Summary
Dette papiret beskriver en detaljert og svært effektiv RNA in situ hybridiseringsprotokoll, spesielt for lavnivå uttrykt luktemiddelreceptor (OR) -gener, så vel som andre gener, i insektantenner ved bruk av digoxigenin (DIG) -mærkede eller biotin-merkede prober.
Abstract
Insekter har utviklet sofistikerte olfaktoriske mottakssystemer for å fornemme eksogene kjemiske signaler. Disse kjemiske signalene blir transdusert av Olfactory Receptor Neurons (ORNs) plassert i hårlignende strukturer, kalt chemosensilla, fra antennene. På ORN-membranene antas det at odorantreceptorer (OR) er involvert i luktkoding. Det er derfor nødvendig å identifisere gener som er lokalisert til ORNene, for å gjenkjenne OR-gener, og gir et grunnleggende grunnlag for videre funksjonelle in situ- studier. RNA-ekspressionsnivåene for spesifikke OR s i insektantenner er svært lave, og bevaring av insektvev for histologi er utfordrende. Det er således vanskelig å lokalisere en OR til en bestemt type sensilla ved bruk av RNA in situ- hybridisering. I dette papiret blir en detaljert og svært effektiv RNA in situ- hybridiseringsprotokoll spesielt for lavt uttrykte OR-gener av insekter innført. I tillegg er en bestemt OR Gen waS identifisert ved å utføre to-farges fluorescerende in situ- hybridiseringseksperimenter ved bruk av et co-uttrykkende reseptorgen, Orco , som en markør.
Introduction
Insektantenner, som er de viktigste kjemosensoriske organene, er dekket av mange hårlignende strukturer - kalt sensilla - som er innervert av Olfactory Receptor Neurons (ORNs). På membranet av insekt-ORN, uttrykkes luktemiddelreceptorer (ORs), en type protein som inneholder syv transmembrane domener, med en coreceptor (ORco) for å danne en heteromer som fungerer som en luktende gated ion-kanal 1 , 2 , 3 . Ulike ORs reagerer på forskjellige kombinasjoner av kjemiske forbindelser 4 , 5 , 6 .
Gresshopper ( Locusta migratoria ) stole hovedsakelig på olfaktoriske tegn for å utløse viktige oppføringer 7 . Locust ORs er nøkkelfaktorer for forståelse av molekylære olfaktoriske mekanismer. Lokalisering av et spesifikt locust OR-gen til nevronen av aMorfologisk spesifikk sensillum type ved RNA In situ Hybridization (RNA ISH) er det første trinnet i å utforske ORs-funksjonen.
RNA ISH bruker en merket komplementær RNA-probe for å måle og lokalisere en spesifikk RNA-sekvens i seksjon av vev, celler eller hele fester på stedet , som gir innsikt i fysiologiske prosesser og sykdomspatogenese. Digoksigenin-merkede (DIG-merkede) og biotin-merkede RNA-prober har blitt mye brukt i RNA-hybridisering. RNA-merking med digoxigenin-11-UTP eller biotin-16-UTP kan fremstilles ved in vitro transkripsjon med SP6- og T7-RNA-polymeraser. DIG- og biotin-merkede RNA-prober har følgende fordeler: ikke-radioaktive; sikker; stabil; Svært følsom; Svært spesifikk; Og lett å produsere ved hjelp av PCR og in vitro transkripsjon. DIG- og biotin-merkede RNA-prober kan være kromogenisk og påvises fluorescens. DIG-merkede RNA-prober kan påvises med anti-digoksigenin-alkaliNe-fosfatase (AP) -konjugerte antistoffer som kan visualiseres enten med de meget følsomme kjemiluminescerende substratene nitroblue tetrazoliumklorid / 5-brom-4-klor-3-indolylfosfattoluinsalt (NBT / BCIP) ved bruk av et optisk mikroskop eller med 2 -hydroksy-3-naftosyre-2'-fenylanilidfosfat (HNPP) koplet med 4-klor-2-metylbenzenedioniumhemi-zinkkloridsalt (Fast Red) ved bruk av et konfokalt mikroskop. Biotin-merkede RNA-prober kan påvises med anti-biotin streptavidin Hest Radish Peroxidase (HRP) -konjugerte antistoffer som kan visualiseres med fluorescein-tyramider ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Dermed kan to-farges fluorescerende in situ- hybridisering utføres for å oppdage to målgener i ett skive ved bruk av DIG- og biotin-merkede RNA-prober.
RNA ISH med DIG- og / eller biotin-merkede prober har blitt brukt til å lokalisere olfaktorrelaterte gener, som for eksempel OR , ionotrop reseptor, luktende bindende proteinOg sensorisk nevronmembranprotein, i insektantenner av, men ikke begrenset til, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria og ørkensprutstenen Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Imidlertid er det to betydelige utfordringer når man utfører RNA ISH for insekt-OR: (1) ELLER (unntatt ORco ) uttrykkes i lave nivåer og bare i noen få celler, noe som gjør signaldeteksjon svært vanskelig, og (2) bevare insektvev for Histologi, slik at morfologien blir bevart og bakgrunnsstøyen er lav, kan være utfordrende. I dette papiret er en detaljert og effektiv protokoll som beskriver RNA ISH for lokalisering av OR-gener i insektAntenner presenteres, inkludert både kromogen og tyramid signalforsterkning (TSA) deteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: For å begrense RNA-nedbrytning, lag oppløsninger ved hjelp av vått autoklavert destillert vann (ved 121 ° C i 60 minutter) og også våt-autoklavmaterialer.
1. Fremstilling av RNA ISH Antisense og Sense Probes
- Målgenforsterkning og rensing
- Først produserer du et 387 bp dobbeltstrenget fragment av L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) fra plasmidet som inneholder full lengde-cDNA av LmigOR1 med en Taq DNA-polymerase som tilsetter adeniner til begge ender av fragmentene.
- Bruk en 100 ul endelig reaksjonsvolum inneholdende 50 ul av 2x reaksjonsblandingen, 4 ul hver av sense og antisense-primere (tabell 1), 1 pl av plasmid templat, og 41 ul RNase-fritt H2O Bruk følgende PCR Protokoll: 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min, Etterfulgt av 72 ° C i 10 minutter.
- Gjenta disse trinnene for å produsere det 1.303 bp dobbeltstrengede fragmentet av LmigOR2 (GenBank: JQ766966) og 1,251 bp dobbeltstrenget fragment av LmigORco (GenBank: JN989549). Primrene som brukes i disse forsøkene er presentert i tabell 1 .
- Kjør PCR-produkter på 1,2% agarosegeler i 1x Tris-acetat-EDTA-buffer og visualiser ved bruk av etidiumbromidfarging.
- Trekk ut disse PCR-produktene ved hjelp av et gelekstraksjonssett.
- Etter elektroforese bøyes punksjons DNA fra gelen og plasserer gelskivene i et 1,5 ml rør. Deretter tilsettes 100 μl bindingsbuffer (Buffer PN) per 0,1 g gelskive. Vortex og inkuber ved 50 ° C til gelskiven er fullstendig oppløst.
- Sett inn en CA2-adsorpsjonskolonne i oppsamlingsrøret og tilsett 500 μl balansebuffer (buffer BL). Dette forbedrer absorpsjonsevnen og stabiliteten til silikamembranen. CentriFuge ved 12.400 xg i 1 min.
- Overfør den oppløste gelblandingen til adsorpsjonssammensetningen og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter. Deretter centrifuger rør ved 12.400 xg i 1 min. Kast bort gjennomstrømningen og sett inn adsorpsjonskolonnen i oppsamlingsrøret.
- Tilsett 600 μl vaskeoppløsning (etanol tilsatt, buffer PW) to ganger. Sentrifuger ved 12 400 xg i 1 min. Kast bort gjennomstrømning og sett inn adsorpsjonskolonnen i oppsamlingsrøret.
- Tøm oppsamlingsrøret og gjenta kolonnekonstruksjonen ved 12.400 xg i 2 minutter for å tillate fordampning av eventuell resterende etanol.
- Forsiktig overfør adsorpsjonskolonnen til et rent 1,5 ml sentrifugerør. Lufttør pelleten i 5-10 minutter og gjenoppløs DNAet i et passende volum ( f.eks. 30 μL) nukleasefritt vann.
- Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter. Sentrifuger ved 12 400 xg i 2 min. Kast adsorpsjonskolonnen og lagre DNA ved 4 ° C eller -20 ° C.
- Først produserer du et 387 bp dobbeltstrenget fragment av L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) fra plasmidet som inneholder full lengde-cDNA av LmigOR1 med en Taq DNA-polymerase som tilsetter adeniner til begge ender av fragmentene.
- Konstruer de rekombinante plasmidene
- Individuelt ligere 387 bp fragmentet av LmigOR1 , 1,303 bp fragment av LmigOR2 og 1,251 bp fragment av LmigORco i en T-vektor som inneholder promotorer for T7 (oppstrøms) og SP6 (nedstrøms) RNA-polymeraser ved siden av det innsatte DNA ved bruk av T4 DNA ligase. Forbered følgende 10 μl reaksjon: 5 μl 2x ligeringsbuffer, 1 μl T vektor, 3 μL (~ 100 ng) av det innsatte genets DNA og 1 μl T4 DNA ligase og inkuber O / N ved 4 ° C.
- Tilsett 5 μl av hvert rekombinant plasmid som inneholder 387 bp fragmentet av LmigOR1 , 1,303 bp fragment av LmigOR2 og 1,251 bp fragment av LmigORco separat i 50 μl kompetente Escherichia coli DH5a-celler i sterile 1,5 ml rør.
- Bland forsiktig og sett rørene i is i 30 minutter og inkuber dem deretter i 90 s på 42° C. Overfør dem tilbake i is i 3 minutter.
- Tilsett 450 μL Liuria-Bertani (LB) flytende medium uten ampicillin til hvert rør og inkuber dem i en rister ved 150 rpm i 1 time ved 37 ° C for å gjenopprette E. coli DH5a.
- Ta en 100 μl alikvot av hver transformant og bruk dem til å inokulere LB faste substratplater inneholdende 50 μg / ml ampicillin, 24 μg / ml isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) og 40 μg / ml 5-brom-4 -klor-3-indolyl-P-D-galaktopyranosid (X-gal).
- Inkubér disse platene i en konstant inkubator ved 37 ° C i 18 timer. Skjerm de målrekombinante plasmidene ved bruk av den blå-hvite screeningsmetoden. Sequence de målrekombinante plasmidene ved å bruke Sanger-sekvensering og identifisere de tre OR-genernes innsatsretninger.
- Velg restriksjonsendonukleaser for å linearisere rekombinante plasmider
- Bruk restriksjonsendonukleaser tHatten spres ikke bare i vektorens flere kloningsete, men kutter heller ikke innsatsen DNA. I dette forsøket settes alle 3 genene inn i T-vektoren i retning tilsvarende den for vektoren.
- Bruk Nco I restriksjonsendonuklease til å linearisere de rekombinante plasmidene som inneholder 387 bp fragmentet av LmigOR1 , 1,303 bp fragment av LmigOR2 og 1,251 bp fragment av LmigORco for å produsere antisensprober. Bruk Sp e I restriksjonsendonuklease for å produsere sansprober.
MERK: Hvis innsatsretningen tilsvarer vektorenes vekt, velges et unikt restriksjonssted fra slutten av T7 for å linearisere det rekombinante plasmidet og SP6-RNA-polymerase brukes til å fremstille antisense-proben. Et unikt restriksjonssted fra slutten av SP6 er valgt for å linearisere det rekombinante plasmidet, og T7-RNA-polymerasen brukes til å fremstille følelsesproben. Ellers, hvis innsatsretningen ikke samsvarer med tHan vektors retning, så blir et unikt restriksjonssted fra slutten av SP6 valgt for å linearisere det rekombinante plasmidet og T7 RNA-polymerase brukes til å fremstille antisense-proben. Det unike restriksjonsstedet fra enden av T7 er valgt for å linearisere det rekombinante plasmidet, og SP6-RNA-polymerasen brukes til å fremstille følelsesproben.
- Rensing av de lineære rekombinante plasmidene
- Fordel 20 μg hvert av de tre rekombinante plasmidene som inneholder 387 bp fragmentet av LmigOR1 , 1,303 bp fragment av LmigOR2 og 1,251 bp fragment av LmigORco ved bruk av Nco I-restriksjonsendonukleasen i en 100 pi reaksjon som inneholder 10 pi 10 x buffer, 40 pi 0,5 ug / ul plasmid, 3 ul av Nco i og 47 ul RNase-fritt H2O, etterfulgt av en 3 timers inkubasjon ved 37 ° C.
- Tilsvarende fordøyer 20 μg av hvert av disse tre rekombinante plasmidene uSynge Spe I-restriksjonsendonukleasen.
- Rens disse fordøyede plasmidene ved å bruke et gelekstraksjonssett som beskrevet i 1.1.2. Bestem konsentrasjonene av disse ekstraherte lineariserte rekombinante plasmider ved spektrofotometri og juster til 0,5 μg / μl.
- Forbered antisense og følelsesprober
- Bruk T7 / SP6 RNA transkripsjonssystemet til å generere antisense og sense probes. SP6 RNA-polymerase brukes til å transkribe dobbeltstrenget RNA for DIG- og biotin-merkede antisensprober for disse tre OR-gener ved å benytte lineære rekombinante plasmider som maler in vitro . T7-RNA-polymerasen brukes til å produsere sansprober. Utfør reaksjonen i et 20 μl sluttvolum inneholdende 2 μl 10x NTP-blanding, 2 μl 10X transkripsjonsbuffer, 1 μl RNase-inhibitor, 2 μl T7 eller SP6 RNA-polymerase, 4 μl 0,5 μg / μl linearisert plasmid og 9 ul RNase-fritt H2O, etterfulgtVed en 3 timers inkubering ved 37 ° C.
- Inkubér DIG- og biotin-merkede antisense- og senseprober i 30 minutter med 1 μl DNase ved 37 ° C. Tilsett 2,5 μL 5 M LiCl og 75 μl absolutt etanol, og inkuber deretter reaksjonene i 30 minutter ved -70 ° C.
- Sentrifuger ved 15 000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten forsiktig. Tilsett 150 μL 70% etanol for å vaske utfellingen. Tilbered 70% etanol (1 L) ved å tilsette 95% etanol (736,8 ml) til sterilt destillert vann (263,2 ml).
- Sentrifuger ved 15 000 xg i 30 minutter ved 4 ° C igjen og lufttørk pelleten i 5-10 minutter ved romtemperatur. Tilsett 25 ul RNase-fritt H2O for å oppløse RNA antisense og sense prober.
- Hvis lengden på det innsatte genet er lengre enn 1 kb, etterfølger deretter fragment RNA antisense og sans til en gjennomsnittlig lengde på ~ 300 bp ved inkubering i en bikarbonat-karbonatbufferløsninger. Utfør reaksjonen i et 50 μl sluttvolum, containing 25 ul RNA-probe og 25 pl av det bikarbonat-karbonat-bufferoppløsning (80 mM NaHCO 3, 120 mM Na2 CO3, pH 10,2) ved 60 ° C. Den nødvendige hydrolysetid er gitt ved en tidligere publisert formel 17 .
- Tilsett 5 μl 10% eddiksyre for å stoppe reaksjonen. I dette eksperimentet fragmenter LmigOR2- og LmigORco- antisense- og sansprober i henholdsvis 24 og 23 minutter.
T = (L o- L f ) / kXL o XL f
L o = de opprinnelige fragmentlengder i kb
Lf = de endelige fragmentlengder i kb
K = hastighetskonstanten for hydrolyse, ca. 0,11 kb -1 min -1
T = hydrolysetiden i min - Til slutt tilsett 250 μl hybridiseringsbuffer og lagre ved -80 ° C.
2. Fremstilling av kryostatseksjoner
- Forkledning freeziNg mikrotome til -24 ° C.
- Velg nye moltende voksenhoppe som er aktive og har intakte antenner. Klipp antennene i 2-3 mm stykker med sterile barbermaskiner.
- Sett OCT-sammensetningen på en frysende mikrotomeholder og sett ett eller to prøver på forbindelsen horisontalt. Deretter overfør holderen til frysepikrotomet ved -24 ° C for å balansere til forbindelsen fryser. Ta ut holderen og dekk prøvene med en liten forbindelse. Overfør holderen i frysende mikrotom ved -24 ° C igjen i minst 10 minutter ( figur 1 ).
MERK: Unngå å få bobler i forbindelsen. - Fest holderen med prøvene i frysepikrotomet, og del deretter de frosne prøvene i 12 μm tykke skiver ved -24 ° C.
- Tin opp skivene en etter en på lysbilder (25 x 75 mm, nukleasefri) og lufttørke i 10 min.
3. Festende seksjoner
- Etter å ha forberedt kryostatSeksjoner, legg lysbildene i en plastbeholder (~ 100 x 40 x 80 mm), og fest vevene ved å inkuberer lysbildene i 4% paraformaldehydoppløsning (PFA) i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask lysbildene i 1 x fosfatbuffert saltvann (PBS) i 1 min.
- For å eliminere alkaliske proteiner, overfør glidene til 0,2 M HC1 i 10 minutter.
- For å eliminere overflateproteinet av nukleinsyre, overfør glidene til 1XPBS med 1% Triton X-100 i 2 minutter.
- Vask lysbildene to ganger i 30 s i 1x PBS.
- Til slutt skyll lysbildene i formamidoppløsning i 10 minutter ved 4 ° C.
4. Hybridisering
- Klargjør antisense og følelsesprober
- Bruk hybridiseringsbuffer til fortynnede RNA antisense eller sansprober i de 1,5 ml nukleasefrie rørene. I dette forsøket, for alle antisense og sense probes ( LmigOR1, LmigOR2 og LmigOrco ), tilsett 1 μL sonde til 99 μmL hybridiseringsbuffer per lysbilde. Generelt gir bruk av 1: 100 fortynninger av antisensprober signifikante positive signaler og lave bakgrunner ved bruk av denne protokollen.
- For kromogen deteksjon, fortynne DIG-merkede prober enkeltvis.
- For TSA-deteksjon, fortynn DIG-merket LmigOR1 med biotin-merkede LmigOrco- prober eller DIG-merket LmigOR2 med biotin-merkede LmigOR1- prober sammen i hybridiseringsbufferen.
- Varm fortynningene i 10 minutter ved 65 ° C og sett dem på is i minst 5 minutter.
- hybridisering
- Tørr lysbildene og legg til 100 μl fortynnede antisense- og sansprober (trinn 4.1) til vevseksjonene. Deretter plasser dekselplater (24 mm x 50 mm, nukleasefri) på vevseksjonene.
- Legg de dekkede lysbildene horisontalt i en fuktig boks (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , figur 2 ) og inkuber enT 55 ° C i 22 timer. Legg formamidoppløsning eller 1X PBS i bunnen av esken for å holde miljøet fuktig, men ikke dyp glidene i væsken.
- Vasking og blokkering.
- Etter hybridisering, fjern dekselklipsene nøye. Vask objektglassene to ganger i 30 minutter i 0,1x saltvannsnatriumsitrat (SSC) ved 60 ° C.
MERK: Vasking betyr å sette lysbildene i en glidebryter som deretter plasseres i en plastbeholder og omrøres forsiktig på en vipp (~ 50 rpm, figur 2 ). - Skyll lysbildene i 1x Tris-Buffered Saline (TBS) i 30 s.
- Tilsett 1 ml 1% blokkeringsreagens i TBS tilsatt 0,03% Triton X-100 på hvert lysbilde, og inkuber i 30 minutter. Deretter kasserer blokkeringsløsningen.
- Etter hybridisering, fjern dekselklipsene nøye. Vask objektglassene to ganger i 30 minutter i 0,1x saltvannsnatriumsitrat (SSC) ved 60 ° C.
- Immunhistokjemi.
- For kromogen gjenkjenning, bruk blokkeringsreagens i TBS for å fortynne 750 enheter (U) / ml anti-digoksigenin AP-konjugert antiboDy til 1,5 U / ml AP-løsning. Tilsett 100 μL AP-løsning per dekket (24 mm x 50 mm) lysbilde.
- For TSA-deteksjon, bruk blokkeringsreagens i TBS for å fortynne 750 U / ml anti-digoxigenin AP-konjugert antistoff og anti-biotin streptavidin HRP-konjugert antistoff til AP / HRP-løsningen. Tilsett 100 μL AP / HRP-løsning per dekket (24 mm x 50 mm) lysbilde.
- Inkubér lysbildene i en fuktig boks ( figur 2 ) i 60 minutter ved 37 ° C. Bruk formamidløsningen eller 1X PBS for å holde boksen fuktig, men ikke soggig.
5. Farging
- Fjern dekslene forsiktig. Vask lysbildene tre ganger i 5 minutter i 1x TBS suppleret med 0,05% Tween-20. Skyll lysbildene i DAP-buffer (kromogen deteksjon: pH 9,5; TSA-deteksjon: pH 8,0) i 5 min.
- Staining (kromogen deteksjon)
- Tilsett 100 μL NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) substratløsning (fortynnet i DAP;PH 9,5) til hvert lysbilde. Legg forsiktig glidelåser (24 x 50 mm) på lysbildene.
- Inkubér lysbildene i en fuktig boks med substratløsning i 10 minutter - O / N ved 37 ° C.
MERK: Kontroller utviklingen ved å se på lysbildene fra tid til annen under mikroskopet. - Når utviklingen er klar, stopp reaksjonen ved å overføre lysbildene i vann.
- Farging (TSA-deteksjon)
- Bruk en sprøyte til å flytte HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / ml) substrat fra sprøytefilteret (0,22 μm; Figur 2 ).
- Tilsett 100 μL HNPP / Fast Rødt substrat per lysbilde dekket med et deksel (24 x 50 mm). Inkubér lysbildene i 30 minutter med HNPP / Fast Red substrat ved RT.
- Fjern dekslene forsiktig, og vask glidene tre ganger i 5 minutter i 1X TBS suppleret med 0,05% Tween-20.
- Bruk 100 μL TSA substrat / dekket (24 x 50 mm 2 ) glide. Inkubér lysbildene med TSA-substrat i 10 minutter ved RT.
- Fjern dekslene forsiktig, og vask glidene tre ganger i 5 minutter i 1x TBS suppleret med 0,05% Tween-20.
- Legg inn lysbildene i PBS / glycerol (1: 3).
MERK: Etter å ha fullført disse prosedyrene, bør lysbildene observeres så snart som mulig fordi det fluorescerende signalet vil slukke raskt.
6. Observasjon
- Kromogen deteksjon
- Vær oppmerksom på vevseksjoner ved hjelp av et optisk mikroskop. Velg objektivene 10X, 20X og 40X for å observere resultatene av kromogen deteksjon.
- Bruk DP-BSW programvare til å analysere resultatene og ta bilder.
- TSA-deteksjon
- Vær oppmerksom på vevseksjoner ved hjelp av et konfokalt mikroskop. DIG-merkede gener bør observeres under 543 nm lys, presentere en rød farge, og biotin-merkede gener skal væreObservert under 488 nm lys, og presenterer en grønn farge. Når de kommer fram, presenterer de gul farge.
- Velg objektivene 20X og 40X for å observere resultatene av TSA-deteksjonen, henholdsvis.
- Bruk FV1000-programvaren til å analysere resultatene og fange bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved kromogen gjenkjenning ble en liten delmengde av antennalcellerne i hver voksenantennseksjon betegnet av de DIG-merkede LmigOR1- og LmigOR2- antisensprober ( Figur 3 ). RNA ISH på påfølgende seksjoner for å lokalisere LmigOR1 og LmigOR2 viste at antennalceller som uttrykker de to gene, befant seg i ORN-klynger som uttrykker LmigORco , hvilket indikerer at den formodede LmigOR1 og LmigOR2 faktisk ble uttrykt i ORNs ( Figur 4a -4d ). Av og til ble merket dendritisk-lignende strukturer visualisert ( Figur 4e -4f ). LmigOR1 og LmigOR2 var begge lokalisert til nevroner i den basiske sensillaen ( Figur 5a-5b ), men de ble ikke uttrykt i individuell sensilla, noe som indikerte at de var til stede i forskjellige basico Nic sensillium subtyper ( figur 5c-5 d ).
I TSA-deteksjon viste tofarget fluorescerende in situ- hybridisering at LmigOR1- ekspresserende celler (rød farge) var lokalisert i ORN-klynger som uttrykker LmigORco (grønn farge), hvilket indikerer at den formodede LmigOR1 ble uttrykt i ORN ( figur 6a ). En nærbilde av de boksede områdene i figur 6a er vist i figur 6b . LmigOR1 - uttrykke nevroner (grønn farge, figur 7a ) og LmigOR2- ekspressende nevron (rød farge, figur 7b ) ble lokalisert til forskjellige basiske sensillium subtyper ( Figur 7c ).
4 / 55924fig1.jpg "/>
Figur 1: Fremstilling av insektantennseksjoner for RNA i situ- hybridisering. ( A ) frysende mikrotom; ( Bc ) Prøverne er innebygd i frysende OCT-forbindelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentelle gjenstander for RNA i situ- hybridisering . ( A ) Lysbildeholderen og plastbeholderen. ( B ) Den fuktige boksen. ( C ) vipperen. ( D ) membranfilteret. ( E ) konfokalmikroskop. .jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellulær lokalisering av LmigOR1 og LmigOR2 i olfaktoriske organer. ( A ) Oversikt over LmigOR1- ekspresserende celler i et johannesantantennalsegment. ( B ) Oversikt over LmigOR2- ekspresserende celler i et johannes antennalsegment. Pilespisser angir celler som uttrykker LmigOR1 ( a ) og LmigOR2 ( b ). Skalestenger = 100 μm (a og b). Tallene ble tilpasset fra Xu et al. 12 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Neuronal identitet av antennceller som uttrykker LmigORs ved kromogene deteksjoner. ( Ab ) Merkemønsteret for LmigOR1 ( a ) og LmigORco ( b ) antisense-sonde på påfølgende seksjoner av johannesantantenne. ( Cd ) Merkemønsteret for LmigORco ( c ) og LmigOR2 ( d ) antisense sonde på påfølgende deler av johannesbrannantennen. ( Ef ) Illustrasjon av sporadisk merkede dendritisk-lignende strukturer (angitt med røde piler). Skalestenger = 50 μm (ad); 20 μm (e og f). Tallene ble tilpasset fra Xu et al. 12 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 5: LmigOR1 og LmigOR2 er uttrykt i ORNer plassert i Basiconic Sensilla. ( Ab ) Basiconic sensillum-innebygde ORN som uttrykker LmigOR1 ( a ) og LmigOR2 ( b ). ( Cd ) Ekspresjonen av LmigOR1 og LmigOR2 i forskjellig delmengde av antennale ORNer ble verifisert på påfølgende seksjoner (cd). Arrowheads betegner antennalceller som uttrykker LmigOR1 (a, c) og LmigOR2 (b, d). Ba: basiconic sensillum. Skalestenger = 20 μm (a og b); 50 μm (c og d). Tallene ble tilpasset fra Xu et al. 12 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Neuronal identitet av antenncelletrykk LmigOR1 ved TSA-deteksjoner. ( A ) To-farge in situ- hybridisering ble utført på langsgående antennalseksjon for å illustrere ekspresjonen av LmigOR1 (Rød) og LmigORco (Grønn). Lokalisering av LmigOR1- ekspresserende celler i celleklynger som uttrykker LmigORco, bekreftet sin nevrale identitet. ( B ) Lukk utsikt over boksområder i a. Av og til merket dendritisk lignende strukturer ble indikert med pilen. Sirklede områder angir ORNs cluster expressing LmigORco og deler samme sensillum. Skalestenger = 50 μm (a); 20 μm (b). Tallene ble tilpasset fra Xu et al. 12 Vennligst cSlikk for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: LmigOR1 og LmigOR2 var lokalisert til forskjellige Basiconic Sensilla ORNer ved TSA-deteksjon. Fluorescerende signaler ble visualisert ved hjelp av deteksjonssystemer, som indikerer LmigOR1-merkede nevroner med grønne fluorescens ( a ) og LmigOR2- positive celler ved rød fluorescens ( b ) ble uttrykt i forskjellige basiske sensoriske subtyper ( c ). Arrowheads angir antennalceller som uttrykker LmigOR1 og LmigOR2 . Skalestenger = 20 μm. Tallene ble tilpasset fra Xu et al. 12 Vennligst klikk her for å se enStørre versjon av denne figuren.
| Navn | sekvenser |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
Tabell 1: Sekvensene til PCR-primrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vanskelig å utføre RNA ISH for å lokalisere OR-gener i insektantenner fordi uttrykksnivåene av OR-gener, med unntak av ORco , er svært lave og bevaring av histologiske skiver av insektantenner er svært vanskelig. I tillegg er TSA-deteksjon også veldig vanskelig. For å løse disse problemene bør følgende tiltak tas. Antennene er utvalgt fra nylig smeltende voksenhoppe som har tynne og myke antennalskiklinger, som opprettholder sin morfologi på lysbildet. De frosne prøvene er delt inn i 12 μm tykke skiver. Meget følsomme og spesifikke biotin- og DIG-merkede prober brukes. Vaskemidler, som Tween-20 og Triton X-100, brukes til å redusere bakgrunnen i mange trinn. Ved TSA-deteksjon bør et høyt uttrykt gen, i forhold til et annet lavt uttrykt gen, merkes med biotin-16-UTP. Lysbildene bør observeres så snart som mulig fordi de fluorescerende signalene vil slukke raskt.
DIG-aOg biotin-merkede prober har fordelene ved lengre holdbarhet, høyere signal til støyforhold og bedre cellulære oppløsninger enn radioaktive prober 18 , 19 . Protokollen som presenteres i dette dokumentet har noen fordeler over helmontering i situ hybridisering. Denne protokollen identifiserer lett lokaliseringen av gener på mobilnivå, men kan ikke lett brukes til å undersøke genfordelingsmønstre, noe som lettere utføres med helmontering in situ- hybridisering.
For å identifisere et OR-gen ble to tilnærminger tatt. Den ene var den kromogene deteksjon i sammenhengende seksjoner, og den andre var fluorescerende deteksjon i en seksjon. ORco er co-uttrykt med en spesifikk OR som en ORN markør 10 , 20 , 21 . Celler som uttrykker LmigOR1 eller LmigOR2 var begge lokalisertTil klynger av LmigORco- ekspresserende celler som entydig bekreftet dem som OR ( figur 4 og figur 6 ). Ved hjelp av de samme tilnærmingene fant vi at LmigOR1 og LmigOR2 ikke er uttrykt i en sensillum. Resultatene av disse to tilnærmingene er bekreftende.
Denne protokollen ble også vellykket brukt til å lokalisere LmigORco, SgreORco, SgreIR8a og SgreIR25a i johannesantantenner 10 , 14 . Nylig LmigOR3 var lokalisert til trichoid sensilla nevroner i L. migratoria ved bruk av samme protokoll 15 . Denne protokollen ble brukt til å lokalisere to sensoriske nevrale membranproteiner SgreSNMP1 og SgreSNMP2 i antennene til S. gregaria 16 . Dermed er denne protokollen pålitelig lokaliserte kjemosensorrelaterte gener i johannesantantenner, som ikke bare bekreftet disseKandidatgener, men lokaliserte også disse genene til spesifikke celler plassert i forskjellige typer sensilla.
Til slutt er denne svært effektive protokollen av RNA ISH spesifikt beskrevet for å lokalisere OR-gener, så vel som andre gener uttrykt i lave nivåer, i insektantenner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av et tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Omtale av handelsnavn eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
