Summary
פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.
Abstract
מחקרים רבים הוכיחו את תפקודם של תאי החיסון, ובמיוחד מקרופאגים, בפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). ישנן שתי אוכלוסיות מקרופאגיות עיקריות במערכת העצבים המרכזית: (i) המיקרוגלים, שהם המקרופאגים של ה- CNS, והם נגזרים מאבות שק החלמון במהלך אמבריוגנזה (2), המקרופאגים הנגזרים מונוציטים (MDM), אשר יכולים לחדור CNS במהלך המחלה נגזרים אבות מח עצם. התפקידים של כל subopopulation מקרופאג שונים בהתאם הפתולוגיה הנלמדת. יתר על כן, אין הסכמה על סמנים היסטולוגיים או הקריטריונים המבדילים המשמשים subpopulations מקרופאגים אלה. עם זאת, ניתוח של פרופילי הביטוי של CD11b ו CD45 סמנים על ידי cytometry הזרימה מאפשר לנו להבדיל microglia (CD11b + CD45 med ) מ MDM (CD11b + CD45 גבוהה ). בפרוטוקול זה, אנו מראים כי צנטריפוגה צפיפות שיפועואת זרימת cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לאפיין אלה subpopulations מקרופאס CNS, וכדי ללמוד מספר סמנים של עניין לידי ביטוי על ידי תאים אלה כפי שפורסם לאחרונה. לכן, טכניקה זו יכולה לקדם את ההבנה שלנו את התפקיד של מקרופאגים מודלים העכבר של מחלות נוירולוגיות והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעות על התרופה תאים אלה.
Introduction
Microglia הם מקרופאגים תושב רקמת parenchymal של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם משחקים שני תפקידים מרכזיים תפקודית: ההגנה החיסונית ותחזוקה של הומאוסטזיס CNS. בניגוד ל- MDM, המתחדשים ללא הרף מתאי גזע ההמטופויטים במוח העצם, תאי המיקרוגליאל נבדלים מתאי האב הקדמון הפרימיטיביים שמקורם בשק החלמון (YS) שהתיישב במוח במהלך התפתחות עובריים 1 , 2 , 3 . במכרסמים, גורם שעתוק Myb ממלא תפקיד מכריע בפיתוח של כל מונוציטים מקרופאגים מוח העצם נגזר, אבל עבור YS נגזר microglia, גורם זה הוא dispensable ו הבחנה נשאר תלוי גורם שעתוק PU.1 4 .
ב CNS בריא, microglia הם תאים דינמיים כי כל הזמן מדגם הסביבה שלהם, scaNning ו מדידות עבור פתוגנים פולשים או נזק לרקמות 5 . גילוי של אותות כאלה יוזם מסלול לפתרון הפציעה. המיקרוגליה עוברת במהירות ממורפולוגיה מסועפת לאחת אמבואידית, ואחריה פגוציטוזיס ושחרור של מתווכים שונים, כגון ציטוקינים פרו-או אנטי-דלקתיים. לפיכך, בהתאם microenvironment שלהם, microglia מופעל יכול לרכוש מגוון רחב של מדינות פרימינג מובהק 6 .
Microglia השפעה עמוקה על התפתחות והתקדמות של הפרעות נוירולוגיות רבות. במודלים המכרסמים של מחלת אלצהיימר (AD), 7 , טרשת נפוצה (ALS) 8 , טרשת נפוצה (MS) 9 או מחלת פרקינסון (PD) 10 , המיקרוגליה מתבטאת בתפקוד כפול, או בהופעת נוירוטוקסיות מזיקה או משחק באופן נוירו-יציבותי, התלותיאת המחלה הספציפית, את שלב המחלה, והאם המחלה הושפעה על ידי תא החיסון המערכתי 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . רוב נגעים CNS שנצפתה במחלות שצוטטו לעיל מכילים אוכלוסיה הטרוגנית של תאים מיאלואידים, כולל לא רק microglia parenchymal, אלא גם מקרופאגים perivascular ו מאנגיאל, כמו גם MDM חדירת CNS. סוגי תאים אלה עשויים לתרום באופן דיפרנציאלי למנגנונים הפתופיזיולוגיים הקשורים לפציעה ולתיקון 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . האתגר הנוכחי לחוקרים הלומדים מודלים אלה של המחלה הוא לקבוע אם מונוציטים הפריפריה מקרופאגים לחדור CNS ואם כן, כדי distלהכניע את המיקרוגליה של התאים האלה. ואכן, תאים microglial הם פלסטיק מאוד; כאשר הם מופעלים, microglia מחדש להביע סמנים שבדרך כלל לידי ביטוי על ידי מונוציטים היקפיים מקרופאגים. הנושא, אם כן, מסתמך על זיהוי סמנים שיכולים להבחין בין microglia תושב מן מונוציטים חדרו מקרופאגים.
האפליה של אוכלוסיות אלה על פרוסות המוח על ידי יישומים אימונוהיסטולוגיים מוגבל בשל חוסר נוגדנים ספציפיים. עם זאת, ניתוח cytometry זרימה היא טכניקה יעילה כדי להעריך את הביטוי של כמה סמנים להבדיל אוכלוסיות תאים (למשל, לימפוציטים, מקרופאגים / MDM CD11b + CD45 גבוה , microglia CD11b + CD45 med ), כמו גם תת subpopulations 16 , 17 , 18 . פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לבידודתאים mononuclear מ CNS העכבר במודלים של מחלות נוירולוגיות באמצעות ניתוק אופטימלי, אנזימטי רקמות צנטריפוגה צפיפות שיפוע; כמו גם, שיטה לבידול מיקרוגליה ו - MDM אוכלוסיות ב CNS באמצעות cytometry הזרימה.
גישה נוספת היא לחסל את myelin ולטהר את התאים באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות נוגדנים ספציפיים 19 , 20 , 21 . הסרת Myelin באמצעות חרוזים מגנטיים anti-myelin הוא יקר יותר משפיע על הכדאיות והתשואה של תאים מבודדים 22 . צעד זה ואת ההפרדה החיסונית הבאה של microglia, להגביל מחקרים נוספים של אוכלוסיות תאים ספציפיים החיסון 21 , 22 .
נהלים אלה מספקים דרך קלה ללמוד את subcopulations macrophage בפיתוח מחלות, וכדי לקבוע את השפעות התרופה או שינויים גנים על פנוטיפים מקרופאג ומצבי הפעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסד לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש במכון ICM ועל ידי ועדת דארווין הצרפתית בעלי חיים אתיים, והם מכוסים תחת פרוטוקול 01407.02.
1. הכנה
- הכן את קוקטייל העיכול בצינור 1.5 מ"ל על ידי שילוב הבאים עבור כל עכבר: 1 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS); 123 אנזים עיכול μL (ראה טבלה של חומרים) ב 13 wunsch / מ"ל (פתרון המניות), ריכוז סופי 1.6 wunsch / מ"ל; ו 5 μL DNase אני (ראה טבלה של חומרים) ב 100 מ"ג / מ"ל (פתרון המניות), הריכוז הסופי 0.5 מ"ג / מ"ל.
2. זלוף ו Dissection
- להרדים את העכברים עם מינון קטלני של pentobarbital (100 μL ב 400 מ"ג / מ"ל).
- מניחים את החיה במצב שכיבה ולרטב את הגוף עם אתנול 70%.
- חותכים את העור הגחון עם מספריים בסדר רק מתחת לתהליך cypphoid לחשוף את חלל החזהY.
- לעשות חתך הסרעפת לחתוך את ההיבטים לרוחב של כלוב הצלעות עם מספריים בסדר הזנב כדי לכיוון מקורי לחשוף את הלב (ולהימנע לחתוך איברים אחרים). זהה את החדר השמאלי (LV) ואת אטריום ימין (RA).
- הכנס קטטר פרפר עם מחט 25 G בתוך LV. לעשות חתך על RA עם מספריים בסדר בתחילת זרם הדם, להתחיל זלוף בקצב 10 מ"ל / דקות הזרימה דרך LV עם 20 מ"ל PBS להסיר תאים ודם מן כלי; זלוף מוצלח הוא ציין על ידי blanching של הריאות ואת הכבד כמו דם הוא עקורים.
- לערוף את החיה עם מספריים בינוניים. לנתח את עמוד השדרה עם מספריים בסדר להפריד אותו מהגוף על ידי הוצאת את שרירי דופן דופן הבטן בצד הגחון של עמוד השדרה על ידי חיתוך עמוד השדרה בבסיס הזנב.
- הכנס מזרק 10 מ"ל המכיל PBS ו נטען 200 פיפטה μL רכוב אל הצד המותני שלאת עמוד השדרה ואת לשטוף את חוט השדרה בצד צוואר הרחם.
הערה: 200 פיפטה μL קצה הוא לחתוך עם מספריים בקצה הרחב ביותר שלה (כ 1 ס"מ) ומוכנס בחוזקה על מזרק 10 מ"ל בעבר מלא PBS. - הסר את העור מעל הגולגולת ולהשתמש מלקחיים לחשוף את המוח. הכנס להב מספריים בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת לאחר תפר sagittal. הכנס מלקחיים קטנים לתוך לחתוך בעדינות להרים את הגולגולת. לנתח את המוח מן הראש העכבר להסיר את הנורה חוש הריח ואת המוח הקטן.
- איסוף המוח חוט השדרה בצינור 1.5 מ"ל המכיל 1.128 מ"ל PBS עם קוקטייל עיכול (משלב 1.1).
3. תא דיסוציאציה
- לחתוך דק את המוח ואת חוט השדרה בצינור 1.5 מ"ל (שלב 2.9) לתוך 1-2 מ"מ 3 חתיכות עם מספריים קטנים ( איור 1 ).
- דגירה צינור 1.5 מ"ל המכיל רקמות טחון במשך 30 דקות ב incubaטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 .
הערה: הכן את שיפוע הצפיפות בשלב זה. - הוסף 20 μL 0.5 M EDTA (פתרון המניה), 10 מ"מ ריכוז סופי, לצינור 1.5 מ"ל לעצור את התגובה האנזימטית.
- בעדינות להפוך ההשעיה התא על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 5 מ"ל.
- לעבור את ההשעיה התא דרך רשת ניילון (70 מיקרומטר גודל הנקבוביות) בצינור 50 מ"ל באמצעות הבוכנה של מזרק 10 מ"ל.
- לשטוף את רשת ניילון עם 20 מ"ל 5% עוברית שור בסרום (FBS) -PBS.
- צנטריפוגה במשך 7 דקות (300 x ג ') בטמפרטורת החדר (18 ° C). מחק את supernatant על ידי שאיפה ולהמשיך לשלב הבא. היזהר מאוד בעת הסרת supernatant; לא להפריע גלולה, אשר יכול בקלות להיות aspirated על ידי פיפטה aspirating.
4. צפיפות הדרגתית
- הכן פתרון המניות של המדידה שיפוע צפיפות על ידי הוספת הסכום המתאים של 10x PBS למדיום שיפוע צפיפות.
הערה: הוסף חלק אחד 10X PBS ל 9 חלקים צפיפות בינוני שיפוע. - לדלל את המדידה שיפוע צפיפות מלאי עם 1x PBS עבור האחוזים השונים כמתואר בטבלה 1 .
- Resuspend גלולה (משלב 3.7) עם 4 מ"ל 30% צפיפות המדידה שיפוע ולהעביר צינור 15 מ"ל.
- מניחים פיפטה פסטר בתחתית צינור 15 מ"ל ו לאט שכבת 4 מ"ל של מדידת צפיפות 37% צפיפות 37%.
- הוסף 4 מ"ל של 70% צפיפות שיפוע בינוני, כמתואר לעיל.
- צנטריפוגה שיפוע במשך 40 דקות (800 x ג ') בטמפרטורת החדר (18 ° C). ודא צנטריפוגה מפסיק עם בלם מינימלי או לא, כך הביך לא מופרע.
הערה: הצינור יופיע ברבדים. התאים מרובד על 70% - 37% צפיפות ממשק שיפוע הם תאי החיסון mononucleated (microglia ו macropage subpopulations); הרמות העליונות הן פסולת התא ומיאלין, בהתאמה ( איור 2 ). - איסוף 3-4 מ"ל של 70-37% צפיפות שיפוע interphase המכיל את התאים subpopulations macrophage לתוך צינור נקי 15 מ"ל.
- לשטוף את התאים 3x עם PBS, נפח כולל של 15 מ"ל. ודא בינוני צפיפות שיפוע המכיל את התאים הוא מדולל לפחות שלוש פעמים עם PBS, ו לצנטריפוגה במשך 7 דקות (500 xg, 4 ° C) עם הבלם "ב".
- Resuspend תא גלולה עם 1 מ"ל PBS לתיוג תאים או מבחני תפקודי אחרים.
5. תא תיוג עבור זרימת cytometry
- מעבירים את התאים (שלב 4.10) לתוך צינור cytometry זרימה.
- הוסף 1 μL של לתקן תאים מתים מגיב התא מתווך לכל דגימה התא שהתקבל בשלב 4.10. דגירה במשך 30 דקות על הקרח, מוגן מפני האור.
- שטפו את התאים פעם עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה במשך 5 דקות (300 xg, 4 ° C).
- הסר את supernatant, ו resuspend תא גלולה עם400 μL PBS 1% BSA, אזיד 0.1%.
- הוסף 1 מיקרוגרם CD16 / CD32 נוגדנים 100 μL של תאים כדי לחסום את הקולטנים FC. דגירה 10-15 דקות על קרח, מוגן מפני האור.
- הכן את תערובת הנוגדן העיקרי ב PBS 1% BSA, 0.1% אזיד או PBS 1% BSA, אזיד 0.1%, 0.25% saponin, permeabilization תא מכתים תאיים.
- הוסף 100 μL של נוגדנים ראשוניים לערבב (2x) ו דגירה במשך 30 דקות על הקרח, מוגן מפני האור.
הערה: כל נוגדנים צריך להיות טיטרציה לפני ביצוע הניסוי כדי להבטיח תוצאות אופטימליות. - לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה במשך 5 דקות (300 xg, 4 ° C). חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
- הוסף 100 μL של נוגדן משני אם הנוגדנים העיקריים אינם מצומדות ישירות fluorophore, ו דגירה במשך 30 דקות על הקרח, מוגן מפני האור.
- לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 ב 4 ° C). חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
- תתקן את התאים עם 100 PFA 1 μL 1% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
הערה: זהירות: PFA הוא רעיל. השתמש ברדס קטר וללבוש ציוד מגן אישי. - לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה 5 דקות ב XG 300 ב 4 ° C. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
- Resuspend תא גלולה עם 200 PBS μL ולהמשיך זרימת cytometry זרימה וניתוח. בצע את האסטרטגיה gating באיור 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות מכתים נוגדן, התאים נרכשו על cytometer זרימה ונותחו באמצעות אסטרטגיה gating מורפולוגיים כדלקמן. שער ראשון הוגדר בחלקת הנקודות קדימה-מפוזרת שטח (FSC-A) לעומת קדימה-מפוזרים גובה (FSC-H) כדי להפלות תאים בודדים מן doublets ( איור 3 א ). תאים בודדים היו מגודרים מכן על FSC-A לעומת צד מפוזרים שטח (SSC-A) מגרשים נקודה כדי להוציא פסולת התא ותאי pyknotic, בהתבסס על גודל התא יחסית ואת פירוט התא ( איור 3 ב ). ואז, microglia ו MDM זוהו בהתבסס על רמות הביטוי שלהם של CD11b ו CD45 סמנים ( איור 3C , 3D ). לבסוף, סמנים ביטוי אחרים נותחו עבור כל subropopulation מקרופאג ( איור 3E -3G ). המיקרוגלIa דווחו להביע את CX3CR1 אבל לא את סמן CCR2 בניגוד MDM 23 . לאחרונה, הוכח כי Tmem119 הוא סמן ספציפי microglia 19 . סמנים הבאים (Tmem119, CX3CR1, ו CCR2) הוערכו על ידי cytometry הזרימה באמצעות נוגדנים גלאי ספציפי עבור כל סמן; כל CD11b + CD45 תאים MD הוצגו כדי להיות חיובי עבור Tmem119 ו CX3CR1 סמנים אבל לא עבור סמן CCR2, אשר מאמת את האסטרטגיה gating ( איור 3E -3G ).
בהיעדר בידוד צפיפות שיפוע, subopopulations מקרופאג לא ניתן להגדיר את העלילה נקודה FSC-A לעומת SSC-A בשל נוכחות של תאים רבים ופסולת המיאלין ( איור 3H ). ראוי לציין, הטיפול permeabilization גורם הצטמקות התא ובכך המקרופאג subpopulations הופיעו smAller ב FSC לעומת העלילה נקודה SSC ( איור 3I , J ) כפי שתואר לעיל 24 . הכדאיות של התאים נקבעה באמצעות ערכת stable התא המתקן. לאחר שיפוע צפיפות, 85-95% של תאים חיים ( איור 3K ). את microglia ו MDM אוכלוסיות יכול להיות מוגדר על ידי CD45 ו CD11b סמנים על מגרש נקודה לאחר בידוד של המוח ואת תאי חוט השדרה במדגם אחד ( איור 3L ), וגם מן המוח או חוט השדרה לבד ( איור 3M , 3N ).
עבור תיוג cytometry זרימה, חשוב לדעת אם החלבון ו / או epitope מוכר על ידי הנוגדן הוא intra- או תאיים. במקרה של אנטיגנים תאיים, חיץ permeabilization נדרש. Tmem119 הוא חלבון טרנסממברני אבל epitope מוכרעל ידי כתמי נוגדנים כמו תאיים 19 . בהיעדר permeabilization התא, לא היה תיוג ( איור 3O ). היעדר שלב permeabilization זה יכול להוביל לתוצאות שליליות שווא. מאז הנוגדן Tmem119 אינו מצומד ישירות פלואורופורה, התאים היו מסומנים עם נוגדנים משני; שליטה שלילית היה נוגדנים משני לבד (קו שחור) ( איור 3E , 3O-3R ). כאשר נוגדנים מצומדות ישירות משמשים, ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות כדי להעריך תיוג ספציפי: נוגדנים isotype כמו שליטה שלילית או פלואורסצנטי מינוס אחד (FMO) שולטת. פקדי FMO מכילים כל נוגדנים תיוג בתערובת למעט נוגדנים שליטה עבור מדגם זה. לכן, שליטה FMO הוא הכרחי עבור כל סמן, בעוד רק תערובת אחת תיוג נדרשת עבור נוגדנים isotype שליטה, לפי המדגם. עבור תיוג של תאים חיסוניים במוח, בחרנו את האיזוטYpe נוגדנים שליטה מאז מספר מצומצם של תאים (400,000 תאים) מתקבל לאחר שיפוע צפיפות מ מוח עכבר אחד.
איור 1: שלבים של דיסוציאציה התא נוהל. ( א ) הרקמה הונחה בצינור עם אנזימי קוקטייל בעיכול. ( ב ) הרקמה נחתכה דק לחתיכות קטנות עם מספריים. ( ג ) החלקים הקטנים של הרקמה הודגרו במשך 30 דקות (37 מעלות צלזיוס) לעיכול רקמות יעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: סכימה של מדרון צפיפות לאחר Cenשלב טריפוגציה. לאחר צנטריפוגה, myelin נמצא בחלק העליון של צפיפות שיפוע ותאי החיסון המכילים אוכלוסיות מקרופאג נמצאות ב interfase בין השכבות 37% ו 70% צפיפות שיפוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג זרימת cytometry ניתוח מקרופאגים. אסטרטגיה הגיונית לוגי הוחל: ( א ) אפליה דבלט מתייחס מגרש נקודה FSC-A לעומת FSC-H. ( ב ) אסטרטגיה gatting מורפולוגי מתייחס מגרש FSC-A לעומת SSC-A. ( ג ) subpopulations מקרופא מתייחס נקודה CD45 לעומת CD11b. ( ד ) העלילה נקודה של תאים staIned עם נוגדנים isotype כבקרה עבור מכתים CD45 ו CD11b. ניתוח הסמנים שהובעו על ידי שתי תת-אוכלוסיות מקרופאגיות אלה: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) ו- CCR2 ( G ) (10,000 אירועים בשער P2 נרכשו). חלקות המראות את גודל התא (FSC-A) ואת רמת הפירוט (SSC-A) של תאי המוח ואת חוט השדרה לפני שיפוע הצפיפות ( H ) או לאחר בידוד הצפיפות בצפיפות ועם טיפול permeabilizing ( I ) או ללא ( J ) . ( K ) היסטוגרמה זרימת cytometry ממחישה את אחוז התאים המתים לאחר שיפוע הצפיפות. השערים המוצגים בחלקות הצבע מדגימות את אוכלוסיית המיקרוגליאה של CD11b + CD45 ו- CD11b + CD45 במינון גבוה של MDM במוח ובחוט השדרה ( L ) או במוח ( M ) או בחוט השדרה ( N ) בנפרד. ניתוח של Tmem119 הביע על ידי subopopulations macrophage במוח ובתאי חוט השדרה permeabilized ( O ) או שאינם permeabilized ( P ), ובמוח ( Q ) או חוט השדרה ( R ) תאים permeabilized. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| נפח עבור 1 צינור (מ"ל) | צפיפות שיפוע בינוני 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| צפיפות שיפוע בינוני 30% | 1.5 | 0.15 | 3.35 |
| צפיפות שיפוע בינוני 37% | 1.85 | 0.185 | 2.965 |
| צפיפות שיפוע בינוני 70% | 3.5 | 0.35 | 1.15 |
Ep-together.within-page = "1"> טבלה 1: הרכב האחוזים השונים של מדידת הצבע בצפיפות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוכח כי microglia ו MDM יש פונקציות שונות פנוטיפים במערכת העצבים המרכזית, ולכן זיהוי וניתוח של subopopulations מקרופאגים אלה חיוניים על מנת להבין טוב יותר מחלות נוירולוגיות 9 , 18 , 25 . זרימת cytometry ניתוח באמצעות שני סמנים (CD11b ו CD45) מאפשר את ההבחנה בין כל subpopulation ( איור 3 ג ). אסטרטגיה זו אושרה בעבר באמצעות סמנים ספציפיים אחרים, כגון CCR2 עבור MDM ו CX3CR1 עבור microglia, וגישה שפותחה לאחרונה עם נוגדן Tmem119 ( איור 3E - 3G ). ביצענו ניסויים עם CCR2 ו CX3CR1 נוגדנים ( איור 3F , 3G ) כפי שפורסם בעבר 18 . CD11b + CD45אוכלוסיית Med הביעה מאוד Tmem119 ו CX3CR1 אבל לא CCR2 בניגוד CD11b + CD45 גבוה האוכלוסייה. האוכלוסייה CD11b + CD45 גבוהה מורכבת subpopulations שונים עם או ללא ביטוי CCR2. הזיהוי והאפיון של תת-מאקרופאגים אלה (מקרופאגים סביבתיים, חדירת מקרופאגים וכו ' ) הם תחום מחקר נרחב. יתר על כן, סמנים לאוכלוסיות אלה יכולים להשתנות בהתאם לתהליכים הפתולוגיים. ואכן, CCR2 הוא regulated למטה כאשר מונוציטים לחצות את מחסום הדם בדם 26 .
CD45 ו CD11b נוגדנים זיהה אנטיגנים פני התא, ולכן הטיפול permeabilization מיותר. לכן, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לטהר כל subopopulation macrophage ידי מיון תאים עבור ניתוח mRNA או מבחני תפקודי אחרים. יש לציין כי השימוש של האנזים צפיפות גראדIent יכול לגרום, במידה מסוימת, ההפעלה microglia. יש לנו בעבר הבחין כי לאחר בידוד, microglia ו macrophages לבטא את תחמוצת חנקתי synthase תחמוצת (iNOS). עם זאת, הגדילה את רמת הביטוי iNOS שנצפתה במצב הפתולוגי לעומת המצב הנורמלי ניתן להדגיש באמצעות שיטה זו 18 . יתר על כן, טכניקה זו משיגה אוכלוסייה תאים מופרדים היטב (סינגלים) עם שיעור גבוה של תאים חיים.
עבור שכפול מוצלח של פרוטוקול זה, ישנם מספר פרמטרים קריטיים. ההתקנה של שיפוע הוא קריטי ביותר. הניסיון שלנו עולה כי הכנת מעברי ב 15 צינורות מ"ל לעומת 50 מ"ל אלה משיגה הפרדות טוב יותר. אם תאים לא נראים בממשק 70-37%, כמות הרקמה CNS המשמש לבידוד התא צריך להיחשב. אנחנו בדרך כלל לאסוף ~ 400,000 תאים ממוח העכבר אחד. למרות תשואה זו משתנה ממצב ניסיוני שוניםS, אחד להדמיה טובה יותר של ממשק 70-37% היא להפוך את השכבה 37% צפיפות שיפוע עם PBS ו פנול אדום.
בעזרת לייזרים שונים מסננים cytometer זרימה, פרוטוקול זה יכול לכמת כמה סמנים לידי ביטוי על ידי כל subopopulations macrophage 18 . טכניקה זו שימושית גם להערכת מעורבות של תאים חיסוניים אחרים כגון תאי T ו- B תאים באותו מדגם. ואכן, טכניקות באמצעות העשרה אימונומגנטית רק לאפשר את המחקר של האוכלוסייה שנבחרו 21 קודם לכן.
בסך הכל, טכניקה זו מהווה כלי שימושי לאפיין את subropopulations macrophage שונים מודלים העכבר של מחלות נוירולוגיות. חלופה ייחודית זו יכולה להעריך את השפעת הטיפול על תהליכים דלקתיים בתנאים פתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ הסוכנות הלאומית להפלגה Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), האגודה הצרפתית אלצהיימר Bpifrance. המעבדה שלנו נתמכת גם על ידי Inserm, CNRS, אוניברסיטת Pierre et Marie-Curie והתוכנית "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). ברצוננו להודות לעזרתו של CELIS תא התרבות הליבה מתקן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
