Summary
I dette papir beskrives en detaljeret og yderst effektiv RNA in situ hybridiseringsprotokol, især til lavniveau udtrykte odorantreceptor (OR) gener såvel som andre gener i insektantenner ved anvendelse af digoxigenin (DIG) -mærkede eller biotin-mærkede prober.
Abstract
Insekter har udviklet sofistikerede olfaktoriske modtagelsessystemer til at mærke eksogene kemiske signaler. Disse kemiske signaler transduceres af Olfactory Receptor Neurons (ORN), der er anbragt i hårlignende strukturer, kaldet chemosensilla, af antennerne. På ORN'ernes membraner antages lugtstofreceptorer (OR'er) at være involveret i lugtkodning. Derfor er det nødvendigt at identificere gener, der er lokaliseret til ORN'erne, for at genkende OR-gener og tilvejebringe et grundlæggende grundlag for yderligere funktionelle in situ- undersøgelser. RNA-ekspressionsniveauerne for specifikke OR'er i insektantenner er meget lave, og bevarelse af insektvæv til histologi er udfordrende. Det er således vanskeligt at lokalisere en OR til en bestemt type sensilla ved anvendelse af RNA in situ- hybridisering. I dette papir introduceres en detaljeret og yderst effektiv RNA in situ- hybridiseringsprotokol, især for lavt udtrykte OR-gener af insekter. Derudover er en specifik OR Gen waS identificeret ved at udføre dobbeltfarve fluorescerende in situ hybridiseringsforsøg under anvendelse af et co-ekspressionsreceptorgen, Orco , som en markør.
Introduction
Insektantenner, som er de vigtigste kemosensoriske organer, er dækket af mange hårlignende strukturer - kaldet sensilla - som er inderveret af Olfactory Receptor Neurons (ORNs). På membranet af insekt-ORN'er udtrykkes odorantreceptorer (OR'er), en type protein, der indeholder syv transmembrane domæner, med en coreceptor (ORco) til dannelse af en heteromer, der virker som en lugtgated ionkanal 1 , 2 , 3 . Forskellige OR'er reagerer på forskellige kombinationer af kemiske forbindelser 4 , 5 , 6 .
Locusts ( Locusta migratoria ) er hovedsagelig afhængige af olfaktoriske signaler for at udløse vigtige adfærd 7 . Locust ORs er nøglefaktorer for forståelse af molekylære olfaktoriske mekanismer. Lokalisering af et specifikt locust OR-gen til neuronen af aMorfologisk specifik sensillum type ved RNA In situ Hybridization (RNA ISH) er det første skridt i at udforske ORs-funktionen.
RNA ISH bruger en mærket komplementær RNA-probe til at måle og lokalisere en specifik RNA-sekvens i en del af væv, celler eller hele monteringer in situ , hvilket giver indsigt i fysiologiske processer og sygdomspatogenese. Digoxigenin-mærkede (DIG-mærkede) og biotin-mærkede RNA-prober er blevet anvendt i vid udstrækning i RNA-hybridisering. RNA-mærkning med digoxigenin-11-UTP eller biotin-16-UTP kan fremstilles ved in vitro- transkription med SP6- og T7-RNA-polymeraser. DIG- og biotin-mærkede RNA-prober har følgende fordele: ikke-radioaktive; sikker; stabil; Meget følsomme Meget specifikke; Og nem at producere ved hjælp af PCR og in vitro transkription. DIG- og biotin-mærkede RNA-prober kan være kromogeniske og påvises fluorescens. DIG-mærkede RNA-prober kan detekteres med anti-digoxigeninalkaliNe-fosfatase (AP) -konjugerede antistoffer, der kan visualiseres enten med det højst følsomme kemiluminescerende substrater nitroblue tetrazoliumchlorid / 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphattoluinsalt (NBT / BCIP) ved anvendelse af et optisk mikroskop eller med 2 -hydroxy-3-naphthosyre-2'-phenylanilidphosphat (HNPP) koblet med 4-chlor-2-methylbenzenedizoniumhemi-zinkchloridsalt (Fast Red) under anvendelse af et konfokalt mikroskop. Biotin-mærkede RNA-prober kan påvises med anti-biotin streptavidin Hest Radish Peroxidase (HRP) -konjugerede antistoffer, der kan visualiseres med fluorescein-tyramider under anvendelse af et konfokalt mikroskop. Således kan dobbeltfarve fluorescerende in situ hybridisering udføres for at detektere to målgener i et skive ved anvendelse af DIG- og biotin-mærkede RNA-prober.
RNA ISH med DIG- og / eller biotin-mærkede prober har med succes været anvendt til at lokalisere olfaktorrelaterede gener, såsom OR , ionotrop receptor, lugtstofbindende proteinOg sensorisk neuronmembranprotein i insektantenner af, men ikke begrænset til, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria og ørkensprutten Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Der er imidlertid to væsentlige udfordringer ved udførelse af RNA ISH for insekt-OR'er: (1) ELLER (undtagen ORco ) udtrykkes i lave niveauer og kun i nogle få celler, hvilket gør signaldetektion meget vanskelig, og (2) bevarelse af insektvæv til Histologi, sådan at morfologien bevares og baggrundsstøjen er lav, kan være udfordrende. I dette papir beskrives en detaljeret og effektiv protokol, der beskriver RNA ISH til lokalisering af OR-gener i insektAntenner er præsenteret, herunder både kromogen og tyramid signalforstærkning (TSA) detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: For at begrænse RNA-nedbrydning fremstilles opløsninger ved hjælp af vådautoklaveret destilleret vand (ved 121 ° C i 60 minutter) og også vådautoklavmaterialer.
1. Fremstilling af RNA ISH Antisense og Sense Probes
- Målgenamplifikation og rensning
- Først fremstille et 387 bp dobbeltstrenget fragment af L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) fra plasmidet indeholdende fuld længde cDNA fra LmigOR1 med en Taq DNA-polymerase, der tilføjer adeniner til begge ender af fragmenterne.
- Brug en 100 pi slutreaktionsvolumen, indeholdende 50 pi 2x reaktionsblandingen, 4 pi hver af sense- og antisense-primere (tabel 1), 1 pi plasmid template og 41 pi RNase-fri H2O Brug følgende PCR Protokol: 94 ° C i 5 minutter efterfulgt af 30 cyklusser på 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 minEfterfulgt af 72 ° C i 10 minutter.
- Gentag disse trin for at fremstille det 1.303 bp dobbeltstrengede fragment af LmigOR2 (GenBank: JQ766966) og 1,251 bp dobbeltstrenget fragment af LmigORco (GenBank: JN989549). Primerne anvendt i disse eksperimenter er vist i tabel 1 .
- Kør PCR-produkter på 1,2% agarosegeler i 1x Tris-acetat-EDTA-buffer og visualiser ved anvendelse af ethidiumbromidfarvning.
- Ekstraher disse PCR produkter ved hjælp af et gelekstraktionskit.
- Efter elektroforese binder punktafgift DNA fra gelen og placerer gelskiverne i et 1,5 ml rør. Derefter tilsættes 100 μl bindingsbuffer (buffer PN) pr. 0,1 g gelskive. Vortex og inkuber ved 50 ° C indtil gelskiven er fuldstændigt opløst.
- Indsæt en CA2 adsorptionskolonne i opsamlingsrøret og tilsæt 500 μL balancebuffer (buffer BL). Dette forbedrer absorptionsevnen og stabiliteten af silicamembranen. CentriFuge ved 12.400 xg i 1 min.
- Overfør den opløste gelblanding til adsorptionskolonneenheden og inkuber ved stuetemperatur i 2 minutter. Derefter centrifuger rør ved 12.400 xg i 1 min. Kassér gennemstrømningen og genindsæt adsorptionskolonnen i opsamlingsrøret.
- Tilsæt 600 μl vaskeopløsning (tilsat ethanol, Buffer PW) to gange. Centrifuge ved 12.400 xg i 1 min. Kassér gennemstrømning og genindsæt adsorptionskolonnen i opsamlingsrøret.
- Tøm opsamlingsrøret og nytilvæk kolonnesamlingen ved 12.400 xg i 2 minutter for at muliggøre fordampning af eventuelt rest ethanol.
- Overfør forsigtigt adsorptionskolonnen til et rent 1,5 ml centrifugerør. Luft-tørre pelleten i 5-10 minutter og genopløs DNA'et i et passende volumen ( fx 30 μl) nukleasefrit vand.
- Inkubér ved stuetemperatur i 2 minutter. Centrifuge ved 12.400 xg i 2 min. Kassér adsorptionskolonnen og opbevar DNA'et ved 4 ° C eller -20 ° C.
- Først fremstille et 387 bp dobbeltstrenget fragment af L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) fra plasmidet indeholdende fuld længde cDNA fra LmigOR1 med en Taq DNA-polymerase, der tilføjer adeniner til begge ender af fragmenterne.
- Konstruer de rekombinante plasmider
- Individuelt ligere 387 bp fragmentet af LmigOR1 , 1,303 bp fragment af LmigOR2 og 1,251 bp fragment af LmigORco i en T-vektor, som indeholder promotorer for T7 (opstrøms) og SP6 (nedstrøms) RNA-polymeraser støder op til det indsatte DNA ved anvendelse af T4 DNA ligase. Forbered følgende 10 μl reaktion: 5 μl 2x ligeringsbuffer, 1 μl T vektor, 3 μl (~ 100 ng) af det indsatte gens DNA og 1 μl T4 DNA ligase og inkuber O / N ved 4 ° C.
- Tilsæt 5 μl af hvert rekombinant plasmid indeholdende 387 bp fragmentet af LmigOR1 , 1,303 bp fragment af LmigOR2 og 1,251 bp fragment af LmigORco separat i 50 μl kompetente Escherichia coli DH5a celler i sterile 1,5 ml rør.
- Bland forsigtigt og sæt rørene i is i 30 minutter og inkuber dem derefter i 90 s ved 42° C. Overfør dem tilbage i is i 3 minutter.
- Tilsæt 450 μL Liuria-Bertani (LB) flydende medium uden ampicillin til hvert rør og inkuber dem i en ryster ved 150 omdr./min. I 1 time ved 37 ° C for at genoprette E. coli DH5a.
- Tag en 100 μl alikvot af hver transformant og brug dem til at inokulere LB faste substratplader indeholdende 50 μg / ml ampicillin, 24 μg / ml isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) og 40 μg / ml 5-brom-4 -chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal).
- Inkuber disse plader i en konstant inkubator ved 37 ° C i 18 timer. Screen de målrekombinante plasmider under anvendelse af den blå-hvide screeningsmetode. Sekvensere de målrekombinante plasmider under anvendelse af Sanger-sekventering og identificere de tre OR-geners indsatsretninger.
- Vælg restriktionsendonukleaser for at linearisere rekombinante plasmider
- Brug restriktionsendonukleaser tHat ikke kun fordøjes i vektorens multiple kloningssted, men skærer heller ikke insert DNA. I dette eksperiment indsættes alle 3 gener i T-vektoren i retning svarende til vektoren.
- Brug Nco I restriktionsendonuclease til linearisering af de rekombinante plasmider indeholdende 387 bp fragmentet af LmigOR1 , 1,303 bp fragment af LmigOR2 og 1,251 bp fragment af LmigORco til frembringelse af antisense prober. Brug Sp e I restriktionsendonuclease til at producere sense probes.
BEMÆRK: Hvis indsætningsretningen svarer til den for vektoren, vælges et unikt restriktionssted fra slutningen af T7 for at linearisere det rekombinante plasmid, og SP6-RNA-polymerase anvendes til at fremstille antisense-proben. Et unikt restriktionssted fra slutningen af SP6 er valgt til linearisering af det rekombinante plasmid, og T7-RNA-polymerasen anvendes til at fremstille sense-proben. Ellers, hvis indsætningsretningen ikke svarer til tHan vektor retning, så vælges et unikt restriktionssted fra slutningen af SP6 til linearisering af det rekombinante plasmid, og T7-RNA-polymerase anvendes til at fremstille antisense-proben. Det unikke restriktionssted fra slutningen af T7 er valgt til linearisering af det rekombinante plasmid, og SP6-RNA-polymerasen anvendes til at fremstille sense-probe.
- Oprensning af de lineariserede rekombinante plasmider
- Fordel 20 μg af hvert af de tre rekombinante plasmider indeholdende 387 bp fragmentet af LmigOR1 , 1,303 bp fragment af LmigOR2 og 1,251 bp fragment af LmigORco ved anvendelse af Nco I-restriktionsendonukleasen i en 100 μl reaktion, der indeholder 10 μl 10x buffer, 40 μl 0,5 pg / pl plasmid, 3 pi Ncol og 47 pi RNase-fri H2O, efterfulgt af en 3 timers inkubation ved 37 ° C.
- Tilsvarende fordøjes 20 μg af hvert af disse tre rekombinante plasmider uSynge Spe I restriktionsendonukleasen.
- Oprensning af disse fordøjede plasmider under anvendelse af et gelekstraktionskit som beskrevet i 1.1.2. Bestem koncentrationerne af disse ekstraherede lineariserede rekombinante plasmider ved spektrofotometri og juster til 0,5 μg / μl.
- Forbered antisense og sense probes
- Brug T7 / SP6 RNA transkriptionssystemet til at generere antisense og sense probes. SP6-RNA-polymerase anvendes til at transkribe dobbeltstrenget RNA til DIG- og biotin-mærkede antisensprober for disse tre OR-gener ved anvendelse af lineariserede rekombinante plasmider som templates in vitro . T7-RNA-polymerasen anvendes til fremstilling af sense-prober. Udfør reaktionen i et 20 μl slutvolumen indeholdende 2 μl 10x NTP-blanding, 2 μl 10X transkriptionsbuffer, 1 μl RNase-inhibitor, 2 μl T7 eller SP6-RNA-polymerase, 4 μl 0,5 μg / μl lineariseret plasmid og 9 pi RNase-fri H2O, efterfulgtVed en 3 h inkubation ved 37 ° C.
- Inkuber de DIG- og biotinmærkede antisense- og senseprober i 30 minutter med 1 μl DNase ved 37 ° C. Tilsæt 2,5 μl 5 M LiCl og 75 μl absolut ethanol, og inkuber derefter reaktionerne i 30 minutter ved -70 ° C.
- Centrifuge ved 15.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Dekomponerer forsigtigt supernatanten. Tilsæt 150 μl 70% ethanol for at vaske bundfældningen. Forbered 70% ethanol (1 L) ved at tilsætte 95% ethanol (736,8 ml) til sterilt destilleret vand (263,2 ml).
- Centrifuger ved 15.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C igen og lufttør pelleten i 5-10 minutter ved stuetemperatur. 25 pi RNase-frit H2O at opløse RNA antisense og sense prober.
- Hvis længden af det indsatte gen er længere end 1 kb, efterfølgende fragmenterer RNA-antisense og senseprober til en gennemsnitlig længde på ~ 300 bp ved inkubering i en bicarbonat-carbonatbufferopløsninger. Udfør reaktionen i et 50 μl slutvolumen, containing 25 pi RNA-proben og 25 pi af bicarbonat-carbonat pufferopløsning (80 mM NaHCO3, 120 mM Na 2CO 3, pH 10,2) ved 60 ° C. Den krævede hydrolysetid er givet ved en tidligere offentliggjort formel 17 .
- Tilsæt 5 μl 10% eddikesyre for at stoppe reaktionen. I dette eksperiment fragmentere LmigOR2- og LmigORco- antisense- og sense-proberne i henholdsvis 24 og 23 minutter.
T = (L o- L f ) / kXL o XL f
L o = de oprindelige fragmentlængder i kb
Lf = de endelige fragmentlængder i kb
K = hastighedskonstanten for hydrolyse, ca. 0,11 kb -1 min -1
T = hydrolysetiden i min - Til sidst tilsættes 250 μl hybridiseringsbuffer og opbevares ved -80 ° C.
2. Fremstilling af kryostatafsnit
- Forkæle freeziNg mikrotome til -24 ° C.
- Vælg nye moltende voksne græshoppe, der er aktive og har intakte antenner. Skær antennerne i 2-3 mm stykker ved hjælp af sterile barbermaskiner.
- Sæt OCT-forbindelse på en frysende mikrotomeholder og læg en eller to prøver på sammensætningen vandret. Derefter overføres holderen til det frysende mikrotom ved -24 ° C for at ækvilibrere, indtil forbindelsen fryser. Tag holderen ud og dække prøverne med en lille forbindelse. Overfør holderen i det frysende mikrotom ved -24 ° C igen i mindst 10 minutter ( figur 1 ).
BEMÆRK: Undgå at få bobler i forbindelsen. - Fastgør holderen med prøverne i det frysende mikrotom, og sektioner derefter de frosne prøver i 12 μm tykke skiver ved -24 ° C.
- Thaw montere skiverne en efter en på dias (25 x 75 mm; nukleasefri) og lufttørre i 10 min.
3. Fastgørelsesafsnit
- Efter fremstilling af kryostatSektioner, sæt gliderne i en plastikbeholder (~ 100 x 40 x 80 mm) og fiks vævene ved at inkubere gliderne i 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask diaserne i 1 x fosfatbuffet saltvand (PBS) i 1 min.
- For at eliminere de alkaliske proteiner, overfør gliderne til 0,2 M HCI i 10 minutter.
- For at eliminere overfladeproteinet af nukleinsyre overfør slides til 1XPBS med 1% Triton X-100 i 2 minutter.
- Vask diasene to gange i 30 s i 1x PBS.
- Til sidst skylles gliderne i formamidopløsning i 10 minutter ved 4 ° C.
4. Hybridisering
- Forbered antisense og sense probes
- Brug hybridiseringspuffer til fortyndede RNA-antisense- eller sense-prober i de 1,5 ml nukleasefrie rør. I dette forsøg tilsættes for alle antisense- og sansproberne ( LmigOR1, LmigOR2 og LmigOrco ) 1 μl sonde til 99 μgL hybridiseringsbuffer pr. Dias. Generelt giver brugen af 1: 100 fortyndinger af antisensprober signifikante positive signaler og lave baggrunde ved anvendelse af denne protokol.
- Til kromatisk påvisning udtyndes DIG-mærkede prober enkeltvis.
- Til TSA detektion, fortynd DIG-mærket LmigOR1 med biotin-mærkede LmigOrco prober eller DIG-mærket LmigOR2 med biotin-mærkede LmigOR1 prober sammen i hybridiseringsbufferen.
- Opvarm fortyndingerne i 10 minutter ved 65 ° C og læg dem på is i mindst 5 minutter.
- Hybridisering
- Dræn gliderne og tilsæt vævssektionerne 100 μl fortyndede antisense- og sense-prober (trin 4.1). Derefter placeres dæksler (24 mm x 50 mm, nukleasefrit) på vævssektionerne.
- Placer de overdækkede dias horisontalt i en fugtig kasse (~ 300 x 180 x 50 mm 3 ; Figur 2 ) og inkubér enT 55 ° C i 22 timer. Tilsæt formamidopløsning eller 1X PBS til bunden af kassen for at holde miljøet fugtigt, men undgå at sænke gliderne i væsken.
- Vask og blokering.
- Efter hybridisering skal du forsigtigt fjerne dækslipene. Vask objektglassene to gange i 30 minutter i 0,1x Saline Sodium Citrate (SSC) ved 60 ° C.
BEMÆRK: Vaskning betyder at sætte diasene i en diasholder, der derefter anbringes i en plastikbeholder og omrystes forsigtigt på en vippe (~ 50 omdrejninger pr. Minut, figur 2 ). - Skyl diaserne i 1x Tris-Buffered Saline (TBS) i 30 s.
- Tilsæt 1 ml 1% blokeringsreagens i TBS suppleret med 0,03% Triton X-100 på hvert dias, og inkuber i 30 minutter. Derefter kassere blokeringsopløsningen.
- Efter hybridisering skal du forsigtigt fjerne dækslipene. Vask objektglassene to gange i 30 minutter i 0,1x Saline Sodium Citrate (SSC) ved 60 ° C.
- Immunhistokemi.
- Til kromogen påvisning, brug blokeringsreagens i TBS til fortynd 750 enheder (U) / ml anti-digoxigenin AP-konjugeret antiboDy til 1,5 U / ml AP opløsning. Tilsæt 100 μL AP-opløsning pr. Dækket (24 mm x 50 mm) dias.
- Til TSA-detektion, brug blokeringsreagens i TBS til fortynding 750 U / ml anti-digoxigenin AP-konjugeret antistof og anti-biotin streptavidin HRP-konjugeret antistof til AP / HRP-opløsningen. Tilsæt 100 μL AP / HRP-opløsning pr. Dækket (24 mm x 50 mm) dias.
- Inkubér diasene i en fugtig kasse ( figur 2 ) i 60 minutter ved 37 ° C. Brug formamidopløsningen eller 1X PBS til at holde boksen fugtig, men ikke blød.
5. Farvning
- Fjern afdækningen forsigtigt. Vask diaserne tre gange i 5 minutter i 1x TBS suppleret med 0,05% Tween-20. Skyl diaserne i DAP-buffer (kromogen påvisning: pH 9,5; TSA-detektion: pH 8,0) i 5 min.
- Farvning (kromogen påvisning)
- Tilsæt 100 μL NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) substratopløsning (fortyndet i DAP;PH 9,5) til hvert lysbillede. Placer forsigtigt dæksler (24 x 50 mm) på gliderne.
- Inkubér diasene i en fugtig kasse med substratopløsning i 10 minutter - O / N ved 37 ° C.
BEMÆRK: Kontrollér udviklingen ved at kigge på lysbillederne fra tid til anden under mikroskopet. - Når udviklingen er klar, stop reaktionen ved at overføre gliderne til vand.
- Farvning (TSA detektion)
- Brug en sprøjte til at flytte HNPP (100 μg / ml) / Fast Rød (250 μg / ml) substrat fra sprøjtefilteret (0,22 μm; Figur 2 ).
- Tilsæt 100 μL HNPP / Fast Rødt substrat pr. Dias dækket med et dækslip (24 x 50 mm). Inkubér diasene i 30 minutter med HNPP / Fast Red substrat ved RT.
- Fjern afdækningen forsigtigt, og vask dyserne tre gange i 5 minutter i 1X TBS suppleret med 0,05% Tween-20.
- Brug 100 μL TSA substrat / dækket (24 x 50 mm 2 ) glide. Inkubér diasene med TSA substrat i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern afdækningen forsigtigt, og vask dyserne tre gange i 5 minutter i 1x TBS suppleret med 0,05% Tween-20.
- Embed gliderne i PBS / glycerol (1: 3).
BEMÆRK: Efter afslutningen af disse procedurer skal diaserne overholdes så hurtigt som muligt, fordi fluorescerende signal slukker hurtigt.
6. Observation
- Kromogen påvisning
- Overhold vævssektioner ved brug af et optisk mikroskop. Vælg objektivene 10X, 20X og 40X for at observere resultaterne af kromogen detektion.
- Brug DP-BSW software til at analysere resultaterne og fange billederne.
- TSA detektion
- Overhold vævssektioner ved hjælp af et konfokalt mikroskop. DIG-mærkede gener bør observeres under 543 nm lys, der præsenterer en rød farve, og biotin-mærkede gener skal væreObserveret under 488 nm lys og præsenterer en grøn farve. Når de kommer frem, præsenterer de gul farve.
- Vælg 20X og 40X objektivlinserne for at observere resultaterne af TSA-detektion.
- Brug FV1000 software til at analysere resultaterne og fange billederne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved kromogen påvisning blev en lille delmængde af antennalcellerne i hver voksenantennedel betegnet af de DIG-mærkede LmigOR1- og LmigOR2- antisensprober ( Figur 3 ). RNA ISH i på hinanden følgende sektioner for at lokalisere LmigOR1 og LmigOR2 viste, at antennalceller , der udtrykker de to gener, var placeret i ORN-klynger, der udtrykker LmigORco , hvilket indikerer, at det formodede LmigOR1 og LmigOR2 faktisk blev udtrykt i ORN'er ( Figur 4a -4d ). Lejlighedsvis blev mærkede dendritiske strukturer visualiseret ( figur 4e -4f ). LmigOR1 og LmigOR2 var begge lokaliserede til neuroner i den basiske sensilla ( Figur 5a-5b ), men de blev ikke co-udtrykt i individuel sensilla, hvilket indikerede at de var til stede i forskellige basico Nic sensillium subtyper ( figur 5c-5 d ).
I TSA-detektion viste dobbeltfarve fluorescerende in situ- hybridisering, at LmigOR1-ekspressionsceller (rød farve) var placeret i ORN-klynger, der udtrykker LmigORco (grøn farve), hvilket indikerer, at det formodede LmigOR1 blev udtrykt i ORN'er ( figur 6a ). Et tæt billede af de boksede områder i figur 6a er vist i figur 6b . LmigOR1 - udtrykker neuroner (grøn farve, figur 7a ) og LmigOR2-ekspressende neuron (rød farve, figur 7b ) var lokaliseret til forskellige basiske sensillium subtyper ( Figur 7c ).
4 / 55924fig1.jpg "/>
Figur 1: Fremstilling af insektantennesektioner til RNA i situ- hybridisering. ( A ) det frysende mikrotom; ( Bc ) Prøverne er indlejret i frysende OCT-forbindelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksperimentelle elementer til RNA i situ- hybridisering . ( A ) Slideholderen og plastbeholderen. ( B ) Den fugtige kasse. ( C ) vipperen. ( D ) membranfilteret. ( E ) konfokalmikroskop. .jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cellulær lokalisering af LmigOR1 og LmigOR2 i olfaktoriske organer. ( A ) Oversigt over LmigOR1-ekspresserende celler i et locustantennalsegment . ( B ) Oversigt over LmigOR2-ekspresserende celler i et locust antennalsegment. Pilehoveder angiver celler, der udtrykker LmigOR1 ( a ) og LmigOR2 ( b ). Skalestænger = 100 μm (a og b). Tallene blev tilpasset fra Xu et al. 12 Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Neuronal identitet af antennceller, der udtrykker LmigOR'er ved kromogene detektioner. ( Ab ) Mærkningsmønsteret for LmigOR1 ( a ) og LmigORco ( b ) antisensonde på på hinanden følgende sektioner af johannesbrødsantenne. ( Cd ) Mærkningsmønsteret for LmigORco ( c ) og LmigOR2 ( d ) antisense sonde på på hinanden følgende sektioner af johannesbrødsantenne. ( Ef ) Illustration af lejlighedsvis mærkede dendritisk-lignende strukturer (angivet med røde pile). Skalestænger = 50 μm (ad); 20 μm (e og f). Tallene blev tilpasset fra Xu et al. 12 Klik her for at se en større version af denne figur. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 5: LmigOR1 & LmigOR2 er udtrykt i ORN'er indbygget i Basiconic Sensilla. ( Ab ) Basiconic sensillum-husede ORN'er, der udtrykker LmigOR1 ( a ) og LmigOR2 ( b ). ( Cd ) Udtrykket af LmigOR1 og LmigOR2 i særskilt undergruppe af antennale ORN'er blev verificeret på på hinanden følgende sektioner (cd). Arrowheads angiver antennalceller, der udtrykker LmigOR1 (a, c) og LmigOR2 (b, d). Ba: basiconic sensillum. Skalestænger = 20 μm (a og b); 50 μm (c og d). Tallene blev tilpasset fra Xu et al. 12 Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Neuronal identitet af antennalcelle udtrykker LmigOR1 ved TSA-detektioner. ( A ) To-farves in situ hybridisering blev udført på langsgående antennesektion for at illustrere ekspressionen af LmigOR1 (Rød) og LmigORco (Green). Lokalisering af LmigOR1 -ekspresserende celler i celleklynger, der udtrykker LmigORco, bekræftede sin neurale identitet. ( B ) Nærbillede af boksede områder i a. Lejlighedsvis mærkede dendritiske lignende strukturer blev angivet med pil. Cirklede områder angiver ORNs klyngeudtryk LmigORco og deler samme sensillum. Skalestænger = 50 μm (a); 20 μm (b). Tallene blev tilpasset fra Xu et al. 12 Venligst cSlikke her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: LmigOR1 & LmigOR2 var placeret til forskellige basiconic sensilla-ORN'er ved TSA-detektion. Fluorescerende signaler blev visualiseret ved anvendelse af detektionssystemer, der indikerede LmigOR1- mærkede neuroner ved hjælp af grønne fluorescens ( a ) og LmigOR2- positive celler ved rød fluorescens ( b ) blev udtrykt i forskellige basiconiske sensillasubtyper ( c ). Arrowheads angiver antennalceller, der udtrykker LmigOR1 og LmigOR2 . Skalestænger = 20 μm. Tallene blev tilpasset fra Xu et al. 12 Klik her for at se enStørre version af denne figur.
| Navn | sekvenser |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
Tabel 1: Sekvenserne af PCR-primerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er svært at udføre RNA ISH for at lokalisere OR-gener i insektantenner, fordi ekspressionsniveauerne af OR-gener, undtagen ORco , er meget lave og bevaring af histologiske skiver af insektantenner er meget vanskeligt. Derudover er TSA-detektion også meget vanskelig. For at løse disse problemer bør følgende foranstaltninger træffes. Antennene er valgt fra nyligt smeltende voksne græshoppe, der har tynde og bløde antennalskiklinger, som bevarer deres morfologi på glideren. De frosne prøver er snittet i 12 μm tykke skiver. Meget følsomme og specifikke biotin- og DIG-mærkede prober anvendes. Vaskemidler, såsom Tween-20 og Triton X-100, bruges til at reducere baggrunden i mange trin. Ved TSA-detektion bør et højt udtrykt gen i forhold til et andet lavt udtrykt gen mærkes med biotin-16-UTP. Slidesne skal overholdes så hurtigt som muligt, fordi de fluorescerende signaler vil slukke hurtigt.
DIG-aNd biotin-mærkede prober har fordelene ved længere holdbarhed, højere signal-støjforhold og bedre cellulære opløsninger end radioaktive sonder 18 , 19 . Protokollen præsenteret i dette papir har nogle fordele i forhold til helmontering i situ hybridisering. Denne protokol identificerer let lokaliseringerne af gener på cellulær niveau, men kan ikke let bruges til at undersøge genfordelingsmønstre, hvilket lettere udføres med hel mount in situ hybridisering.
For at identificere et OR-gen blev to metoder taget. Den ene var den kromogene påvisning i sammenhængende sektioner, og den anden var fluorescerende detektion i et afsnit. ORco er co-udtrykt med en specifik OR som en ORN markør 10 , 20 , 21 . Celler, der udtrykker LmigOR1 eller LmigOR2, var begge placeretTil klynger af LmigORco-ekspresserende celler, der entydigt verificerede dem som OR'er ( figur 4 og figur 6 ). Ved hjælp af de samme fremgangsmåder fandt vi, at LmigOR1 og LmigOR2 ikke er co-udtrykt i en sensillum. Resultaterne af disse to tilgange er bekræftende.
Denne protokol blev også med succes brugt til at lokalisere LmigORco, SgreORco, SgreIR8a og SgreIR25a i johannesbrændeantenner 10 , 14 . For nylig blev LmigOR3 lokaliseret til trichoid sensilla neuroner i L. migratoria ved anvendelse af samme protokol 15 . Denne protokol blev brugt til at lokalisere to sensoriske neurale membranproteiner SgreSNMP1 og SgreSNMP2 i antenner af S. gregaria 16 . Således er denne protokol pålideligt lokaliserede kemosensorrelaterede gener i johannesbrødantenner, som ikke kun verificerede disseKandidatgener, men lokaliserede også disse gener til specifikke celler indeholdt i forskellige typer sensilla.
Som konklusion er denne meget effektive protokol af RNA ISH specifikt beskrevet for at lokalisere OR-gener, såvel som andre gener udtrykt i lave niveauer, i insektantenner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at oplyse eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende med det formål at levere specifikke oplysninger og indebærer ikke en anbefaling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
