Анализ мозаичного клона в эпителии дрозофилы имагинального диска представляет собой мощную модельную систему для изучения генетических и клеточных механизмов опухолевого генеза. Здесь мы описываем протокол для индуцирования опухолей на дислоцированных крыльях Drosophila с использованием системы GAL4-UAS и вводим метод диагностики для классификации фенотипов опухолей.
На ранних стадиях рака трансформированные мутантные клетки проявляют цитологические аномалии, начинают неконтролируемое разрастание и постепенно нарушают организацию тканей. Drosophila melanogaster стала популярной экспериментальной модельной системой в области биологии рака для изучения генетических и клеточных механизмов опухолевого генеза. В частности, генетические инструменты для дискретных дисков Drosophila (развитие эпителия у личинок) позволяют создавать трансформированные опухолевые клетки в нормальной эпителиальной ткани, что аналогично начальным стадиям рака человека. Однако недавнее исследование опухолеобразования на крысиных имагинальных дисках дрозофилы показало, что инициирование опухоли зависит от внутренней цитоархитектуры ткани и местного микроокружения, что свидетельствует о том, что важно учитывать специфичность региона к опухолегенным стимулам при оценке фенотипов опухолей в имагинальных диски. Чтобы облегчить фенотипический анализ прогрессирования опухолиНа имагинальных дисках, здесь мы описываем протокол для генетических экспериментов с использованием системы GAL4-UAS для индукции неопластических опухолей в крыловых образных дисках. Далее мы вводим метод диагностики для классификации фенотипов клональных поражений, индуцированных в имагинальном эпителии, поскольку четкий метод классификации для различения различных этапов прогрессирования опухоли (таких как гиперплазия, дисплазия или неоплазия) ранее не описывался. Эти методы могут быть широко применимы к клональному анализу фенотипов опухолей в различных органах у Drosophila .
Эпителиальные ткани представляют собой высокоорганизованные системы, которые обладают замечательной гомеостатической способностью поддерживать свою организацию посредством развития и клеточного оборота. Однако эта устойчивая система самоорганизации постепенно разрушается при развитии опухоли. В начале развития опухоли в эпителиальном слое появляются отдельные мутантные клетки, связанные с активацией онкогена или инактивацией гена опухолевых супрессоров. Когда это преобразованная «клетка про опухоль» уклоняется подавляющей среда, разрушает эпителиальные организации, и начинается бесконтрольное распространение, канцерогенез происходит 1. В течение последних нескольких десятилетий выдающиеся технологические достижения в области генетики и молекулярной биологии достигли значительных успехов в области исследований рака. В частности, недавние исследования с использованием инструментов генетического мозаичного анализа у Drosophila melanogaster , таких как митотический рекомбинат миотического рекомбината FLP-FRT (филипса рекомбиназа / флупаза рекомбиназа)Ation 2 и flip-out-GAL4-UAS (восходящая активирующая последовательность) 3 значительно способствовали лучшему пониманию генетических механизмов, участвующих в образовании и метастазировании опухолей 4 , 5 , 6 .
Исследования группы консервативных генов опухолевых супрессоров дрозофилы, летальные гигантские личинки (ЖС), диски большой (DLG), и каракуль (Scrib), подчеркнули критическую зависимость между потерей эпителиальной организации и развитием опухолей, так как эти гены играют ключевую роль В регуляции апикально-базальной клеточной полярности и пролиферации клеток в эпителиальных тканях 7 . В то время как Drosophila имагинальные диски обычно представляют собой монолитированный эпителий, гомозиготные мутации в любом из этих трех генов заставляют клетки терять структуру и полярность, не могут различатьсяrentiate, overproliferate, и в конечном счете образуют многослойные аморфные массы , которые сливаются с окружающими тканями 7. Аналогичным образом, разрушение этих генов у млекопитающих связано с развитием злокачественных опухолей 8 , 9 . Неопластические фенотипы, проявляемые мутантными тканями, привели к классификации этих трех генов в качестве консервативных неопластических опухоле-супрессорных генов (nTSG) 7 , 8 . Однако, когда гомозиготные мутантные клетки nTSG спорадически генерируются при развитии имагинальных дисков дикого типа с использованием митотической рекомбинации, опосредованной FLP-FRT, мутантные клетки удаляются из ткани через c-Jun N-концевую киназу (JNK) -зависимый апоптоз 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , экструзия 15 </suP> , 16 , или поглощение и фагоцитоз соседей 17 . В этой генетически мозаичной эпителии апоптоз чаще всего обнаруживается в мутантных клетках nTSG, расположенных на границе клона, что указывает на то, что соседние нормальные клетки вызывают апоптоз мутантных клеток nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Недавние исследования в клетках млекопитающих подтвердили, что эта клеточная конкурентная элиминация проопухолевых клеток является эволюционно консервативным механизмом самозащиты эпителия против рака 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Однако недавнее исследование в дислоцированных дисках Drosophila показало, что мозаичные клоны nTSG-нокдауна индуцируют опухолевые опухоли в специфическихIC областей крыла имагинальных дисков 16 . Первоначальная опухолевая формация всегда находилась в периферической области «шарнира» и никогда не наблюдалась в центральной области «мешочка» эпителия диска крыла, что указывает на то, что опухолегенный потенциал nTSG-нокдаун-клеток зависит от местной среды. Центральная область мешочка функционирует как «опухолевая холодность», где проопухолевые клетки не проявляют диспластического роста, тогда как периферическая область шарнира ведет себя как «горячая точка опухоли» 16 . В областях «холодного пятна» клетки nTSG-нокдауна расслаиваются с базальной стороны и подвергаются апоптозу. Напротив, поскольку ячейки шарнира «горячей точки» обладают сетью устойчивых цитоскелетных структур на их базальных сторонах, клетки с нокаутом nTSG расслаиваются с апикальной стороны эпителия и инициируют опухолегенный переросток 16 . Поэтому анализ фенотипов опухолей в имагинальных дисках требует тщательного анализаДеградации специфичной для региона восприимчивости к опухолегенным стимулам.
Здесь мы описываем протокол, который индуцирует образование неопластических опухолей в римановых дисках крыс Drosophila с использованием системы GAL4-UAS- RNAi , посредством которой клетки с нокаутом nTSG генерируются в нормальном эпителии диска крыла. Хотя эти экспериментальные системы полезны для изучения ранних стадий рака, четкий классификационный метод для оценки этапов прогрессирования опухоли в эпителии эпиданов эпителия не был четко описан ранее. Поэтому мы также предлагаем диагностический метод для классификации пролонгированных клональных фенотипов, индуцированных в эпителиях крыла диска, по трем категориям: гиперплазия (накопление избыточного количества клеток с нормальным появлением с повышенной пролиферацией), дисплазия (предраковая ткань, состоящая из аномально появляющихся Клетки) и неоплазия (доброкачественная или злокачественная опухоль, состоящая из клеток, имеющих аномальный вид и аномальную картину пролиферации).
Система GAL4-UAS является одним из самых мощных генетических инструментов для целевой экспрессии генов у Drosophila 26 и значительно облегчает индукцию и анализ опухолевых клеток in vivo 4 . Эта система позволяет генерировать клоны, несущие нокдаун генов опухоле…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Дж. Ваугена за критическое чтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами от JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 и научным грантом Научного фонда Takeda до YT
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |