Summary
I detta dokument beskrivs ett detaljerat och högeffektivt RNA in situ- hybridiseringsprotokoll, särskilt för lågnivåer uttryckta luktantreceptor (OR) -gener liksom andra gener i insektsantenner med digoxigenin (DIG) -märkta eller biotinmärkta prober.
Abstract
Insekter har utvecklat sofistikerade olfaktiva mottagningssystem för att känna av exogena kemiska signaler. Dessa kemiska signaler transduceras av olfaktoriska receptorns neuroner (ORN) som är inrymda i hårliknande strukturer, kallad chemosensilla, av antennerna. På ORNs membran, antages det att odorantreceptorer (OR) är involverade i luktkodning. Att kunna identifiera gener som är lokaliserade till ORN-erna är således nödvändiga för att identifiera OR-gener och utgör en grundläggande grund för ytterligare funktionella in situ- studier. RNA-uttrycksnivåerna för specifika OR s i insektsantenner är mycket låga, och bevarande av insektsvävnad för histologi är utmanande. Således är det svårt att lokalisera en OR till en specifik typ av sensilla med användning av RNA in situ- hybridisering. I detta dokument införs ett detaljerat och högeffektivt RNA in situ- hybridiseringsprotokoll, särskilt för lågt uttryckta OR-gener av insekter. Dessutom en specifik OR Gen waS identifieras genom att genomföra tvåfärgade fluorescerande in situ- hybridiseringsexperiment med användning av en samuttryckande receptorgen, Orco , som en markör.
Introduction
Insektantenner, som är de viktigaste kemosensoriska organen, är täckta av många hårliknande strukturer - kallad sensilla - som är innerverade av Olfactory Receptor Neurons (ORNs). På membranet av insekts-ORNs uttrycks luktantreceptorer (OR), en typ av protein innehållande sju transmembrana domäner, med en coreceptor (ORco) för att bilda en heteromer som fungerar som en luktantgatedjonskanal 1 , 2 , 3 . Olika ORs svarar mot olika kombinationer av kemiska föreningar 4 , 5 , 6 .
Sprängor ( Locusta migratoria ) beror huvudsakligen på olfaktoriska signaler för att utlösa viktiga beteenden 7 . Locust ORs är viktiga faktorer för att förstå molekylära olfaktoriska mekanismer. Lokalisera en specifik locust OR-gen till neuron av aMorfologiskt specifik sensillumtyp av RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) är det första steget i att utforska OR-funktionen.
RNA ISH använder en märkt komplementär RNA-sond för att mäta och lokalisera en specifik RNA-sekvens i sektion av vävnad, celler eller hela fästen in situ , vilket ger insikter i fysiologiska processer och sjukdomspatogenes. Digoxigeninmärkta (DIG-märkta) och biotinmärkta RNA-prober har använts i stor utsträckning vid RNA-hybridisering. RNA-märkning med digoxigenin-11-UTP eller biotin-16-UTP kan framställas genom in vitro- transkription med SP6- och T7-RNA-polymeraser. DIG- och biotinmärkta RNA-prober har följande fördelar: icke-radioaktiva; säker; stabil; Mycket känslig; Mycket specifika; Och lätt att producera med hjälp av PCR och in vitro transkription. DIG- och biotinmärkt RNA-prober kan vara kromogena och detekteras fluorescens. DIG-märkta RNA-prober kan detekteras med anti-digoxigeninalkaliNe-fosfatas (AP) -konjugerade antikroppar som kan visualiseras antingen med de högkänsliga kemiluminiscenta substraterna nitroblue tetrazoliumklorid / 5-brom-4-klor-3-indolylfosfattolu-dinsaltet (NBT / BCIP) med användning av ett optiskt mikroskop eller med 2 -hydroxi-3-naftosyra-2'-fenylanilidfosfat (HNPP) kopplad med 4-klor-2-metylbensen-di-etiumhemi-zinkkloridsalt (Fast Red) med användning av ett konfokalt mikroskop. Biotin-märkta RNA-prober kan detekteras med anti-biotin streptavidin hästradishperoxidas (HRP) -konjugerade antikroppar som kan visualiseras med fluoresceindyramider med användning av ett konfokalt mikroskop. Således kan fluorescerande in situ hybridisering med dubbel färg utföras för att detektera två målgener i en skiva med användning av DIG- och biotinmärkt RNA-prober.
RNA ISH med DIG- och / eller biotin-märkta prober har framgångsrikt använts för att lokalisera olfaktorrelaterade gener, såsom OR , jonotrop receptor, lukt-bindande proteinOch sensoriskt neuronmembranprotein, i insektsantenner av, men inte begränsat till, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria och ökengräshoppet Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Det finns emellertid två stora utmaningar när man utför RNA ISH för insekts-OR: (1) ELLER (utom ORco ) uttrycks i låga nivåer och endast i några celler, vilket gör signaldetektering mycket svårt och (2) bevarar insektsvävnad för Histologi, så att morfologin bevaras och bakgrundsbruset är lågt, kan vara utmanande. I detta dokument beskrivs ett detaljerat och effektivt protokoll som beskriver RNA ISH för lokalisering av OR-gener i insekterAntenner presenteras, inklusive både kromogen och tyramid Signal Amplification (TSA) detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS! För att begränsa RNA-nedbrytning, förbereda lösningar med vått autoklaverat destillerat vatten (vid 121 ° C i 60 minuter) och även våt-autoklavmaterial.
1. Framställning av RNA ISH-antisens och sansprober
- Målgenamplifiering och rening
- Först producerar ett 387 bp dubbelsträngat fragment av L. migratoria OR1 ( LmigORl , GenBank: JQ766965) från plasmiden innehållande full längd cDNA av LmigORl med ett Taq DNA-polymeras som adderar adeniner till båda ändarna av fragmenten.
- Använda en 100 | il slutlig reaktionsvolym, innehållande 50 mikroliter av 2x reaktionsblandning, 4 mikroliter vardera av sens- och antisens-primrar (Tabell 1), 1 pl av plasmid-mall, och 41 mikroliter av RNas-fritt H2O Använd följande PCR Protokoll: 94 ° C i 5 min, följt av 30 cykler av 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s och 72 ° C under 1 min, Följt av 72 ° C i 10 min.
- Upprepa dessa steg för att producera 1,303 bp dubbelsträngat fragment av LmigOR2 (GenBank: JQ766966) och 1,251 bp dubbelsträngat fragment av LmigORco (GenBank: JN989549). Primerna som användes i dessa experiment presenteras i tabell 1 .
- Kör PCR-produkter på 1,2% agarosgeler i 1x Tris-acetat-EDTA-buffert och visualisera med användning av etidiumbromidfärgning.
- Extrahera dessa PCR-produkter med hjälp av ett geluttagssats.
- Efter elektrofores binder punktskatt DNA från gelén och placerar gelskivorna i ett 1,5 ml rör. Därefter tillsätt 100 μl bindningsbuffert (buffert PN) per 0,1 g gelskiva. Virvel och inkubera vid 50 ° C tills gelskivan är helt upplöst.
- Sätt in en CA2-adsorptionskolonn i uppsamlingsröret och tillsätt 500 μl balansbuffert (buffert BL). Detta förbättrar absorptionsförmågan och stabiliteten hos silikamembranet. CentriFuge vid 12 400 xg i 1 min.
- Överför den upplösta gelblandningen till adsorptionskolonnaggregatet och inkubera vid rumstemperatur i 2 minuter. Därefter centrifugera rören vid 12 400 xg i 1 min. Kassera genomflödet och sätt in adsorptionskolonnen i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 600 μL tvättlösning (etanol tillsatt, Buffert PW) två gånger. Centrifugera vid 12 400 xg under 1 min. Kassera genomströmning och sätt in adsorptionskolonnen i uppsamlingsröret.
- Töm uppsamlingsröret och återflöda kolonnaggregatet vid 12 400 xg under 2 min för att tillåta avdunstning av eventuell kvarvarande etanol.
- Överför försiktigt adsorptionskolonnen till ett rent 1,5 ml centrifugrör. Lufttorka pelleten i 5-10 minuter och återupplösa DNA i en lämplig volym (t ex 30 | il) nukleasfritt vatten.
- Inkubera vid RT i 2 min. Centrifugera vid 12 400 xg under 2 min. Kassera adsorptionskolonnen och lagra DNA: n vid 4 ° C eller -20 ° C.
- Först producerar ett 387 bp dubbelsträngat fragment av L. migratoria OR1 ( LmigORl , GenBank: JQ766965) från plasmiden innehållande full längd cDNA av LmigORl med ett Taq DNA-polymeras som adderar adeniner till båda ändarna av fragmenten.
- Konstruera de rekombinanta plasmiderna
- Individuellt ligera 387 bp-fragmentet av LmigOR1 , 1,303 bp-fragment av LmigOR2 och 1,251 bp-fragment av LmigORco i en T-vektor som innehåller promotorer för T7 (uppströms) och SP6 (nedströms) RNA-polymeraser intill det infogade DNA med användning av T4-DNA-ligas. Förbered följande 10 μl reaktion: 5 μl 2x ligationsbuffert, 1 μl T-vektor, 3 μL (~100 ng) av den infogade genens DNA och 1 μl T4 DNA-ligas och inkubera O / N vid 4 ° C.
- Tillsätt 5 μl av varje rekombinant plasmid innehållande 387 bp-fragmentet av LmigORl , 1,303 bp-fragment av LmigOR2 och 1,251 bp-fragment av LmigORco separat i 50 μl kompetenta Escherichia coli DH5a-celler i sterila 1,5 ml-rör.
- Blanda försiktigt och sätt rören i is i 30 minuter och inkubera dem sedan i 90 s vid 42° C. Överför dem tillbaka till is i 3 minuter.
- Tillsätt 450 μL flytande medium Luria-Bertani (LB) utan ampicillin till varje rör och inkubera dem i en skakning vid 150 rpm i 1 h vid 37 ° C för att återställa E. coli DH5a.
- Ta en 100 μl alikvot av varje transformant och använd dem för att inokulera LB-fast substratplattor innehållande 50 μg / ml ampicillin, 24 μg / ml isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) och 40 μg / ml 5-brom-4 Klor-3-indolyl-P-D-galaktopyranosid (X-gal).
- Inkubera dessa plattor i en konstant inkubator vid 37 ° C under 18 timmar. Skärma de målrekombinanta plasmiderna med användning av den blåvita screeningsmetoden. Sekvensera de målrekombinanta plasmiderna genom att använda Sanger-sekvensering och identifiera de tre OR-genernas insättningsriktningar.
- Välj restriktionsendonukleaser för att linearisera rekombinanta plasmider
- Använd restriktionsendonukleaser tMössa inte bara i vektorens multipla kloningsställe men skär inte heller insats-DNA. I detta experiment införs alla 3 gener i T-vektorn i den riktning som motsvarar den hos vektorn.
- Använd Nco I-restriktionsendonukleas för att linearisera de rekombinanta plasmiderna innehållande 387 bp-fragmentet av LmigORl , 1,303 bp-fragment av LmigOR2 och 1,251 bp-fragment av LmigORco för att producera antisensproberna. Använd Sp e I-restriktionsendonukleas för att producera sansproberna.
ANMÄRKNING: Om insatsriktningen motsvarar den hos vektorn väljs en unik restriktionsplats från änden av T7 för att linearisera den rekombinanta plasmiden och SP6-RNA-polymeras används för att framställa antisens-proben. Ett unikt restriktionsställe från slutet av SP6 väljs för att linjärisera den rekombinanta plasmiden och T7-RNA-polymeraset används för att framställa sondproben. Annars, om insatsriktningen inte motsvarar tHan vektors riktning väljs en unik restriktionsplats från slutet av SP6 för att linjärisera den rekombinanta plasmiden och T7-RNA-polymeras används för att framställa antisens-proben. Den unika restriktionsstället från änden av T7 väljs för att linjärisera den rekombinanta plasmiden och SP6-RNA-polymeraset används för att framställa sansproben.
- Rening av de linjäriserade rekombinanta plasmiderna
- Digestera 20 μg av var och en av de tre rekombinanta plasmiderna innehållande 387 bp-fragmentet av LmigORl , 1,303 bp-fragment av LmigOR2 och 1,251 bp-fragment av LmigORco med användning av Nco I-restriktionsendonukleaset i en 100 | il reaktion som innehåller 10 | il 10x buffert, 40 | il 0,5 pg / pL-plasmid, 3 mikroliter av Ncol och 47 mikroliter av RNas-fritt H2O, följt av en 3 timmars inkubation vid 37 ° C.
- På samma sätt digerera 20 μg av var och en av dessa tre rekombinanta plasmider uSjunga Spe I-restriktionsendonukleas.
- Rening av dessa digererade plasmider med användning av ett gel extraktions kit som beskrivs i 1.1.2. Bestäm koncentrationerna av dessa extraherade linjäriserade rekombinanta plasmider genom spektrofotometri och justera till 0,5 μg / μl.
- Förbered antisens och sensprober
- Använd T7 / SP6-RNA-transkriptionssystemet för att generera antisens- och sensprober. SP6 RNA-polymeras används för att transkribera dubbelsträngad RNA för DIG- och biotin-märkta antisensprober för dessa tre OR-gener genom att använda linjäriserade rekombinanta plasmider som mallar in vitro . T7-RNA-polymeraset används för att producera sansprober. Utför reaktionen i en 20 μl slutvolym innehållande 2 | j, l av 10x NTP-blandning, 2 xl av 10X transkriptionsbuffert, 1 xl RNasinhibitor, 2 xl T7 eller SP6 RNA-polymeras, 4 xl av linjiserad plasmid 9 | il RNas-fri H2O, följtGenom en 3 h inkubation vid 37 ° C.
- Inkubera de DIG- och biotin-märkta antisens- och sensproberna i 30 min med 1 | j, l DNas vid 37 ° C. Tillsätt 2,5 μL 5 M LiCl och 75 μL absolut etanol, inkubera sedan reaktionerna i 30 minuter vid -70 ° C.
- Centrifugera vid 15 000 xg i 30 min vid 4 ° C. Dekantera försiktigt supernatanten. Tillsätt 150 μL 70% etanol för att tvätta utfällningen. Förbered 70% etanol (1 liter) genom att tillsätta 95% etanol (736,8 ml) till sterilt destillerat vatten (263,2 ml).
- Centrifugera vid 15 000 xg i 30 minuter vid 4 ° C igen och lufttorka pelleten i 5-10 minuter vid RT. Tillsätt 25 mikroliter av RNas-fritt H2O för upplösning av RNA-antisens och sens-sonder.
- Om längden på den insatta genen är längre än 1 kb, sönderfö-rer därefter fragment-RNA-antisens och -sens till en medellängd av ~ 300 bp genom inkubering i en bikarbonat-karbonatbuffertlösning. Utför reaktionen i en 50 μl slutvolym, containing 25 | il av RNA-sonden och 25 mikroliter av bikarbonat-karbonatbuffertlösning (80 mM NaHCOs 3, 120 mM Na 2 CO 3, pH 10,2) vid 60 ° C. Den erforderliga hydrolys-tiden ges av en tidigare publicerad formel 17 .
- Tillsätt 5 μl 10% ättiksyra för att stoppa reaktionen. I detta experiment fragmentera LmigOR2- och LmigORco- antisens- och sensproberna i 24 respektive 23 minuter.
T = (L o- L f ) / kXL o XL f
L o = de ursprungliga fragmentlängderna i kb
Lf = de slutliga fragmentlängder i kb
K = hastighetskonstanten för hydrolys, ungefär 0,11 kb -1 min -1
T = hydrolys tid i min - Slutligen tillsätt 250 μl hybridiseringsbuffert och lagra vid -80 ° C.
2. Framställning av kryostatavsnitt
- Förkrossa freeziNg mikrotom till -24 ° C.
- Välj nya moltande vuxna johannesar som är aktiva och har intakta antenner. Skär antennerna i 2-3 mm bitar med hjälp av sterila rakhyvlar.
- Sätt OCT-förening på en frysande mikrotomhållare och sätt ett eller två prov på föreningen horisontellt. Överför sedan hållaren i den frysande mikrotomen vid -24 ° C för att jämvikta tills föreningen fryser. Ta ut hållaren och täck proven med en liten förening. Överför hållaren i frysnings mikrotomen vid -24 ° C igen under minst 10 minuter ( Figur 1 ).
OBS: Undvik att få bubblor i föreningen. - Fäst hållaren med proven i den frysande mikrotomenen, och dela sedan de frysta proven i 12 μm tjocka skivor vid -24 ° C.
- Tina montera skivorna en efter en på glidbanor (25 x 75 mm, nukleasfri) och lufttorka i 10 min.
3. Fästdelar
- Efter beredning av kryostatSektioner, lägg glidorna i en plastbehållare (~ 100 x 40 x 80 mm) och fixa vävnaderna genom att inkubera glidbanorna i 4% paraformaldehydlösning (PFA) i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta glidglasen i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 1 min.
- För att eliminera de alkaliska proteinerna, överför glidorna till 0,2 M HCl i 10 min.
- För att eliminera ytproteinet av nukleinsyra, överför glidorna till 1XPBS med 1% Triton X-100 i 2 min.
- Tvätta bilderna två gånger i 30 s i 1x PBS.
- Skölj slutligen skivorna i formamidlösningen i 10 minuter vid 4 ° C.
4. Hybridisering
- Förbered antisens och sensprober
- Använd hybridiseringsbuffert till utspädda RNA-antisens- eller sensprober i de 1,5 ml nukleasfria rören. I detta experiment, för alla antisens- och sensproberna ( LmigOR1, LmigOR2 och LmigOrco ), tillsätt 1 pl prob till 99 μlL hybridiseringsbuffert per bild. Generellt ger användningen av 1: 100 spädningar av antisensprober signifikanta positiva signaler och låga bakgrunder med användning av detta protokoll.
- För kromogen detektion, späd DIG-märkta prober individuellt.
- För TSA-detektion, späd DIG-märkt LmigOR1 med biotin-märkta LmigOrco- prober eller DIG-märkta LmigOR2 med biotin-märkta LmigOR1- prober tillsammans i hybridiseringsbufferten.
- Värm spädningarna i 10 minuter vid 65 ° C och sätt dem på is under minst 5 minuter.
- hybridisering
- Töm skivorna och tillsätt 100 μL utspädda antisens- och sensprober (Steg 4.1) till vävnadssektionerna. Placera sedan täckglas (24 mm x 50 mm, nukleasfri) på vävnadssektionerna.
- Placera de täckta objektglasen horisontellt i en fuktig låda (~ 300 x 180 x 50 mm 3 ; Figur 2 ) och inkubera enT 55 ° C under 22 timmar. Lägg till formamidlösning eller 1X PBS i botten av lådan för att hålla miljön fuktig, men undvik inte nedsänkningarna i vätskan.
- Tvättning och blockering.
- Efter hybridisering, ta bort täckglasen noggrant. Tvätta bilderna två gånger i 30 minuter i 0,1x saltlösning natriumcitrat (SSC) vid 60 ° C.
ANMÄRKNING: Tvättmedel innebär att glidbanorna sätts i en glidhållare som sedan placeras i en plastbehållare och omröres försiktigt på en vippanordning (~ 50 rpm, Figur 2 ). - Skölj glidorna i 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) i 30 s.
- Tillsätt 1 ml 1% blockeringsreagens i TBS kompletterat med 0,03% Triton X-100 på varje bild och inkubera i 30 min. Kassera sedan blockeringslösningen.
- Efter hybridisering, ta bort täckglasen noggrant. Tvätta bilderna två gånger i 30 minuter i 0,1x saltlösning natriumcitrat (SSC) vid 60 ° C.
- Immunohistokemi.
- För kromogen detektion, använd blockeringsreagens i TBS för att späda 750 enheter (U) / ml anti-digoxigenin AP-konjugerad antiboDy till 1,5 U / ml AP-lösning. Tillsätt 100 μl AP-lösning per täckt (24 mm x 50 mm) glid.
- För TSA-detektering, använd blockeringsreagens i TBS för att späda 750 U / ml anti-digoxigenin AP-konjugerad antikropp och anti-biotin streptavidin HRP-konjugerad antikropp mot AP / HRP-lösningen. Tillsätt 100 μL AP / HRP-lösning per täckt (24 mm x 50 mm) glid.
- Inkubera bilderna i en fuktig låda ( Figur 2 ) i 60 minuter vid 37 ° C. Använd formamidlösningen eller 1X PBS för att hålla lådan fuktig men inte fuktig.
5. Färgning
- Ta bort täckglasen noggrant. Tvätta bilderna tre gånger i 5 minuter i 1x TBS kompletterad med 0,05% Tween-20. Skölj glidorna i DAP-buffert (kromogen detektion: pH 9,5; TSA-detektion: pH 8,0) i 5 min.
- Färgning (kromogen detektion)
- Tillsätt 100 μL NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) substratlösning (utspädd i DAP;PH 9,5) till varje bild. Lägg försiktigt täckglas (24 x 50 mm) på glidbanorna.
- Inkubera bilderna i en fuktig låda med substratlösning under 10 minuter - O / N vid 37 ° C.
OBS! Kontrollera utvecklingen genom att titta på bilderna ibland från mikroskopet. - När utvecklingen är klar, stoppa reaktionen genom att överföra glidbanorna i vatten.
- Färgning (TSA-detektering)
- Använd en spruta för att flytta substratet HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) från sprutfiltret (0,22 μm; Figur 2 ).
- Tillsätt 100 μL HNPP / Fast Rött substrat per glida täckt med täckglas (24 x 50 mm). Inkubera bilderna i 30 minuter med HNPP / Fast Red substrat vid RT.
- Ta bort skyddsglasögonen noggrant och tvätta skyddsglaset tre gånger i 5 minuter i 1X TBS kompletterat med 0,05% Tween-20.
- Använd 100 μl TSA substrat / täckt (24 x 50 mm 2 ) glidning. Inkubera glidorna med TSA-substratet under 10 minuter vid RT.
- Ta bort täckglasen noggrant och tvätta bilderna tre gånger i 5 minuter i 1x TBS kompletterad med 0,05% Tween-20.
- Bädda in bilderna i PBS / glycerol (1: 3).
OBS! När du har slutfört dessa procedurer bör bilderna observeras så snart som möjligt eftersom fluoresceringssignalen kommer att släcka snabbt.
6. Observation
- Kromogen detektion
- Observera vävnadssektioner med hjälp av ett optiskt mikroskop. Välj objektiverna 10X, 20X och 40X för att observera resultaten av kromogen detektion.
- Använd DP-BSW-programvaran för att analysera resultaten och ta bilderna.
- TSA-detektering
- Observera vävnadssnitt med hjälp av ett konfokalt mikroskop. DIG-märkta gener bör observeras under 543 nm ljus, som presenterar en röd färg och biotinmärkta gener bör varaObserverades under 488 nm ljus och presenterade en grön färg. När de dyker upp presenterar de gul färg.
- Välj 20X och 40X objektivlinserna för att observera resultaten av TSA-detektering.
- Använd FV1000-programvaran för att analysera resultaten och ta bilderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med kromogen detektion betecknades en liten delmängd av antennalcellerna i varje vuxenantennsektion av de DIG-märkta LmigORl- och LmigOR2- antisensproberna ( Figur 3 ). RNA ISH på konsekutiva sektioner för att lokalisera LmigORl och LmigOR2 visade att antennalceller som uttrycker de två generna befann sig i ORN-kluster som uttrycker LmigORco , vilket indikerar att det förmodade LmigORl och LmigOR2 faktiskt uttrycktes i ORNs ( Figur 4a -4d ). Ibland visualiserades märkta dendritiska strukturer ( Figur 4e -4f ). LmigOR1 och LmigOR2 var båda lokaliserade till neuroner i den basiska sensillan ( Figur 5a-5b ), men de var inte sam-uttryckta i individuell sensilla, vilket indikerar att de var närvarande i olika basiska Nic Sensillium-subtyper ( Figur 5c- 5d ).
Vid TSA-detektion visade tvåfärgade fluorescerande in situ- hybridisering att LmigOR1- uttryckande celler (röd färg) var belägna i ORN-kluster som uttryckte LmigORco (grön färg), vilket indikerar att den förmodade LmigORl uttrycks i ORNs ( Figur 6a ). En närmare vy av de boxade områdena i figur 6a visas i figur 6b . LmigOR1 - uttryckande neuroner (grön färg, Figur 7a ) och LmigOR2- uttryckande neuron (röd färg, Figur 7b ) var placerade till olika basiska sensillium-subtyper ( Figur 7c ).
4 / 55924fig1.jpg "/>
Figur 1: Framställning av insektantennsektioner för RNA i situ- hybridisering. ( A ) Den frysande mikrotomen; ( Bc ) Proverna är inbäddade i frysande OCT-förening. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Experimentella föremål för RNA i situ- hybridisering . ( A ) Glidhållaren och plastbehållaren. ( B ) Den fuktiga rutan. ( C ) vippan. ( D ) Membranfiltret. ( E ) konfokalmikroskop. .jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellulär lokalisering av LmigOR1 och LmigOR2 i olfaktoriska organ. (A) Översikt över LmigOR1 uttryckande celler i en gräshoppa antennal segment. ( B ) Översikt av LmigOR2- uttryckande celler i ett johannesbrödsantennsegment. Arrowheads anger celler som uttrycker LmigOR1 ( a ) och LmigOR2 ( b ). Skalstänger = 100 μm (a och b). Figurerna anpassades från Xu et al. 12 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Neuronal identitet av antennceller som uttrycker LmigORs genom kromogena detektioner. ( Ab ) Märkningsmönstret av LmigOR1 ( a ) och LmigORco ( b ) antisensond på på varandra följande sektioner av johannesantantenn. ( Cd ) Märkningsmönstret för LmigORco ( c ) och LmigOR2 ( d ) antisensondonden på på varandra följande sektioner av johannesantantenn. ( Ef ) Illustration av ibland märkta dendritiska strukturer (angivna med röda pilar). Skalstänger = 50 μm (ad); 20 μm (e och f). Figurerna anpassades från Xu et al. 12 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 5: LmigOR1 & LmigOR2 uttrycks i ORNs Inrymda i Basiconic Sensilla. ( Ab ) Basiconiska sensillumhus-ORN som uttrycker LmigORl ( a ) och LmigOR2 ( b ). ( Cd ) Uttrycket av LmigOR1 och LmigOR2 i distinkt delmängd av antennala ORNs verifierades i på varandra följande sektioner (cd). Arrowheads betecknar antennalceller som uttrycker LmigOR1 (a, c) och LmigOR2 (b, d). Ba: basiconic sensillum. Skalstänger = 20 μm (a och b); 50 | im (c och d). Figurerna anpassades från Xu et al. 12 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Neuronal identitet av antenncellsuttryck LmigOR1 genom TSA-detektioner. ( A ) Tvåfärgad in situ hybridisering utfördes på längsgående antennsektion för att illustrera uttrycket av LmigORl (Röd) och LmigORco (Grön). Lokalisering av LmigORl- uttryckande celler i cellklyftor som uttrycker LmigORco bekräftade sin neurala identitet. ( B ) Nära syn på boxade områden i a. Ibland märkta dendritiska liknande strukturer indikerades med pilen. Cirklade områden indikerar ORNs cluster expressing LmigORco och delar samma sensillum. Skalstänger = 50 μm (a); 20 | im (b). Figurerna anpassades från Xu et al. 12 Snälla CSlick här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: LmigORl & LmigOR2 var belägna till olika Basiconic Sensilla ORNs genom TSA-detektion. Fluorescerande signaler visualiserades med användning av detekteringssystem, vilket indikerar LmigORl- märkta neuroner med gröna fluorescens ( a ) och LmigOR2- positiva celler med röd fluorescens ( b ) uttrycktes i olika basiska sensoriska subtyper ( c ). Arrowheads betecknar antennalceller som uttrycker LmigORl och LmigOR2 . Skalstänger = 20 μm. Figurerna anpassades från Xu et al. 12 Vänligen klicka här för att se enStörre version av denna figur.
| namn | sekvenser |
| Lmig OR1-sond-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1-prob-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2-sond-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-prob-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
Tabell 1: Sekvenserna av PCR-primererna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är svårt att utföra RNA ISH för att lokalisera OR-gener i insektsantenner eftersom uttrycksnivåerna av OR-gener, förutom ORco , är mycket låga och att bevara histologiska skivor av insektsantenner är mycket svårt. Dessutom är TSA-detektering också mycket knepigt. För att lösa dessa problem bör följande åtgärder vidtas. Antennerna är utvalda från nyssmältande vuxna johannesbröd som har tunna och mjuka antennhalsband som håller sin morfologi på glidbanan. De frysta proven snittas i 12 μm tjocka skivor. Mycket känsliga och specifika biotin- och DIG-märkta prober används. Rengöringsmedel, såsom Tween-20 och Triton X-100, används för att minska bakgrunden i många steg. Vid TSA-detektion bör en starkt uttryckt gen, i förhållande till en annan lågt uttryckt gen, märkas med biotin-16-UTP. Skivorna bör observeras så snart som möjligt eftersom de fluorescerande signalerna släcker snabbt.
DIG-aNd biotin-märkta prober har fördelarna med längre hållbarhet, högre signal-brusförhållanden och bättre cellulära upplösningar än radioaktiva prober 18 , 19 . Protokollet som presenteras i detta papper har vissa fördelar över helmontering in situ hybridisering. Detta protokoll identifierar lätt lokaliseringen av gener på mobilnivån men kan inte lätt användas för att undersöka genfördelningsmönster, vilket lättare utförs med helmontering in situ- hybridisering.
För att identifiera en OR-gen togs två tillvägagångssätt. En var den kromogena detektering i konsekutiva sektioner, och den andra var fluorescerande detektion i en sektion. ORco uttrycks med en specifik OR som en ORN-markör 10 , 20 , 21 . Celler som uttrycker LmigORl eller LmigOR2 var båda placeradeTill kluster av LmigORco- uttryckande celler som entydigt verifierade dem som ORs ( Figur 4 och Figur 6 ). Med samma tillvägagångssätt fann vi att LmigOR1 och LmigOR2 inte uttrycks i en sensillum. Resultaten av dessa två tillvägagångssätt är bekräftande.
Detta protokoll användes också framgångsrikt för att lokalisera LmigORco, SgreORco, SgreIR8a och SgreIR25a i johannesantantenner 10 , 14 . Nyligen var LmigOR3 lokaliserad till trichoid sensilluroner i L. migratoria med samma protokoll 15 . Detta protokoll användes för att lokalisera två sensoriska neurala membranproteiner SgreSNMP1 och SgreSNMP2 i antennerna av S. gregaria 16 . Sålunda lokaliserades detta protokoll på pålitligt lokaliserade kemosensorrelaterade gener i johannesantantenner som inte bara verifierade dessaKandidatgener, men lokaliserade även dessa gener till specifika celler inrymda i olika typer av sensilla.
Sammanfattningsvis beskrivs detta högeffektiva protokoll av RNA ISH specifikt för att lokalisera OR-gener, såväl som andra gener uttryckta vid låga nivåer, i insektsantenner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Nämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna artikel är enbart för att ge specifik information och innebär inte rekommendation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
