बल्कि परिधीय और मैनिन्जियल मैक्रोफेज तथा साथ ही सीएनएस-घुसपैठिंग एमडीएम भी शामिल हैं। ये कोशिका प्रकार चोटों और 7 , 12 , 13 , 14 , 15 की मरम्मत के लिए पथोफिज़ियोलोगिक तंत्र में भिन्न रूप से योगदान कर सकते हैं। इन रोग मॉडल का अध्ययन करने वाले जांचकर्ताओं के लिए मौजूदा चुनौती यह है कि क्या परिधीय मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज सीएनएस को घुसपैठ करते हैं और यदि ऐसा है, तो क्याइन कोशिकाओं से निवासी माइक्रोग्लिया को समझें वास्तव में, माइक्रोग्लियल कोशिका बहुत ही प्लास्टिक हैं; जब वे सक्रिय हो जाते हैं, तो माइक्रोग्लिया पुनः एक्सप्रेस मार्कर जिन्हें आमतौर पर परिधीय मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त किया जाता है। इसलिए यह मुद्दा उन मार्करों की पहचान करने पर निर्भर करता है जो घुसपैठ मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज से निवासी माइक्रोग्लिया को अलग कर सकते हैं।

प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुप्रयोगों द्वारा मस्तिष्क स्लाइस पर इन आबादी का भेदभाव विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी के कारण सीमित है। हालांकि, प्रवाह चिन्हित विश्लेषण कई मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए और सेल आबादी (उदाहरण के लिए, लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज / एमडीएम सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च , और माइक्रोग्लिया सीडी 11 बी + सीडी 45 एमडी ) के साथ-साथ सेल उप-प्रजातियां 16 , 17 , 18 यह प्रोटोकॉल अलग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता हैएक अनुकूलित, एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण और एक घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग करके तंत्रिका संबंधी रोग मॉडल में माउस सीएनएस से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं; साथ ही, फ्लो साइटमैट्री का उपयोग करके सीएनएस में माइक्रोग्लिया और एमडीएम आबादी को अलग करने के लिए एक विधि।

एक और तरीका है माइेलिन को खत्म करने और विशिष्ट एंटीबॉडी 19 , 20 , 21 के लिए संयुग्मित चुंबकीय मोती का उपयोग करके कोशिकाओं को शुद्ध करना। माइेलिन एंटी-मायेलिन चुंबकीय मोती का उपयोग करना अधिक महंगा है और व्यवहार्यता और पृथक कोशिकाओं 22 की उपज को प्रभावित करता है। यह कदम और माइक्रोग्लिया के निम्नलिखित इम्युनोमॅग्नेटिक जुदाई, विशिष्ट प्रतिरक्षा सेल आबादी 21 , 22 के आगे के अध्ययन को सीमित करें।

बीमारी के विकास में मैक्रोफेज उप-जनसंपर्क का अध्ययन करने के लिए ये प्रक्रियाएं एक आसान तरीका प्रदान करती हैं, औरमैक्रोफेज फेनोोटाइप और सक्रियण राज्यों पर दवा प्रभाव या जीन के संशोधन को निर्धारित करने के लिए।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को आईसीएम संस्थान में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति और डार्विन फ्रांसीसी एथिक एनिमल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया है, और प्रोटोकॉल 01407.02 के तहत कवर किया गया है।

1. तैयारी

  1. प्रत्येक माउस के लिए निम्नलिखित को जोड़कर 1.5 एमएल ट्यूब में पाचन कॉकटेल तैयार करें: 1 एमएल फॉस्फेट बुफोर्ड सलाइन (पीबीएस); 13 वाउन्च / एमएल (स्टॉक सोल्यूशन) में 123 माइक्रोन पाचन एंजाइम (सामग्री की तालिका देखें), अंतिम एकाग्रता 1.6 वाउन्स / एमएल; और 5 μL डीएनस 1 (सामग्री की सारणी देखें) 100 मिलीग्राम / एमएल (स्टॉक समाधान), अंतिम एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम / एमएल।

2. छिड़काव और विच्छेदन

  1. चूहों को पेंटोबारबिटल (100 μL पर 400 मिलीग्राम / एमएल) की एक घातक खुराक के साथ मारना।
  2. लापरवाह स्थिति में पशु रखें और 70% इथेनॉल के साथ शरीर को गीला करें।
  3. वक्षग्रस्त कैविट का पर्दाफाश करने के लिए एक्स-डायफ़ोइड प्रक्रिया के ठीक नीचे ठीक कैंची के साथ उदर त्वचा को काटेंy।
  4. डायाफ्राम में एक चीरा बनाएं और रिब पिंजरे के पार्श्व के पहलुओं को काटकर ठीक कैंसर के साथ एक दुलहरी को दिल का पर्दाफाश करने के लिए दिल का पर्दाफाश करें (और अन्य अंगों को काटने से बचें)। बाएं वेंट्रिकल (एलवी) और सही एट्रिअम (आरए) को पहचानें
  5. एल.वी. के अंदर एक 25 जी सुई के साथ एक तितली कैथेटर डालें ठीक कैंची के साथ आरए पर चीरा करें और रक्त प्रवाह की शुरुआत में एलएल के माध्यम से 10 एमएल / मिन फ्लो दर पर छिड़काव शुरू करें, 20 एमएल पीबीएस से कोशिकाओं और रक्त को निकालने के लिए जहाजों से; सफल छिड़काव फेफड़ों और यकृत के ब्लिंचिंग द्वारा विख्यात है क्योंकि रक्त विस्थापित है।
  6. मध्यम कैंची के साथ जानवर को ठोकर खाएं स्पाइनल कॉलम को ठीक कैंची के साथ काटना और रीढ़ की हड्डी के उदर की ओर पेट की दीवार के मांसलता का उत्साह बढ़ाकर और पूंछ के आधार पर कशेरुक स्तंभ को काटने से शरीर से अलग करें।
  7. पीबीएस वाले 10 मिलीलीटर सिरिंज और कंबल के किनारों में घुड़सवार 200 μL विंदुक टिप डालेंरीढ़ की हड्डी का स्तंभ और ग्रीवा पक्ष पर रीढ़ की हड्डी फ्लश।
    नोट: 200 μL विंदुक टिप कैल्शर्स से अपने व्यापकतम अंत (लगभग 1 सेंटीमीटर) में कटौती की जाती है और पीबीएस से भरी 10 एमएल सिरिंज पर कसकर डाला जाता है।
  8. खोपड़ी के ऊपर त्वचा निकालें और मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए संदंश का उपयोग करें। खोपड़ी के आधार पर एक कैंची ब्लेड डालें और बाण के सिवनी के बाद क्रेन काट लें। कट में छोटे संदंश सम्मिलित करें और धीरे से खोपड़ी उठाएं। माउस के सिर से मस्तिष्क काटना और घ्राण बल्ब और सेरिबैलम को हटा दें।
  9. पाचन कॉकटेल (1.1 कदम से) के साथ 1.128 एमएल पीबीएस युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को लीजिए।

3. सेल विसर्जन

  1. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (चरण 2.9) में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को बारीक रूप से छोटा कैंची ( चित्रा 1 ) के साथ 1-2 मिमी 3 टुकड़ों में काट लें।
  2. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से छमाही के ऊतकों को 30 मिनट के लिए सेवन करेंटो में 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2
    नोट: इस चरण पर घनत्व ढाल तैयार करें।
  3. एंजाइमिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब के लिए 20 μL 0.5 एम EDTA (स्टॉक समाधान), अंतिम एकाग्रता 10 मिमी, जोड़ें।
  4. धीरे से एक 5 एमएल विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एक सेल निलंबन बनाते हैं।
  5. एक 10 एमएल सिरिंज के सवार का उपयोग करते हुए 50 एमएल ट्यूब में एक नायलॉन जाल (70 सुक्ष्ममापी आकार) के माध्यम से सेल निलंबन पास करें।
  6. 20 मिलीलीटर के साथ नायलॉन जाल धो लें 5% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) -पीबीएस
  7. कमरे के तापमान पर 7 मिनट (300 xg) के लिए अपकेंद्रित्र (18 डिग्री सेल्सियस) आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें और अगले चरण पर आगे बढ़ें। सतह पर तैरनेवाला हटाने पर बहुत सावधान रहें; गोली परेशान मत करो, जो आसानी से aspirating विंदुक द्वारा aspirated जा सकता है।

4. घनत्व ढाल

  1. घनत्व ढाल के माध्यम से 10x पीबीएस की उचित मात्रा को जोड़कर घनत्व ढाल के माध्यम के शेयर समाधान तैयार करें।
    नोट: एक भाग 10X पीबीएस को नौ भागों घनत्व ढाल मध्यम जोड़ें।
  2. तालिका 1 में वर्णित अनुसार विभिन्न प्रतिशत के लिए 1x पीबीएस के साथ स्टॉक घनत्व ढाल माध्यम को पतला।
  3. 4 मीटर के 30% घनत्व वाले ढाल के माध्यम से गोली को फिर से रुस करें (चरण 3.7 से) और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें।
  4. 15 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे एक पाश्चर पिपेट रखें और धीरे-धीरे 4 एमएल 37% घनत्व ढाल के माध्यम से रखें।
  5. ऊपर वर्णित अनुसार, 4 एमएल का 70% घनत्व ढाल मध्यम जोड़ें।
  6. कमरे के तापमान (18 डिग्री सेल्सियस) में 40 मिनट (800 xg) के लिए ढाल अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि अपकेंद्रित्र कम या ब्रेक के साथ बंद हो जाता है ताकि इंटरफ़ेस परेशान नहीं हो।
    नोट: ट्यूब स्तरीकृत दिखाई देगा 70% - 37% घनत्व ढाल इंटरफेस पर स्तरित कोशिकाओं में मोनोनक्लेक्लेएटेड प्रतिरक्षा कोशिकाएं (माइक्रोग्र्लिया और मैक्रोफेज उप-जनसंख्या) हैं; ऊपरी स्तर क्रमशः सेल मलबे और माइेलिन होते हैं ( चित्रा 2 )।
  7. मैक्रोफेज उप-जननकोश कोशिकाओं को साफ 15 एमएल ट्यूब में युक्त 70-37% घनत्व ढाल अंतरफलक के 3-4 एमएल लीजिए।
  8. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3x धो लें, 15 एमएल की कुल मात्रा सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं युक्त घनत्व ढालदार माध्यम पीबीएस के साथ कम से कम तीन बार पतला हो और ब्रेक पर "7 मिनट (500 xg, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेंटीफ्यूज"।
  9. सेल गोली के लिए या अन्य कार्यात्मक assays के लिए 1 एमएल पीबीएस के साथ सेल गोली resuspend।

5. फ्लो साइटोमेट्री के लिए सेल लेबलिंग

  1. एक प्रवाह cytometry ट्यूब में कोशिकाओं (चरण 4.10) स्थानांतरण।
  2. कदम 4.10 में प्राप्त प्रत्येक सेल नमूने के लिए 1 μL लचीला मृत सेल दाग अभिकर्मक जोड़ें। बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते, रोशनी से सुरक्षित।
  3. कोशिकाओं को एक बार 2 एमएल पीबीएस और 5 मिनट (300 xg, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेंटीफ्यूड धो लें।
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और सेल गोली को फिर से खोलें400 μL पीबीएस 1% बीएसए, 0.1% एजाइड।
  5. एफसी रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए 1 μg सीडी 16 / सीडी 32 एंटीबॉडी को 100 μ एल कोशिकाओं में जोड़ें। बर्फ पर 10-15 मिनट सेते, रोशनी से सुरक्षित।
  6. पीबीएस 1% बीएसए, 0.1% एजाइड या पीबीएस 1% बीएसए, 0.1% एजाइड, 0.25% सैपोनिन, इंट्रासेल्युलर धुंधला हो जाने के लिए सेल परमिटिएजीज़ में प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण (2x) के 100 μL जोड़ें और 30 मिनट से बर्फ पर सुरक्षित रखें, प्रकाश से सुरक्षित।
    नोट: इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग करने से पहले सभी एंटीबॉडीज़ का शीर्षक होना चाहिए।
  8. 2 एमएल पीबीएस और 5 मिनट (300 xg, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेंटीफ्यूज वाले कोशिकाओं को धो लें। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी एक फ्लोरोफोरे से सीधे संयुग्मित नहीं हैं, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, प्रकाश से संरक्षित अगर एक माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें।
  10. 2 मिलीलीटर पीबीएस और 5 मिनट के लिए 300 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को धो लें। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  11. ठीक करेंकमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100 μL 1% पीएफए ​​युक्त कोशिकाओं, प्रकाश से सुरक्षित
    नोट: सावधानी: पीएफए ​​विषाक्त है एक धूआं हुड में इस्तेमाल करें और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  12. 2 मिलीलीटर पीबीएस और 5 मिनट के लिए सेंटीग्यूज को 300 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस पर धोएं। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  13. 200 μL पीबीएस के साथ सेल गोली resuspend और cytometry अधिग्रहण और विश्लेषण प्रवाह करने के लिए आगे बढ़ें। चित्रा 3 में गेटिंग रणनीति का पालन करें

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Representative Results

घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन और एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद, कोशिकाओं को एक प्रवाह कोशिकामीटर पर अधिग्रहण किया गया और निम्न प्रकार की रूपात्मक गेटिंग रणनीति का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। एक प्रथम द्वार को फॉरवर्ड-स्केकटेट-एरिया (एफएससी-ए) बनाम फॉरवर्ड-स्केटेड-ऊँचाई (एफएससी-एच) में दोहरी से एकल कोशिकाओं को भेद करने के लिए डॉट प्लॉट में परिभाषित किया गया था ( चित्रा 3 ए )। तब एकल कोशिकाओं को सापेक्षिक सेल आकार और सेल ग्रैन्युलैरिटी ( चित्रा 3 बी ) के आधार पर, सेल मलबे और पॉयोनोटिक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एफएससी-ए बनाम साइड-स्केकट-एरिया (एसएससी-ए) डॉट प्लॉट पर गेट किया गया था। तब, माइक्रोलिया और एमडीएम की पहचान CD11b और CD45 मार्करों ( चित्रा -3 सी , 3 डी ) के उनके अभिव्यक्ति स्तरों के आधार पर की गई थी। अंत में, प्रत्येक बृहतभक्षककोशिका subpopulation ( चित्रा 3 ई -3 जी ) के लिए अन्य अभिव्यक्ति मार्कर का विश्लेषण किया गया। माइक्रोगआईआईए को सीएक्स 3 सीआर 1 को व्यक्त करने की सूचना मिली लेकिन एमडीएम 23 के विपरीत सीसीआर 2 मार्कर नहीं। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि टीएमएम 11 9 माइक्रोग्लिया 1 9 के लिए एक विशिष्ट मार्कर है। निम्नलिखित मार्कर (टीएमएम 11 9, सीएक्स 3 सीआर 1, और सीसीआर 2) प्रत्येक मार्कर के लिए विशिष्ट डिटेक्टर एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए फ्लो साइटोमैट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया; सभी CD11b + CD45 मेड कोशिकाओं को Tmem119 और CX3CR1 मार्करों के लिए सकारात्मक दिखाया गया था, लेकिन सीसीआर 2 मार्कर के लिए नहीं, जो इस gating रणनीति ( चित्रा 3 ई -3 जी ) को मान्य करता है।

घनत्व ढाल अलगाव की अनुपस्थिति में, मैक्रोफेज उप-जनसंख्या को कई कोशिकाओं और माइेलिन मलबे ( चित्रा 3 एच ) की उपस्थिति के कारण डॉट प्लॉट एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए में परिभाषित नहीं किया जा सकता है। नोट, परिमेयकरण उपचार में एक सेल संकोचन होता है और इस प्रकार मैक्रोफेज उप-जनसंख्या एसएम दिखाई देती हैएसएससी बनाम एसएससी डॉट प्लॉट ( चित्रा 3 आई , जे ) में एलेर जैसा कि पहले 24 वर्णित है। कोशिकाओं की व्यवहार्यता तय किए गए मृत सेल दाग किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। घनत्व ढाल के बाद, 85-95% कोशिकाएं जीवित हैं ( चित्रा 3 क ) माइक्रोलिया और एमडीएम जनसंख्या को सीडी 45 और सीडी 11 बी मार्करों द्वारा एक डॉट प्लॉट पर मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं को एक नमूना ( चित्रा 3 एल ), और केवल मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से अकेले ( चित्रा 3 एम , 3 एन ) के बाद परिभाषित किया जा सकता है। )।

प्रवाह साइटमैट्री लेबलिंग के लिए, यह जानना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन और / या एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त एपेटाइट इंट्रा- या बाह्य कोशिका है। इंट्रासेल्युलर प्रतिजनों के मामले में, एक permeabilization बफर की आवश्यकता है। Tmem119 एक ट्रांसमीटरब्रेन प्रोटीन है, लेकिन एपिटोप मान्यता प्राप्त हैइंट्रासेल्युलर 19 के रूप में एंटीबॉडी दाग ​​द्वारा सेल permeabilization की अनुपस्थिति में, वहाँ कोई लेबलिंग ( चित्रा 3O ) था। इस पारगम्यता के चरण की अनुपस्थिति में झूठी नकारात्मक परिणाम हो सकते हैं। चूंकि Tmem119 एंटीबॉडी एक फ्लोरोफोरे के सीधे संयुग्मित नहीं है, इसलिए कोशिकाओं को एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया; नकारात्मक नियंत्रण केवल माध्यमिक एंटीबॉडी (काले रेखा) ( चित्रा 3 ई , 3 ओ -3 आर ) था। जब सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो विशिष्ट लेबलिंग का आकलन करने के लिए दो मुख्य रणनीतियों हैं: एसिटोइप एंटीबॉडीज़ को एक नकारात्मक नियंत्रण या फ्लोरेसेंस मिनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के रूप में एफएमओ नियंत्रण उस नमूने के नियंत्रण एंटीबॉडी को छोड़कर मिश्रण में हर लेबलिंग एंटीबॉडी को नियंत्रित करता है। इस प्रकार, प्रत्येक मार्कर के लिए एक एफएमओ नियंत्रण जरूरी है, जबकि प्रति नमूना, केवल एक लेबलिंग मिश्रण की जरूरत है, एसिटिप एंटीबॉडी नियंत्रण के लिए। मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लेबलिंग के लिए, हम आईसोट को चुनाएक सीमित संख्या कोशिकाओं (400,000 कोशिकाओं) के बाद से एक एंटीबॉडी नियंत्रण एक माउस मस्तिष्क से घनत्व ढाल के बाद प्राप्त किया जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: सेल पृथक्करण प्रक्रिया के चरण ( ए ) ऊतक को पाचन कॉकटेल एंजाइम के साथ एक ट्यूब में रखा गया था। ( बी ) ऊतक को कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में बारीकी से काट दिया गया था। ( सी ) ऊतक के छोटे टुकड़े कुशल ऊतक पाचन के लिए 30 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए incubated थे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: सेन के बाद घनत्व ढाल की स्कीमात्रिभुज चरण सेंटीफ्यूगेशन के बाद, मैलिलन घनत्व ढाल के शीर्ष पर मौजूद होता है और मैक्रोफेज आबादी वाले प्रतिरक्षा कोशिकाओं को 37% और 70% घनत्व ढालदार परतों के बीच इंटरफेस पर पाया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: मैक्रोफेज का प्रतिनिधि फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। एक तार्किक गेटिंग रणनीति लागू की गई थी: ( ए ) डबल भेदभाव का मतलब है कि फोकस एएससी-ए बनाम एफएससी-एच ( बी ) रूपात्मक गेटिंग रणनीति का श्रेय एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए ( सी ) बृहतभक्षककोशिका उप-जनसंख्या का मतलब सीडी 45 बनाम सीडी 11 बी के साजिश को डॉट करता है। ( डी ) कोशिकाओं के डॉट साजिश staसीडी 45 और सीडी 11 बी धुंधला के लिए एक नियंत्रण के रूप में आइसोटाइप एंटीबॉडी के साथ जुड़ा हुआ है। इन दो मैक्रोफेज उप-पोपों द्वारा व्यक्त मार्करों का विश्लेषण: टीएमएम 11 9 ( ई ), सीएक्स 3 सीआर 1 ( एफ ), और सीसीआर 2 ( जी ) (गेट पी 2 में 10,000 घटनाएं अधिग्रहित हुईं) घनत्व ढाल ( एच ) या घनत्व ढाल अलगाव के बाद और उपचार ( आई ) के बिना या बिना ( जे ) परिमाणीकरण के साथ मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं के सेल आकार (एफएससी-ए) और ग्रैन्यूलरिटी (एसएससी-ए) । ( के ) फ्लो साइटमैट्री हिस्टोग्राम घनत्व ढाल के बाद मृत कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है। डॉट प्लॉट में दिखाए गए गेट्स सीडी 11 बी + सीडी 45 मेड माइक्रोग्लिया जनसंख्या और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी ( एल ) या मस्तिष्क ( एम ) या रीढ़ की हड्डी ( एन ) में सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च एमडीएम आबादी को अलग-अलग बताते हैं। टीएमएम 11 9 का विश्लेषण व्यक्त कियामस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं में बृहतभक्षककोशिका उप-जनसंख्या द्वारा ( ओ ) या गैर-पारगम्य ( पी ), और मस्तिष्क ( क्यू ) या रीढ़ की हड्डी ( आर ) परमिटेटेड कोशिकाओं में परिमित हो। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

1 ट्यूब (एमएल) के लिए वॉल्यूम घनत्व ढाल मध्यम 1x पीबीएस 10x पीबीएस 1x
घनत्व ढाल मध्यम 30% 1.5 0.15 3.35
घनत्व ढाल मध्यम 37% 1.85 0.185 2.965
घनत्व ढाल मध्यम 70% 3.5 0.35 1.15

तालिका 1: घनत्व ग्रेडियंट मध्यम के विभिन्न प्रतिशत की संरचना।

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Discussion

यह दिखाया गया है कि माइक्रोस्ट्रलाय और एमडीएम के सीएनएस में अलग-अलग फ़ंक्शंस और फेनोटाइप हैं, और इस तरह 9 , 18 , 25 को बेहतर तंत्रिका संबंधी रोगों को समझने के लिए इन बृहतभक्षककोशिकाओं के उप-पोपों की पहचान और विश्लेषण आवश्यक हैं। दो मार्करों (सीडी 11 बी और सीडी 45) का इस्तेमाल करते हुए फ्लो साइटमैट्री विश्लेषण प्रत्येक उपपोपण ( चित्रा -3 सी ) के बीच अंतर के लिए अनुमति देता है। इस रणनीति को पहले माइक्रोग्लिया के लिए एमडीएम और सीएक्स 3 सीआर 1 के लिए सीसीआर 2 और टीएमएम 11 9 ( चित्रा 3 ई - 3 जी ) के एंटीबॉडी के साथ हाल ही में विकसित दृष्टिकोण के रूप में अन्य विशिष्ट मार्करों का उपयोग करके मान्य किया गया था। हमने सीसीआर 2 और सीएक्स 3 सीआर 1 एंटीबॉडी के साथ प्रयोग किया ( चित्रा 3 एफ , 3 जी ) जैसा कि हमने पहले 18 प्रकाशित किया था। सीडी 11 बी + सीडी 45मेड आबादी अत्यधिक Tmem119 और CX3CR1 व्यक्त की है लेकिन सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च जनसंख्या के विपरीत सीसीआर 2 नहीं है सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च आबादी सीसीआर 2 अभिव्यक्ति के साथ या बिना विभिन्न उप-जननुपातों से बना है। इन बृहतभक्षककोशिकाओं उप-जनसंख्या (परिधीय मैक्रोफेज, घुसपैठ की मैक्रोफेज आदि ) की पहचान और लक्षण वर्णन अनुसंधान के एक व्यापक क्षेत्र हैं। इसके अलावा, इन आबादी के लिए मार्कर रोग प्रक्रियाओं के आधार पर बदल सकते हैं। दरअसल, सीसीआर 2 को नियंत्रित किया जाता है जब मोनोसाइट्स रक्त मस्तिष्क की बाधा को पार करते हैं 26 ।

सीडी 45 और सीडी 11 बी एंटीबॉडी ने सेल की सतह एंटीजन को मान्यता दी, इसलिए पारगम्यता उपचार अनावश्यक है। इसलिए, इस तकनीक को एमआरएनए विश्लेषण या अन्य कार्यात्मक assays के लिए सेल सॉर्टिंग द्वारा प्रत्येक बृहतभक्षककोशिका subpopulation शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि एंजाइम और घनत्व ग्राउंड का उपयोगइन्टेंट कुछ हद तक, माइक्रोग्लिया सक्रियकरण को प्रेरित कर सकता है। हमने पहले पाया है कि अलगाव के बाद, माइक्रोग्लिया और मैक्रोफेज inducible नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (आईएनओएस) व्यक्त करते हैं। फिर भी, आईओएनएस अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि हुई सामान्य स्थिति से पैथोलॉजिक में मनाया जा सकता है 18 विधि का उपयोग करके हाइलाइट किया जा सकता है। इसके अलावा, यह तकनीक जीवित कोशिकाओं के उच्च अनुपात वाले एक अलग-अलग सेल आबादी (सिंगलट्स) को प्राप्त करती है।

इस प्रोटोकॉल की सफल प्रतिकृति के लिए, कई महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं ढाल की स्थापना सबसे महत्वपूर्ण है। हमारा अनुभव इंगित करता है कि 50 एमएल वाले 15 एमएल ट्यूबों में ग्रेडीयंट्स को तैयार करना बेहतर पृथक्करण प्राप्त करता है। 70-37% अंतरफलक में कोई भी कोशिका नहीं देखी जाती है, तो सेल अलगाव के लिए सीएनएस ऊतक की मात्रा पर विचार किया जाना चाहिए। हम आमतौर पर एक माउस मस्तिष्क से ~ 400,000 कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं। यद्यपि यह उपज विभिन्न प्रयोगात्मक स्थिति से भिन्न होता हैएस, एक 70-37% अंतरफलक के बेहतर दृश्य के लिए पीबीएस और फिनोल लाल के साथ 37% घनत्व ढाल परत बनाने के लिए है।

प्रवाह कोशिकामीटर में विभिन्न लेसरों और फिल्टर की मदद से, यह प्रोटोकॉल मैक्रोफेज उप-जनसंख्या 18 में से प्रत्येक के द्वारा व्यक्त किए गए कई मार्करों का अनुमान लगा सकता है। यह तकनीक अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे कि टी कोशिकाओं और बी कोशिकाएं एक ही नमूना की भागीदारी के आकलन के लिए उपयोगी है। दरअसल, इम्युनोमॅग्नेटिक संवर्धन का उपयोग करने वाली तकनीक केवल पहले से चयनित 21 जनसंख्या के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।

कुल मिलाकर, इस तकनीक में तंत्रिका संबंधी रोगों के माउस मॉडल में विभिन्न बृहतभक्षककोशिका उप-जननेंद्रियों को चिह्नित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। यह अनूठी वैकल्पिक रोग संबंधी स्थितियों में सूजन प्रक्रियाओं पर उपचार के प्रभावों का आकलन कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

यह काम एजेंस नेशनेल डेल ला रेफेर्क (एएनआर -12-मालाज-0003-02-पी 2 एक्स 7 आरएडी), एसोसिएशन फ्रांस अल्झाइमर और बीपीआईएफआरएन्स से अनुदान द्वारा समर्थित था। हमारी प्रयोगशाला भी इंसिरर्म, सीएनआरएस, यूनिवर्सिटी पियरे एट मैरी-क्यूरी और "इन्वेस्टमेंट्स डिसेंसर" एएनआर -10-आईएएचयू -06 (आईएचयू-ए-आईसीएम) द्वारा समर्थित है। हम सीईएलआईएस सेल संस्कृति कोर सुविधा की सहायता से शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01 Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25 G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1.5 mL tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL tube TPP 91015
50 mL tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 124 माइक्रोग्र्लिया मैक्रोफेज मस्तिष्क घुसपैठ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र प्रवाह cytometry घनत्व ढाल माउस मॉडल
फ्लो साइटोमैट्री द्वारा सेंट्रल नर्वस सिस्टम से माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का विश्लेषण
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Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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