Summary
Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.
Abstract
Numerosos estudos demonstraram o papel das células imunes, em particular dos macrófagos, nas patologias do sistema nervoso central (SNC). Existem duas populações principais de macrófagos no SNC: (i) a microglia, que são os macrófagos residentes do SNC e são derivadas de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese, e (ii) os macrófagos derivados de monócitos (MDM), que podem infiltrar-se O SNC durante a doença e são derivados de progenitores da medula óssea. Os papéis de cada subpopulação de macrófagos diferem dependendo da patologia em estudo. Além disso, não há consenso sobre os marcadores histológicos ou os critérios distintivos utilizados para essas subpopulações de macrófagos. No entanto, a análise dos perfis de expressão dos marcadores CD11b e CD45 por citometria de fluxo nos permite distinguir a microglia (CD11b + CD45 med ) do MDM (CD11b + CD45 alta ). Neste protocolo, mostramos que a centrifugação com gradiente de densidadeE a análise de citometria de fluxo pode ser usada para caracterizar essas subpopulações de macrófagos do SNC e para estudar vários marcadores de interesse expressados por essas células como publicamos recentemente. Assim, esta técnica pode aprofundar a nossa compreensão do papel dos macrófagos em modelos de ratos de doenças neurológicas e também pode ser usada para avaliar os efeitos de drogas nessas células.
Introduction
A microglia são os macrófagos residuais do tecido parenquimatoso do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham dois principais papéis funcionais: defesa imune e manutenção da homeostase do SNC. Em contraste com o MDM, que são renovados continuamente a partir das células estaminais hematopoiéticas na medula óssea, as células microgliais se diferenciam das células progenitoras hematopoiéticas primitivas originadas no saco vitelino (YS) que colonizaram o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 1 , 2 , 3 . Em roedores, o fator de transcrição Myb desempenha um papel crucial no desenvolvimento de todos os monócitos e macrófagos derivados da medula óssea, mas para a microglia derivada de YS, esse fator é dispensável e a diferenciação continua dependente do fator de transcrição PU.1 4 .
No SNC saudável, a microglia é uma célula dinâmica que provoca constantemente o seu ambiente, a scaLevantamento e levantamento de patógenos invasores ou danos nos tecidos 5 . A detecção de tais sinais inicia um caminho para resolver a lesão. A microglia passa rapidamente de uma morfologia ramificada a uma amebaide, que é seguida de fagocitose e liberação de vários mediadores, como citoquinas pró ou anti-inflamatórias. Assim, dependendo do seu microambiente, a microglia ativada pode adquirir um espectro de estados de iniciação distintos 6 .
A microglia afeta profundamente o desenvolvimento e a progressão de muitos distúrbios neurológicos. Nos modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD) 7 , esclerose lateral amiotrófica (ALS) 8 , esclerose múltipla (MS) 9 ou doença de Parkinson (PD) 10 , a microglia mostra um duplo papel, induzindo neurotoxicidade prejudicial ou agindo De forma neuroprotetiva, dependente deN a doença específica, o estágio da doença e se a doença foi influenciada pelo compartimento imune sistêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . A maioria das lesões do SNC observadas nas doenças citadas acima contém uma população heterogênea de células mieloides, incluindo não apenas microglia parenquimatosa, mas também macrófagos perivasculares e meníngeos, bem como MDM infiltrante do SNC. Estes tipos de células podem contribuir diferencialmente para os mecanismos fisiopatológicos relacionados à lesão e reparação 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . O desafio atual para os investigadores que estão estudando esses modelos de doenças é estabelecer se os monócitos periféricos e os macrófagos se infiltram no SNC e, em caso afirmativo, distriamChateie a microglia residente dessas células. Na verdade, as células microgliais são muito plásticas; Quando são ativados, os marcadores de re-expressões de microglia geralmente são expressos por monócitos e macrófagos periféricos. A questão, portanto, se baseia na identificação de marcadores que podem distinguir a microglia residente dos monócitos e macrófagos infiltrantes.
A discriminação dessas populações em fatias cerebrais por aplicações imuno-histológicas é limitada devido à falta de anticorpos específicos. No entanto, a análise de citometria de fluxo é uma técnica eficiente para avaliar a expressão de vários marcadores e para distinguir as populações celulares (por exemplo, linfócitos, macrófagos / MDM CD11b + CD45 alto e microglia CD11b + CD45 med ), bem como subpopulações celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo descreve os procedimentos para isolar oCélulas mononucleares do SNC de ratinho em modelos de doenças neurológicas usando uma dissociação de tecido enzimático otimizado e uma centrifugação com gradiente de densidade; Bem como, um método para diferenciar as populações de microglia e MDM no SNC usando citometria de fluxo.
Outra abordagem é eliminar a mielina e purificar as células usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos específicos 19 , 20 , 21 . A remoção de mielina usando esferas magnéticas anti-mielina é mais dispendiosa e afeta a viabilidade e o rendimento de células isoladas 22 . Este passo e a seguinte separação imunomagnética da microglia, limitam estudos adicionais de populações específicas de células imunes 21 , 22 .
Esses procedimentos fornecem uma maneira fácil de estudar as subpopulações dos macrófagos no desenvolvimento da doença ePara determinar os efeitos de medicamentos ou modificações de genes em fenótipos de macrófagos e estados de ativação.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal no Instituto ICM e pelo Comitê de Ética Francesa Darwin, e estão cobertos pelo protocolo 01407.02.
1. Preparação
- Prepare o cocktail de digestão em um tubo de 1,5 mL, combinando o seguinte para cada mouse: 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS); 123 μL de enzima de digestão (ver tabela de materiais) a 13 wunsch / mL (solução de reserva), concentração final 1,6 wunsch / mL; E 5 μL de DNase I (ver tabela de materiais) a 100 mg / mL (solução de reserva), concentração final 0,5 mg / mL.
2. Perfusão e dissecação
- Eutanizar os ratos com uma dose letal de pentobarbital (100 μL a 400 mg / mL).
- Coloque o animal na posição supina e molhe o corpo com 70% de etanol.
- Corte a pele ventral com tesoura fina logo abaixo do processo xifóide para expor a cavitação torácicaY.
- Faça uma incisão no diafragma e corte os aspectos laterais da caixa torácica com tesoura fina numa direção caudal a rostral para expor o coração (e evitar o corte de outros órgãos). Identifique o ventrículo esquerdo (LV) eo átrio direito (RA).
- Insira um cateter de borboleta com uma agulha de 25 G dentro do LV. Faça uma incisão na RA com tesoura fina e no início do fluxo sanguíneo, comece a perfusão a uma taxa de fluxo de 10 mL / min através do LV com 20 mL de PBS para remover células e sangue dos vasos; A perfusão bem sucedida é notada pelo branqueamento dos pulmões e pelo fígado à medida que o sangue é deslocado.
- Decapite o animal com uma tesoura média. Dissecar a coluna vertebral com tesoura fina e separá-la do corpo excitando a musculatura da parede abdominal no lado ventral da coluna vertebral e cortando a coluna vertebral na base da cauda.
- Insira uma seringa de 10 mL contendo PBS e uma ponta de pipeta montada de 200 μL no lado lombar deNa coluna vertebral e liberar a medula espinhal no lado cervical.
NOTA: A ponta de pipeta de 200 μL é cortada com tesoura em sua extremidade mais larga (aproximadamente 1 cm) e firmemente inserida em uma seringa de 10 mL previamente preenchida com PBS. - Remova a pele acima do crânio e use fórceps para expor o cérebro. Insira uma lâmina de tesoura na base do crânio e corte o crânio seguindo a sutura sagital. Insira pinças pequenas no corte e levante suavemente o crânio. Dissecte o cérebro da cabeça do mouse e remova o bulbo olfatório e o cerebelo.
- Recolher o cérebro ea medula espinhal em um tubo de 1,5 mL contendo 1.128 mL de PBS com cocktail de digestão (do passo 1.1).
3. Dissociação celular
- Corte finamente o cérebro e a medula espinhal no tubo de 1,5 mL (passo 2.9) em 1-2 mm 3 com pequenas tesouras ( Figura 1 ).
- Incubar o tubo de 1,5 mL contendo os tecidos triturados durante 30 min em uma incubaA 37 ° C com 5% de CO 2 .
NOTA: Prepare o gradiente de densidade nesta etapa. - Adicione 20 μL de EDTA 0,5 M (solução de reserva), concentração final de 10 mM, no tubo de 1,5 mL para parar a reação enzimática.
- Gentilmente faça uma suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de 5 mL.
- Passe a suspensão celular através de uma malha de nylon (tamanho de poro de 70 μm) em um tubo de 50 mL usando o êmbolo de uma seringa de 10 mL.
- Lavar a malha de nylon com 20 mL de soro bovino fetal a 5% (FBS) -PBS.
- Centrífuga por 7 min (300 xg) à temperatura ambiente (18 ° C). Descarte o sobrenadante por aspiração e avance para o próximo passo. Seja extremamente cuidadoso ao remover o sobrenadante; Não perturbe o sedimento, que pode ser facilmente aspirado pela pipeta de aspiração.
4. Gradiente de densidade
- Prepare uma solução-mãe do meio de gradiente de densidade adicionando a quantidade apropriada de PBS 10x ao meio de gradiente de densidade.
NOTA: Adicione uma peça de 10X PBS a meio de gradiente de densidade de nove partes. - Diluir o meio de gradiente de densidade de estoque com 1x PBS para as diferentes porcentagens como descrito na Tabela 1 .
- Ressuspender a pastilha (do passo 3.7) com 4 mL de meio de gradiente de densidade a 30% e transferir para um tubo de 15 mL.
- Coloque uma pipeta Pasteur na parte inferior do tubo de 15 mL e aplique lentamente 4 mL de meio gradiente de densidade a 37%.
- Adicione 4 mL de meio de gradiente de densidade a 70%, como descrito acima.
- Centrifugue o gradiente por 40 min (800 xg) à temperatura ambiente (18 ° C). Certifique-se de que a centrífuga pára com um freio mínimo ou nenhum, de modo que a interfase não seja perturbada.
NOTA: O tubo aparecerá estratificado. As células em camadas na interface de gradiente de densidade de 70% a 37% são as células imunes mononucleadas (subpopulações de microglia e macrófagos); Os níveis superiores são detritos celulares e mielina, respectivamente ( Figura 2 ). - Coletar 3-4 mL da interfase de gradiente de densidade de 70-37% contendo as células das subpopulações de macrófagos em um tubo limpo de 15 mL.
- Lave as células 3x com PBS, volume total de 15 mL. Certifique-se de que o meio de gradiente de densidade que contém as células é diluído pelo menos três vezes com PBS e centrifugação por 7 minutos (500 xg, 4 ° C) com o freio "ligado".
- Ressuspender o sedimento celular com 1 mL de PBS para rotulagem celular ou para outros ensaios funcionais.
5. Etiquetado de células para a citometria de fluxo
- Transfira as células (passo 4.10) para um tubo de citometria de fluxo.
- Adicione 1 μL de reagente de mancha de células mortas fixável a cada amostra celular obtida no passo 4.10. Incube durante 30 min no gelo, protegido da luz.
- Lavar as células uma vez com 2 mL de PBS e centrifugar por 5 min (300 xg, 4 ° C).
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com400 μL de PBS 1% de BSA, 0,1% de azida.
- Adicione 1 μg de anticorpos CD16 / CD32 a 100 μL das células para bloquear os receptores Fc. Incube 10-15 minutos no gelo, protegido da luz.
- Prepare a mistura de anticorpo primário em PBS 1% de BSA, 0,1% de azida ou PBS 1% de BSA, 0,1% de azida, 0,25% de saponina, para permeabilização celular para coloração intracelular.
- Adicione 100 μL de mistura de anticorpos primários (2x) e incube durante 30 min em gelo, protegido da luz.
NOTA: Todos os anticorpos devem ser titulados antes de realizar a experiência para garantir ótimos resultados. - Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar por 5 minutos (300 xg, 4 ° C). Repita este passo três vezes.
- Adicionar 100 μL de um anticorpo secundário se os anticorpos primários não estiverem diretamente conjugados com um fluoróforo e incubar durante 30 minutos em gelo, protegido da luz.
- Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C). Repita este passo três vezes.
- Conserte oCélulas com 100 μL de PFA a 1% durante 15 min a temperatura ambiente, protegidas da luz.
NOTA: Atenção: o PFA é tóxico. Use em uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal. - Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C. Repita este passo três vezes.
- Ressuspender o sedimento celular com 200 μL de PBS e proceder à aquisição e análise de citometria de fluxo. Siga a estratégia de bloqueio na Figura 3 .
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Representative Results
Após a centrifugação em gradiente de densidade e coloração de anticorpos, as células foram adquiridas em um citómetro de fluxo e analisadas utilizando uma estratégia de bloqueio morfológico como se segue. Um primeiro portão foi definido no quadro de pontos Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H) para discriminar células individuais de dupletos ( Figura 3A ). As células únicas foram então fechadas em FSC-A versus parcelas de pontos de área dispersa (SSC-A) para excluir detritos celulares e células picógicas, com base no tamanho relativo da célula e na granularidade celular ( Figura 3B ). Em seguida, a microglia e O MDM foi identificado com base nos níveis de expressão dos marcadores CD11b e CD45 ( Figura 3C , 3D ). Finalmente, outros marcadores de expressão foram analisados para cada subpopulação de macrófagos ( Figura 3E -3G ). O microglForam relatados expressar o CX3CR1, mas não o marcador CCR2 em contraste com o MDM 23 . Recentemente, demonstrou-se que Tmem119 é um marcador específico para a microglia 19 . Os seguintes marcadores (Tmem119, CX3CR1 e CCR2) foram avaliados por citometria de fluxo usando anticorpos detectores específicos para cada marcador; Todas as células CD11b + CD45 med mostraram-se positivas para os marcadores Tmem119 e CX3CR1, mas não para o marcador CCR2, que valida esta estratégia de gating ( Figura 3E -3G ).
Na ausência do isolamento do gradiente de densidade, as subpopulações de macrófagos não puderam ser definidas no gráfico de pontos FSC-A versus SSC-A devido à presença de muitas células e detritos de mielina ( Figura 3H ). De notar, o tratamento de permeabilização induz um encolhimento de células e, portanto, as subpopulações de macrófagos apareceramIr para o gráfico de pontos FSC versus SSC ( Figura 3I , J ) como descrito anteriormente 24 . A viabilidade das células foi determinada usando o kit de manchas de células mortas fixáveis. Após o gradiente de densidade, 85-95% das células estão vivas ( Figura 3K ). As populações de microglia e MDM podem ser definidas pelos marcadores CD45 e CD11b em um gráfico de pontos após o isolamento do cérebro e das células da medula espinhal em uma única amostra ( Figura 3L ), e também do cérebro ou da medula espinhal sozinho ( Figura 3M , 3N ).
Para a rotulagem de citometria de fluxo, é importante saber se a proteína e / ou o epitopo reconhecido pelo anticorpo é intra ou extracelular. No caso dos antigénios intracelulares, é necessário um tampão de permeabilização. Tmem119 é uma proteína transmembranar, mas o epitopo reconhecidoPelas manchas de anticorpos como 19 intracelulares. Na ausência de permeabilização celular, não houve rotulagem ( Figura 3O ). A ausência deste passo de permeabilização pode levar a falsos resultados negativos. Uma vez que o anticorpo Tmem119 não está directamente conjugado com um fluoróforo, as células foram marcadas com um anticorpo secundário; O controle negativo foi o anticorpo secundário sozinho (linha preta) ( Figura 3E , 3O-3R ). Quando são utilizados anticorpos conjugados diretamente, existem duas estratégias principais para avaliar rotulagem específica: anticorpos de isotipo como controle negativo ou controles de Fluorescência Menos Um (FMO). Os controles de FMO contêm todos os anticorpos de rotulagem na mistura, exceto o anticorpo de controle para essa amostra. Assim, é necessário um controle de FMO para cada marcador, enquanto que apenas uma mistura de rotulagem é necessária para o controle de anticorpos do isotipo, por amostra. Para a rotulagem das células imunes do cérebro, escolhemos o isotControle de anticorpos de ype desde que um número limitado de células (400.000 células) é obtido após o gradiente de densidade de um cérebro de mouse.
Figura 1: Passos do Procedimento de dissociação celular. ( A ) O tecido foi colocado em um tubo com enzimas de cocktail de digestão. ( B ) O tecido foi cortado finamente em pedaços pequenos com tesoura. ( C ) Os pequenos pedaços de tecido foram incubados durante 30 min (37 ° C) para uma eficiente digestão dos tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema do Gradiente de Densidade Após o CenEtapa de trifugação. Após a centrifugação, a mielina está presente no topo do gradiente de densidade e as células imunes que contêm populações de macrófagos são encontradas na interfase entre as camadas de gradiente de densidade de 37% e 70%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de citometria de fluxo representativa de macrófagos. Foi aplicada uma estratégia de bloqueio lógico: ( A ) A discriminação de dupleto refere-se à trama de pontos FSC-A versus FSC-H. ( B ) A estratégia de bloqueio morfológico refere-se à trama de pontos FSC-A versus SSC-A. ( C ) As subpopulações de macrófagos referem-se ao gráfico de pontos CD45 versus CD11b. ( D ) O gráfico de pontos das células staIned com anticorpos de isotipo como controle para coloração com CD45 e CD11b. A análise dos marcadores expressa por estas duas subpopulações de macrófagos: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) e CCR2 ( G ) (10.000 eventos no portão P2 foram adquiridos). Parcelas apresentando o tamanho da célula (FSC-A) e granularidade (SSC-A) do cérebro e células da medula espinhal antes do gradiente de densidade ( H ) ou após o isolamento do gradiente de densidade e com o tratamento permeabilizante ( I ) ou sem ( J ) . ( K ) O histograma de citometria de fluxo ilustra a porcentagem de células mortas após o gradiente de densidade. Os portões mostrados nas parcelas de pontos ilustram a população de microglia CD11b + CD45 med e a população de CDMs CD11b + CD45 elevada no cérebro e na medula espinal ( L ) ou no cérebro ( M ) ou na medula espinhal ( N ) separadamente. Análise de Tmem119 expressaPelas subpopulações de macrófagos no cérebro e nas células da medula espinhal permeabilizadas ( O ) ou não permeabilizadas ( P ) e no cérebro ( Q ) ou nas células permeabilizadas da medula espinal ( R ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume para 1 tubo (mL) | Densidade gradiente médio 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Densidade gradiente médio 30% | 1,5 | 0,15 | 3.35 |
| Gradiente de densidade médio 37% | 1,85 | 0.185 | 2.965 |
| Densidade gradiente médio 70% | 3,5 | 0,35 | 1.15 |
Tabela 1: Composição das diferentes porcentagens do meio de gradiente de densidade.
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Discussion
Demonstrou-se que a microglia eo MDM têm diferentes funções e fenótipos no SNC e, portanto, a identificação e análise dessas subpopulações de macrófagos são essenciais para melhor compreender as doenças neurológicas 9 , 18 , 25 . A análise de citometria de fluxo usando dois marcadores (CD11b e CD45) permite a distinção entre cada subpopulação ( Figura 3C ). Esta estratégia foi anteriormente validada usando outros marcadores específicos, como CCR2 para MDM e CX3CR1 para a microglia, e uma abordagem recentemente desenvolvida com um anticorpo para Tmem119 ( Figura 3E - 3G ). Realizamos experiências com anticorpos CCR2 e CX3CR1 ( Figura 3F , 3G ), como anteriormente publicado 18 . CD11b + CD45População média altamente expressa Tmem119 e CX3CR1, mas não CCR2 em contraste com a população CD11b + CD45 alta . A alta população CD11b + CD45 é composta por várias subpopulações com ou sem expressão CCR2. A identificação e caracterização dessas subpopulações de macrófagos (macrófagos perivasculares, macrófagos infiltrativos, etc. ) são uma extensa área de pesquisa. Além disso, os marcadores para essas populações podem mudar dependendo dos processos patológicos. Na verdade, o CCR2 é regulado para baixo quando os monócitos atravessam a barreira hematoencefálica 26 .
Os anticorpos CD45 e CD11b reconheceram os antígenos da superfície celular, de modo que o tratamento de permeabilização é desnecessário. Portanto, esta técnica também pode ser usada para purificar cada subpopulação de macrófagos por triagem celular para análise de mRNA ou outros ensaios funcionais. É de notar que o uso da enzima e grau de densidadeO indivíduo pode induzir, até certo ponto, a ativação da microglia. Anteriormente observamos que após o isolamento, a microglia e os macrófagos expressam a óxido nítrico sintase induzível (iNOS). No entanto, o aumento do nível de expressão de iNOS observado na condição patológica versus normal pode ser destacado usando este método 18 . Além disso, esta técnica atinge uma população celular bem separada (singlets) com uma alta proporção de células vivas.
Para a replicação bem sucedida deste protocolo, existem vários parâmetros críticos. A configuração do gradiente é mais crítica. Nossa experiência indica que preparar os gradientes em tubos de 15 mL versus 50 mL atinge melhores separações. Se nenhuma célula for vista na interface 70-37%, a quantidade de tecido do SNC usado para isolamento celular deve ser considerada. Geralmente, colecionamos ~ 400,000 células de um cérebro de mouse. Embora esse rendimento varie de várias condições experimentaisS, um para uma melhor visualização da interface 70-37% é fazer a camada de gradiente de densidade de 37% com PBS e vermelho de fenol.
Com a ajuda de diferentes lasers e filtros no citómetro de fluxo, este protocolo pode quantificar vários marcadores expressos por cada subpopulação de macrófagos 18 . Esta técnica também é útil para avaliar o envolvimento de outras células imunes, como células T e células B na mesma amostra. Na verdade, as técnicas que utilizam o enriquecimento imunomagnético só permitem o estudo das populações previamente selecionadas 21 .
Em geral, essa técnica constitui uma ferramenta útil para caracterizar as diferentes subpopulações de macrófagos em modelos de doenças neurológicas de ratos. Esta alternativa única pode avaliar os efeitos do tratamento sobre processos inflamatórios em condições patológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer e Bpifrance. O nosso laboratório também é apoiado pela Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie e o programa "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Gostaríamos de agradecer a assistência das instalações centrais da cultura CELIS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
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