Summary
Detta protokoll tillhandahåller en analys av makrofag-subpopulationerna i det centrala nervsystemet hos vuxna mus genom flödescytometri och är till hjälp för studier av multipla markörer som uttrycks av dessa celler.
Abstract
Många studier har visat rollen som immunceller, i synnerhet makrofager, i centrala nervsystemet (CNS) patologier. Det finns två huvudsakliga makrofagpopulationer i CNS: (i) microgliaen, som är de centrala makrofagerna i CNS och härrör från äggstocksförfödare under embryogenes, och (ii) de monocyt-härledda makrofagerna (MDM) som kan infiltrera CNS under sjukdomen och härrör från benmärgsförstorare. Rollerna hos varje makrofag-subpopulation varierar beroende på den patologi som studeras. Vidare finns det ingen överens om de histologiska markörerna eller de särskiljande kriterierna som används för dessa makrofagpopulationer. Analysen av expressionsprofilerna för CD11b- och CD45-markörerna med flödescytometri tillåter oss emellertid att särskilja microglia (CD11b + CD45 med ) från MDM (CD11b + CD45 hög ). I detta protokoll visar vi att densitetsgradientcentrifugeringenOch flödescytometrianalysen kan användas för att karakterisera dessa CNS-makrofag-subpopuleringar och för att studera flera intressemarkörer uttryckta av dessa celler som vi nyligen publicerade. Således kan denna teknik öka vår förståelse av makrofagens roll i musmodeller av neurologiska sjukdomar och kan också användas för att utvärdera läkemedelseffekter på dessa celler.
Introduction
Mikroglia är de parenkymala vävnadsboende makrofagerna i centrala nervsystemet (CNS). De spelar två viktiga funktionella roller: immunförsvar och underhåll av CNS homeostas. I motsats till MDM, som förnyas kontinuerligt från de hematopoietiska stamcellerna i benmärgen, skiljer sig mikroglcellerna från primitiva hematopoietiska stamceller som härrör från äggulaen (YS) som koloniserar hjärnan under embryonisk utveckling 1 , 2 , 3 . I gnagare spelar transkriptionsfaktorn Myb en avgörande roll i utvecklingen av alla benmärgsmessiga härledda monocyter och makrofager, men för YS-härledd mikroglia är denna faktor dispensibel och differentiering är fortfarande beroende av transkriptionsfaktorn PU.1 4 .
I det friska CNS är microglia dynamiska celler som ständigt provar sin miljö, scaNning och mätning för invaderande patogener eller vävnadsskada 5 . Detekteringen av sådana signaler initierar en väg för att lösa skadan. Mikroglia växlar snabbt från en ramifierad morfologi till en amoeboid, som följs av fagocytos och frisättning av olika mediatorer, såsom pro- eller antiinflammatoriska cytokiner. Således, beroende på deras mikromiljö, kan aktiverat mikroglia förvärva ett spektrum av olika primära tillstånd 6 .
Mikroglia påverkar djupt utvecklingen och utvecklingen av många neurologiska störningar. I gnagermodellerna av Alzheimers sjukdom (AD) 7 , Amyotrofisk lateralskleros (ALS) 8 , Multipelskleros (MS) 9 eller Parkinsons sjukdom (PD) 10 , visas mikrogliana att spela en dubbel roll, antingen inducerande skadlig neurotoxicitet eller agerande På ett neuroprotektivt sätt, vilket är beroende oN den specifika sjukdomen, sjukdomsstadiet och huruvida sjukdomen påverkades av det systemiska immunfacket 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De flesta av de CNS-lesioner som observerats i ovan nämnda sjukdomar innehåller en heterogen population av myeloidceller, innefattande inte bara parenkymal microglia, men också perivaskulära och meningeal-makrofager, såväl som CNS-infiltrerande MDM. Dessa celltyper kan differentiellt bidra till de patofysiologiska mekanismerna relaterade till skada och reparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Den nuvarande utmaningen för utredare som studerar dessa sjukdomsmodeller är att fastställa huruvida de perifera monocyterna och makrofagerna infiltrerar CNS och i så fall distanseraInguish den residenta microglia från dessa celler. Faktum är att mikroglcellerna är mycket plastiska; När de aktiveras, uttrycker mikrogliaen igen markörer som vanligtvis uttrycks av perifera monocyter och makrofager. Frågan är därför beroende av att identifiera markörer som kan skilja den residenta mikroglia från de infiltrerande monocyterna och makrofagerna.
Diskrimineringen av dessa populationer på hjärnskivor genom immunohistologiska tillämpningar är begränsad på grund av bristen på specifika antikroppar. Flödescytometrianalys är emellertid en effektiv teknik för att bedöma uttrycket av flera markörer och att skilja cellpopulationer (t ex lymfocyter, makrofager / MDM CD11b + CD45- höga och microglia CD11b + CD45 med ) liksom celldelpopulationer 16 , 17 , 18 . Detta protokoll beskriver procedurer för att isoleraMononukleära celler från mus-CNS i neurologiska sjukdomsmodeller genom användning av en optimerad enzymatisk vävnadsdissociation och en densitetsgradientcentrifugering; Såväl som en metod för differentiering av mikroglia- och MDM-populationerna i CNS genom att använda flödescytometri.
Ett annat tillvägagångssätt är att eliminera myelin och rena cellerna genom användning av magnetiska pärlor konjugerade till specifika antikroppar 19 , 20 , 21 . Myelinavlägsnande med användning av anti-myelinmagnetiska pärlor är dyrare och påverkar livskraften och utbytet av isolerade celler 22 . Detta steg och följande immunomagnetiska separering av mikrogliaen begränsar ytterligare studier av specifika immuncellpopulationer 21 , 22 .
Dessa förfaranden ger ett enkelt sätt att studera makrofagens subpopulationer vid sjukdomsutveckling ochFör att bestämma läkemedelseffekterna eller genmodifieringarna på makrofagfenotyper och aktiveringstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutionen för djurvård och användning vid ICM-institutet och av Darwin franska etiska djurkommittén och omfattas av protokollet 01407.02.
1. Framställning
- Förbered digestionscocktailen i ett 1,5 ml rör genom att kombinera följande för varje mus: 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS); 123 μL digestionsenzym (se tabell över material) vid 13 wunsch / ml (stamlösning), slutkoncentration 1,6 wunsch / ml; Och 5 μl DNase I (se tabell över material) vid 100 mg / ml (stamlösning), slutkoncentration 0,5 mg / ml.
2. Perfusion och Dissektion
- Euthanize mössen med en dödlig dos pentobarbital (100 μl vid 400 mg / ml).
- Placera djuret i viloläge och fuktiga kroppen med 70% etanol.
- Skär den ventrala huden med en fin sax strax under xyphoidprocessen för att exponera bröstkaviteteny.
- Gör ett snitt i membranet och klippa de laterala sidorna av ribbburet med fin sax i en kaudal mot rostralriktningen för att exponera hjärtat (och undvik att skära andra organ). Identifiera vänster ventrikel (LV) och höger atrium (RA).
- Sätt i en fjärilskateter med en 25 G nål inuti LV. Gör ett snitt på RA med fin sax och börja i början av blodflödet starta perfusion vid 10 ml / min flödeshastighet genom LV med 20 ml PBS för att avlägsna celler och blod från kärl; Framgångsrik perfusion noteras genom blanchering av lungorna och levern då blodet förskjuts.
- Avsluta djuret med medelstora sax. Dissektera ryggraden med fin sax och separera den från kroppen genom att ta bort bukväggen muskulaturen på den ventrala sidan av ryggraden och genom att skära ryggkotan vid svansens botten.
- Sätt i en 10 ml spruta innehållande PBS och en monterad 200 μL pipettspets i ländryggssidan avRyggraden och spola ryggmärgen på livmoderhalsen.
ANMÄRKNING: 200 μL pipettspetsen skärs med sax vid sin bredaste ände (ca 1 cm) och sätts ordentligt på en 10 ml spruta som tidigare fyllts med PBS. - Ta bort huden ovanför skallen och använd tång för att exponera hjärnan. Sätt in ett saxblad vid basen av skallen och skär kranen efter sagittal suturen. Sätt i små tångar i skäret och lyft försiktigt skallen. Dissektera hjärnan från mushuvudet och ta bort olfaktorisk glödlampa och cerebellum.
- Samla hjärnan och ryggmärgen i ett 1,5 ml rör innehållande 1,128 ml PBS med matsmältningscocktail (från steg 1.1).
3. Celldissociation
- Snitt skär hjärnan och ryggmärgen i 1,5 ml röret (steg 2.9) i 1-2 mm 3 bitar med liten sax ( Figur 1 ).
- Inkubera 1,5 ml röret innehållande hakade vävnader i 30 min i en inkubaTorr vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: Förbered densitetsgradienten vid detta steg. - Tillsätt 20 μL 0,5 M EDTA (stamlösning), slutkoncentration 10 mM, till 1,5 ml röret för att stoppa den enzymatiska reaktionen.
- Gör försiktigt en cellsuspension genom pipettering upp och ner med en 5 ml pipett.
- Passera cell suspensionen genom en nylon mesh (70 μm porstorlek) i ett 50 ml rör med användning av kolven på en 10 ml spruta.
- Tvätta nylonnätet med 20 ml 5% fetalt bovint serum (FBS) -PBS.
- Centrifugera i 7 minuter (300 xg) vid rumstemperatur (18 ° C). Kassera supernatanten genom aspiration och fortsätt till nästa steg. Var extremt försiktig när du tar bort supernatanten; Stör inte pelleten, som lätt kan aspireras av aspirationspipetten.
4. Densitetsgradient
- Förbered en stamlösning av densitetsgradientmediet genom tillsats av lämplig mängd 10x PBS till densitetsgradientmediet.
OBS: Lägg till en del 10X PBS till nio deldensitetsgradientmedium. - Späd lagerdensitetsgradientmediet med 1x PBS för de olika procentsatserna som beskrivs i Tabell 1 .
- Resuspendera pelleten (från steg 3.7) med 4 ml 30% densitetsgradientmedium och överför till ett 15 ml rör.
- Placera en Pasteur pipette i botten av 15 ml röret och långsamt underlag 4 ml 37% densitetsgradientmedium.
- Tillsätt 4 ml 70% densitetsgradientmedium, såsom beskrivits ovan.
- Centrifugera gradienten i 40 minuter (800 xg) vid rumstemperatur (18 ° C). Se till att centrifugen stannar med minimal eller ingen broms så att interfasen inte störs.
OBS: Röret visas stratifierat. Cellerna skiktade vid gränsvärdet för 70% -37% densitetsgradient är de mononukleerade immuncellerna (mikroglia och makrofag-subpopulationer); De övre nivåerna är cellrester och myelin, respektive ( Figur 2 ). - Samla 3-4 ml av 70-37% densitetsgradientinterfasen innehållande makrofag-subpopulationscellerna i ett rent 15 ml rör.
- Tvätta cellerna 3 gånger med PBS, total volym av 15 ml. Se till att densitetsgradientmediet som innehåller cellerna späds minst tre gånger med PBS och centrifugeras i 7 minuter (500 xg, 4 ° C) med bromsen "on".
- Resuspendera cellpelleten med 1 ml PBS för cellmärkning eller för andra funktionella analyser.
5. Cellmärkning för flödescytometri
- Överför cellerna (steg 4.10) till ett flödescytometri-rör.
- Tillsätt 1 μl fixerbart dödcellsfläckreagens till varje cellprov erhållet i steg 4.10. Inkubera i 30 minuter på is, skyddad mot ljus.
- Tvätta cellerna en gång med 2 ml PBS och centrifugera i 5 min (300 xg, 4 ° C).
- Ta bort supernatanten och resuspendera cellpelleten med400 | il PBS 1% BSA, 0,1% azid.
- Tillsätt 1 μg CD16 / CD32 antikroppar mot 100 μl av cellerna för att blockera Fc-receptorerna. Inkubera 10-15 min på is, skyddad mot ljus.
- Förbered den primära antikroppsmixen i PBS 1% BSA, 0,1% azid eller PBS 1% BSA, 0,1% azid, 0,25% saponin, för cellpermeabilisering för intracellulär färgning.
- Tillsätt 100 μL primära antikroppar blanda (2x) och inkubera i 30 minuter på is, skyddad mot ljus.
OBS: Alla antikroppar bör titreras före genomförandet av experimentet för att säkerställa optimala resultat. - Tvätta cellerna med 2 ml PBS och centrifugera i 5 min (300 xg, 4 ° C). Upprepa detta steg tre gånger.
- Tillsätt 100 μl av en sekundär antikropp om de primära antikropparna inte är direkt konjugerade till en fluorofor och inkubera i 30 minuter på is, skyddad mot ljus.
- Tvätta cellerna med 2 ml PBS och centrifugera i 5 minuter vid 300 xg vid 4 ° C). Upprepa detta steg tre gånger.
- FixaCeller med 100 pl 1% PFA i 15 min vid rumstemperatur, skyddad från ljus.
OBS: Varning: PFA är giftigt. Använd i en avluftningsskydd och använd personlig skyddsutrustning. - Tvätta cellerna med 2 ml PBS och centrifugera i 5 minuter vid 300 xg vid 4 ° C. Upprepa detta steg tre gånger.
- Resuspendera cellpelleten med 200 pl PBS och fortsätt till flödescytometriinsamling och analys. Följ gatingstrategin i Figur 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter densitetsgradientcentrifugering och antikroppsvärkning förvärvades cellerna på en flödescytometer och analyserades med användning av en morfologisk gatingstrategi enligt följande. En första grind definierades i punktprotot Forward-Spreaded Area (FSC-A) mot Framåt-Spridad-Höjd (FSC-H) för att diskriminera enskilda celler från dubletter ( Figur 3A ). De enskilda cellerna gades sedan på punkterna för FSC-A- mot -sidospridningsområde (SSC-A) -punkten för att utesluta cellrester och pyknotiska celler, baserat på den relativa cellstorleken och cellgranulariteten ( Figur 3B ). Då mikroglia och MDM identifierades baserat på deras expressionsnivåer av CD11b- och CD45-markörerna ( Figur 3C , 3D ). Slutligen analyserades andra expressionsmarkörer för varje makrofag-subpopulation ( Figur 3E -3G ). MikroglIa rapporterades att uttrycka CX3CR1 men inte CCR2-markören i motsats till MDM 23 . Nyligen visades att Tmem119 är en specifik markör för microglia 19 . Följande markörer (Tmem119, CX3CR1 och CCR2) bedömdes genom flödescytometri med användning av detektorantikroppar specifika för varje markör; Alla CD11b + CD45 med celler visade sig vara positiva för markörerna Tmem119 och CX3CR1 men inte för CCR2-markören som validerar denna gatingstrategi ( Figur 3E -3G ).
I frånvaro av densitetsgradientisolering kunde makrofag-subpopulationerna inte definieras i punktplot FSC-A kontra SSC-A på grund av närvaron av många celler och myelinavfall ( Figur 3H ). Observera inducerar permeabiliseringsbehandlingen en cellkrympning och således uppträdde makrofag-subpopulationerna smAller i FSC versus SSC punktpunktsplot ( Figur 3I , J ) som tidigare beskrivits 24 . Cellernas bärbarhet bestämdes med användning av den fixerbara dödcellsfärgsatsen. Efter densitetsgradienten lever 85-95% av cellerna ( Figur 3K ). Mikroglia- och MDM-populationerna kan definieras av CD45- och CD11b-markörerna på en punktdiagram efter isolering av hjärnan och ryggmärgscellerna i ett enda prov ( Figur 3L ) och även från hjärnan eller ryggmärgen ensam ( Figur 3M , 3N ).
För flödescytometrimärkning är det viktigt att veta huruvida proteinet och / eller epitopen som känns igen av antikroppen är intra- eller extracellulär. I fallet med intracellulära antigener krävs en permeabiliseringsbuffert. Tmem119 är ett transmembranprotein men epitopen igenkändAv antikroppen fläckar som intracellulär 19 . I frånvaro av cellpermeabilisering fanns ingen märkning ( Figur 3O ). Frånvaron av detta permeabiliseringssteg kan leda till falska negativa resultat. Eftersom Tmem119-antikroppen inte är direkt konjugerad till en fluorofor märktes cellerna med en sekundär antikropp; Den negativa kontrollen var enbart sekundär antikropp (svart linje) ( Figur 3E , 3O-3R ). När direkt konjugerade antikroppar används, finns det två huvudstrategier för att bedöma specifik märkning: isotypantikroppar som negativ kontroll eller fluorescensminus ett (FMO) kontroller. FMO-kontroller innehåller varje märkningsantikropp i blandningen förutom kontrollantikroppen för det provet. Således är en FMO-kontroll nödvändig för varje markör, medan endast en märkningsblandning behövs för att isotyp antikroppar kontrollerar, per prov. För märkning av hjärnans immunceller valde vi isotKontroll av antikroppar eftersom ett begränsat antal celler (400 000 celler) erhålles efter densitetsgradienten från en mushjärna.
Figur 1: Steg av celldissociationsproceduren. ( A ) Vävnaden placerades i ett rör med digestionscocktailenzymer. ( B ) Vävnaden finskars i små bitar med sax. ( C ) De små bitarna av vävnad inkuberades under 30 minuter (37 ° C) för effektiv vävnadsdigestion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schema av densitetsgradienten efter CenTrifugeringsteg. Efter centrifugering är myelin närvarande vid toppen av densitetsgradienten och immunceller innehållande makrofagpopulationer finns i interfasen mellan 37% och 70% densitetsgradientskikten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativ flödescytometrisk analys av makrofager. En logisk gatingstrategi användes: ( A ) Dubbeldiskriminationen hänvisar till punktplott FSC-A mot FSC-H. ( B ) Den morfologiska gatingstrategin hänvisar till punktplott FSC-A kontra SSC-A. ( C ) Makrofag-subpopulationerna hänför sig till punktplot CD45 mot CDllb. ( D ) Dotplot av celler staIn mot isotypantikroppar som en kontroll för CD45- och CDllb-färgning. Analysen av markörerna uttryckta av dessa två makrofag-subpopulationer: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) och CCR2 ( G ) (10 000 händelser i grind P2 erhölls). Dot-diagram som visar cellens storlek (FSC-A) och granularitet (SSC-A) i hjärnan och ryggmärgsceller före densitetsgradienten ( H ) eller efter densitetsgradientisoleringen och med permeabiliserande behandling ( I ) eller utan ( J ) . ( K ) Flödescytometrihistogram illustrerar procenten av döda celler efter densitetsgradienten. Portar som visas i punktdiagrammen illustrerar CD11b + CD45 med mikroglia-populationen och CD11b + CD45- hög MDM-populationen i hjärnan och ryggmärgen ( L ) eller i hjärnan ( M ) eller ryggmärgen ( N ) separat. Analys av Tmem119 uttrycktAv makrofag-subpopulationerna i hjärnan och ryggmärgscellerna permeabiliseras ( O ) eller icke-permeabiliserad ( P ), och i hjärnan ( Q ) eller i ryggmärgen ( R ) permeabiliserade celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Volym för 1 rör (ml) | Densitetsgradientmedium 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Densitetsgradientmedium 30% | 1,5 | 0,15 | 3,35 |
| Densitetsgradientmedium 37% | 1,85 | 0,185 | 2,965 |
| Densitetsgradientmedium 70% | 3,5 | 0,35 | 1,15 |
Tabell 1: Sammansättning av de olika procentsatserna av densitetsgradientmediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har visats att microglia och MDM har olika funktioner och fenotyper i CNS, och således är identifiering och analys av dessa makrofagpopulationer avgörande för att bättre förstå neurologiska sjukdomar 9 , 18 , 25 . Flödescytometrianalys med användning av två markörer (CD11b och CD45) möjliggör distinktionen mellan varje subpopulation ( Figur 3C ). Denna strategi validerades tidigare med användning av andra specifika markörer, såsom CCR2 för MDM och CX3CR1 för mikrogliaen och ett nyligen utvecklat tillvägagångssätt med en antikropp mot Tmem119 ( Figur 3E- 3G ). Vi utförde experiment med CCR2- och CX3CR1-antikroppar ( Figur 3F , 3G ) som vi tidigare publicerade 18 . CD11b + CD45Med populationen högt uttryckt Tmem119 och CX3CR1 men inte CCR2 i motsats till CD11b + CD45 hög populationen. CD11b + CD45 hög population består av olika subpopulationer med eller utan CCR2-uttryck. Identifiering och karakterisering av dessa makrofag-subpopulationer (perivaskulära makrofager, infiltrerande makrofager, etc. ) är ett omfattande forskningsområde. Dessutom kan markörerna för dessa populationer förändras beroende på de patologiska processerna. I själva verket är CCR2 nedreglerade när monocyterna korsar blodhjärnbarriären 26 .
CD45- och CD11b-antikropparna igenkände cellytantigenerna, så permeabiliseringsbehandlingen är onödig. Därför kan denna teknik också användas för att rena varje makrofag-subpopulation genom cellsortering för mRNA-analys eller andra funktionella analyser. Det är noterat att användningen av enzymet och densitetsgradenIent kan inducera microgliaaktivering i viss utsträckning. Vi har tidigare observerat att microglia och makrofager efter isolering uttrycker det inducerbara kväveoxidsyntaset (iNOS). Ändå kan ökad iNOS-uttrycksnivå observerad i det patologiska mot det normala tillståndet markeras med hjälp av denna metod 18 . Vidare uppnår denna teknik en väl separerad cellpopulation (singlets) med en stor andel av levande celler.
För en lyckad replikering av detta protokoll finns det flera kritiska parametrar. Inställningen av gradienten är mest kritisk. Vår erfarenhet indikerar att förberedelser av gradienterna i 15 ml rör mot 50 ml uppnår bättre separationer. Om inga celler ses i gränssnittet 70-37%, bör mängden CNS-vävnad som används för cellisolering övervägas. Vi samlar vanligtvis ~ 400.000 celler från en mushjärna. Även om detta utbyte varierar från olika experimentella tillståndS, en för en bättre visualisering av 70-37% gränssnittet är att göra 37% densitetsgradientskiktet med PBS och fenolröd.
Med hjälp av olika lasrar och filter i flödescytometern kan detta protokoll kvantifiera flera markörer uttryckta av var och en av makrofagens subpopulationer 18 . Denna teknik är också användbar för att bedöma involveringen av andra immunceller, såsom T-celler och B-celler i samma prov. Tekniker som använder immunomagnetisk anrikning tillåter endast studier av de tidigare valda populationerna 21 .
Sammantaget utgör denna teknik ett användbart verktyg för att karakterisera de olika makrofag-subpopulationerna i musmodeller av neurologiska sjukdomar. Detta unika alternativ kan utvärdera effekterna av behandling på inflammatoriska processer vid patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Agence National pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer och Bpifrance. Vårt laboratorium stöds också av Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie och programmet "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vi vill tacka hjälpen från CELIS-cellkulturens kärnanläggning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
