Summary
Dit document beschrijft een gedetailleerd en zeer effectief RNA in situ hybridisatie protocol, in het bijzonder voor lage-uitgedrukte Geurstof Receptor (OR) genen, evenals andere genen, in insectenantennen met behulp van digoxigenine (DIG) gelabeld of biotine gelabelde probes.
Abstract
Insecten hebben ontwikkelde geavanceerde olfactieve ontvangstsystemen ontwikkeld om exogene chemische signalen te detecteren. Deze chemische signalen worden getransduceerd door Olfactory Receptor Neurons (ORNs), gehuisvest in haarachtige structuren, genaamd chemosensilla, van de antennes. Op de membranen van de ORN's worden geurstofreceptoren (OR's) geacht betrokken te zijn bij geurcodering. Zo kunnen genen die gelokaliseerd zijn aan de ORN's identificeren, noodzakelijk zijn om OR genen te herkennen en een fundamentele basis voor verdere functionele in situ studies. De RNA-expressieniveaus van specifieke OR 's in insectenantennen zijn zeer laag, en het behoud van insectenweefsel voor histologie is uitdagend. Zo is het moeilijk om een OR aan een specifiek type sensilla te lokaliseren met behulp van RNA in situ hybridisatie. In dit document wordt een gedetailleerd en zeer effectief RNA in situ hybridisatie protocol in het bijzonder voor lowly uitgedrukt OR genen van insecten geïntroduceerd. Daarnaast is een specifieke OR Gen waS geïdentificeerd door het uitvoeren van dubbele kleur fluorescerende in situ hybridisatie experimenten onder gebruikmaking van een co-expressie receptor-gen, Orco , als een marker.
Introduction
Insectantenne, die de belangrijkste chemosensorische organen zijn, zijn bedekt met veel haarachtige structuren - genaamd sensilla - die door de Olfactor Receptor Neurons (ORNs) worden geïnvesteerd. Op het membraan van insecten ORN's, geurstofreceptoren (OR's), een type eiwit dat zeven transmembrane domeinen bevat, worden uitgedrukt met een coreceptor (ORco) om een heteromeer te vormen dat fungeert als een geurstofgated ion-kanaal 1 , 2 , 3 . Verschillende OR's reageren op verschillende combinaties van chemische verbindingen 4 , 5 , 6 .
Sprinkhanen ( Locusta migratoria ) vertrouwen voornamelijk op olfactische signalen om belangrijke gedragingen te veroorzaken 7 . Locust ORs zijn belangrijke factoren voor het begrijpen van moleculaire olfactorische mechanismen. Lokeren van een specifiek sprinkaan OR-gen voor de neuron van aMorfologisch specifiek sensillum type door RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) is de eerste stap in het verkennen van de ORs functie.
RNA ISH maakt gebruik van een gelabelde complementaire RNA-probe om een specifieke RNA-sequentie in een gedeelte van weefsel, cellen of hele mounts in situ te meten en lokaliseren, die inzicht geeft in fysiologische processen en pathogenese van ziekten. Digoxigenine-gelabelde (DIG-gemarkeerde) en biotine-gelabelde RNA probes zijn wijd gebruikt in RNA hybridisatie. RNA-etikettering met digoxigenine-11-UTP of biotine-16-UTP kan worden bereid door in vitro transcriptie met SP6 en T7 RNA polymerasen. DIG- en biotine-gelabelde RNA probes hebben de volgende voordelen: niet-radioactief; veilig; stal; hoog sensitief; Zeer specifiek; En makkelijk te produceren met behulp van PCR en in vitro transcriptie. DIG- en biotine-gelabelde RNA-probes kunnen chromogeen en fluorescentief gedetecteerd worden. DIG-gemerkte RNA probes kunnen worden gedetecteerd met anti-digoxigenin AlkaliNe-fosfatase (AP) geconjugeerde antilichamen die kunnen worden aangetoond met het zeer gevoelige chemiluminescerende substraten nitroblue tetrazoliumchloride / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat toluidine zout (NBT / BCIP) met behulp van een optische microscoop of met 2 -hydroxy-3-naftoïnezuur-2'-fenylanilidefosfaat (HNPP) gekoppeld met 4-chloor-2-methylbenzeendiediazonium hemi-zinkchloridezout (Fast Red) onder gebruikmaking van een confocale microscoop. Biotine-gemarkeerde RNA probes kunnen worden gedetecteerd met anti-biotine streptavidine Horse Radish Peroxidase (HRP) geconjugeerde antilichamen die kunnen worden gevisualiseerd met fluoresceïne-tyramiden met behulp van een confocale microscoop. Zo kan dubbele kleur fluorescerende in situ hybridisatie worden uitgevoerd om twee doelgenen in één segment te detecteren met gebruikmaking van DIG- en biotine-gemarkeerde RNA probes.
RNA ISH met DIG- en / of biotine-gemarkeerde probes is succesvol gebruikt om olfactorische gerelateerde genen te lokaliseren, zoals OR , ionotrope receptor, reukstofbindend eiwitEn sensorisch neuron membraan eiwit, in insectenantennen van, maar niet beperkt tot, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria en de woestijn sprinkaan Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Er zijn echter twee belangrijke uitdagingen bij het uitvoeren van RNA ISH voor insecten ORs: (1) OF genen (behalve ORco ) worden op lage niveaus uitgedrukt en slechts in een paar cellen, waardoor detectie van het signaal erg moeilijk is, en (2) het behoud van insectenweefsel voor Histologie, zodanig dat de morfologie behouden blijft en de achtergrondgeluid laag is, kan uitdagend zijn. In dit artikel een gedetailleerd en effectief protocol dat RNA ISH beschrijft voor het lokaliseren van OR genen in insectenAntennes worden gepresenteerd, inclusief zowel chromogene als Tyramide Signal Amplification (TSA) detectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Om de RNA-afbraak te beperken, bereid oplossingen met behulp van nat-geautoclaafdestilleerd water (bij 121 ° C gedurende 60 minuten) en ook nat-autoclaafmaterialen.
1. Bereiding van RNA ISH Antisense en Sense Probes
- Doelgenversterking en zuivering
- Begin eerst een 387 bp dubbelstrengs fragment van L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) van het plasmide dat het volledige lengte cDNA van LmigOR1 bevat met een Taq DNA-polymerase die adenines aan beide uiteinden van de fragmenten toevoegt.
- Met een 100 ul uiteindelijke reactievolume, die 50 ui 2x reactiemengsel, 4 pi elk van sense en antisense primers (Tabel 1), 1 pl plasmide template en 41 pi RNase-vrij H2O Gebruik de volgende PCR Protocol: 94 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 1 min, Gevolgd door 72 ° C gedurende 10 minuten.
- Herhaal deze stappen om het 1.303 bp dubbelstrengige fragment van LmigOR2 (GenBank: JQ766966) en 1,251 bp dubbelstrengs fragment van LmigORco (GenBank: JN989549) te produceren. De in deze experimenten gebruikte primers worden weergegeven in Tabel 1 .
- Run PCR producten op 1,2% agarose gels in 1x Tris-acetaat-EDTA buffer en visualiseer met behulp van ethidiumbromide kleuring.
- Uittreksel deze PCR producten met behulp van een gel extractie kit.
- Na elektroforese banden accijns DNA uit de gel en plaats de gel plakjes in een 1,5 ml buis. Voeg dan 100 μl bindingsbuffer (Buffert PN) per 0,1 g gelegment toe. Vortex en incubeer bij 50 ° C tot de gelskijf volledig is opgelost.
- Plaats een CA2 adsorptiekolom in de collectiebuis en voeg 500 μL balansbuffer (buffer BL) toe. Dit verbetert de absorptievermogen en stabiliteit van het siliciumdioxide membraan. CentriFuge op 12.400 xg gedurende 1 min.
- Breng het opgeloste gelmengsel over aan het adsorptiekolomsamenstel en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens centrifugeer buizen bij 12.400 xg gedurende 1 min. Gooi de doorstroom door en plaats de adsorptiekolom opnieuw in de collectiebuis.
- Voeg 600 μl wasoplossing (ethanol toegevoegd, Buffer PW) tweemaal toe. Centrifugeer bij 12.400 xg gedurende 1 minuut. Verwijder doorstroming en plaats de adsorptiekolom opnieuw in de collectiebuis.
- Leeg de verzamelbuis en recycleer het kolomsamenstel bij 12.400 xg gedurende 2 minuten om verdamping van eventuele resterende ethanol mogelijk te maken.
- Zorg de adsorptiekolom voorzichtig over op een schone 1,5 ml centrifugebuis. Luchtdroog de pellet gedurende 5-10 minuten en herleef het DNA opnieuw in een geschikt volume ( bijv. 30 μL) nuclease-vrij water.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 12.400 xg gedurende 2 minuten. Gooi de adsorptiekolom weg en berg het DNA bij 4 ° C of -20 ° C.
- Begin eerst een 387 bp dubbelstrengs fragment van L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) van het plasmide dat het volledige lengte cDNA van LmigOR1 bevat met een Taq DNA-polymerase die adenines aan beide uiteinden van de fragmenten toevoegt.
- Construeer de recombinante plasmiden
- Individueel ligeren het 387 bp fragment van LmigOR1 , 1.303 bp fragment van LmigOR2 en 1,251 bp fragment van LmigORco in een T vector die promotors bevat voor T7 (stroomopwaarts) en SP6 (stroomafwaarts) RNA polymerasen grenzend aan het ingevoegde DNA met behulp van T4 DNA ligase. Bereid de volgende 10 μl reactie op: 5 μl 2x ligatiebuffer, 1 μl T-vector, 3 μL (~ 100 ng) van het DNA van het ingevoegde gen en 1 μl T4 DNA-ligase en incubeer O / N bij 4 ° C.
- Voeg 5 μl van elk recombinant plasmide toe dat het 387 bp fragment van LmigOR1 , 1,303 bp fragment van LmigOR2 en 1,251 bp fragment van LmigORco afzonderlijk in 50 μl bevoegde Escherichia coli DH5a cellen in steriele 1,5 ml buizen bevat.
- Meng het voorzichtig en doe de buizen 30 minuten in ijs en voeg ze vervolgens gedurende 90 s bij 42 in° C. Breng ze 3 minuten terug in ijs.
- Voeg 450 μL Luria-Bertani (LB) vloeibaar medium zonder ampicilline toe aan elke buis en incubeer ze in een shaker bij 150 rpm gedurende 1 uur bij 37 ° C om de E. coli DH5a te herstellen.
- Neem een 100 μl aliquot van elke transformant en gebruik ze om LB vaste substraatplaten te bevatten die 50 μg / ml ampicilline bevatten, 24 μg / ml isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 40 μg / ml 5-broom-4 -chloor-3-indolyl-P-D-galactopyranoside (X-gal).
- Incubeer deze platen gedurende 18 uur in een constante incubator bij 37 ° C. Scherm de doelrecombinante plasmiden met behulp van de blauw-witte screeningswerkwijze. Volg de doelrecombinante plasmiden aan met behulp van Sanger-sequencing en identificeer de instructies van de drie OR genen.
- Selecteer restrictie-endonucleasen om recombinante plasmiden te lineariseren
- Gebruik restrictie-endonucleasen tHoed verteren niet alleen op de meervoudige kloneringsplaats van de vector maar snijd het insert DNA ook niet. In dit experiment worden alle 3 genen in de T-vector ingevoegd in de richting die overeenkomt met die van de vector.
- Gebruik Nco I-restrictie-endonuclease om de recombinante plasmiden te lineariseren die het 387 bp fragment van LmigOR1 , 1,303 bp fragment van LmigOR2 en 1,251 bp fragment van LmigORco bevatten om de antisense probes te produceren. Gebruik Sp e I-restrictie-endonuclease om de sensesonde te produceren.
OPMERKING: Als de invoegrichting overeenkomt met die van de vector, wordt een unieke restrictieplaats vanaf het einde van T7 geselecteerd om het recombinante plasmide te lineariseren en SP6 RNA-polymerase wordt gebruikt om de antisense-probe te bereiden. Een unieke restrictieplaats vanaf het einde van SP6 wordt geselecteerd om het recombinante plasmide te lineariseren, en het T7-RNA-polymerase wordt gebruikt om de sonde-probe te bereiden. Anders, als de invoegrichting niet overeenkomt met tDe richting van de vector, dan wordt een unieke restrictieplaats vanaf het einde van SP6 geselecteerd om het recombinante plasmide te lineariseren en T7 RNA-polymerase wordt gebruikt om de antisense-probe te bereiden. De unieke restrictieplaats vanaf het einde van T7 wordt geselecteerd om het recombinante plasmide te lineariseren, en het SP6 RNA-polymerase wordt gebruikt voor het bereiden van sinten.
- Het zuiveren van de gelineariseerde recombinante plasmiden
- Digest 20 μg elk van de drie recombinante plasmiden die het 387 bp fragment van LmigOR1 , 1,303 bp fragment van LmigOR2 en 1,251 bp fragment van LmigORco bevatten, gebruikmakend van het Nco I-restrictie-endonuclease in een 100 μl reactie die 10 μl van 10x buffer, 40 μl van 0,5 ug / ul plasmide, 3 pl NcoI en 47 ul RNase-vrij H2O, gevolgd door 3 uur incubatie bij 37 ° C.
- Op soortgelijke wijze verdelen 20 μg van elk van deze drie recombinante plasmiden uZing het Spe I-restrictie-endonuclease.
- Zuiver deze verteerde plasmiden met behulp van een gel-extractie kit zoals beschreven in 1.1.2. Bepaal de concentraties van deze geëxtraheerde gelineariseerde recombinante plasmiden door spectrofotometrie en stel ze aan op 0,5 μg / μL.
- Bereid antisense en sense probes op
- Gebruik het T7 / SP6 RNA transcriptiesysteem om antisense en sense probes te genereren. SP6 RNA polymerase wordt gebruikt om dubbelstrengs RNA voor DIG- en biotine-gemerkte antisense probes te transcribe voor deze drie OR genen met gebruikmaking van gelineariseerde recombinante plasmiden als templates in vitro . De T7 RNA polymerase wordt gebruikt om sensesonderzoeken te produceren. Voer de reactie uit in een 20 μl eindvolume, bevattende 2 μL 10x NTP-mix, 2 μl 10X transcriptiebuffer, 1 μL RNase-remmer, 2 μl T7 of SP6 RNA-polymerase, 4 μl 0,5 μg / μL gelineariseerd plasmide en 9 pi RNase-vrij H2O, gevolgdDoor een incubatie van 3 uur bij 37 ° C.
- Incubeer de DIG- en biotine-gemerkte antisense- en sense probes gedurende 30 min met 1 μL DNase bij 37 ° C. Voeg 2,5 μL 5 M LiCl en 75 μl absolute ethanol toe en incubeer vervolgens de reacties gedurende 30 minuten bij -70 ° C.
- Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Dek de supernatant zorgvuldig af. Voeg 150 μl 70% ethanol toe om het precipitant te wassen. Bereid de 70% ethanol (1 L) door 95% ethanol (736,8 ml) toe te voegen aan steriel gedestilleerd water (263,2 ml).
- Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en laat de pellet 5-10 minuten bij kamertemperatuur drogen. Voeg 25 ul RNase-vrij H2O aan het RNA antisense en sense probes lossen.
- Als de lengte van het ingevoegde gen langer is dan 1 kb, probeert vervolgens fragment RNA antisense en sense tot een gemiddelde lengte van ~ 300 bp door incubatie in een bicarbonaat-carbonaatbufferoplossingen. Voer de reactie uit in een 50 μl eindvolume, containing 25 pi van de RNA probe en 25 pl van de bicarbonaat-carbonaatbuffer-oplossing (80 mM NaHCO3, 120 mM Na 2CO 3, pH 10,2) bij 60 ° C. De vereiste hydrolyse-tijd is gegeven door een eerder gepubliceerde formule 17 .
- Voeg 5 μl 10% azijnzuur toe om de reactie te stoppen. In dit experiment fragmenteer de LmigOR2 en LmigORco antisense en sense probes voor respectievelijk 24 en 23 minuten.
T = (L o- L f ) / kXL o XL f
L o = de initiële fragmentlengtes in kb
L f = de uiteindelijke fragmentlengtes in kb
K = de snelheidskonstante voor hydrolyse, ongeveer 0,11 kb -1 min -1
T = de hydrolystijd in min - Voeg tenslotte 250 μl hybridisatiebuffer toe en berg bij -80 ° C.
2. Bereiding van cryostatsecties
- Voorbereiding van de freeziNg microtome tot -24 ° C.
- Selecteer nieuwe moltende volwassen sprinkhanen die actief zijn en hebben intacte antennes. Snijd de antennes in 2-3 mm stukken met behulp van steriele scheermesjes.
- Zet OCT-verbinding op een bevriezende microtomehouder en zet een of twee monsters op de verbinding horizontaal. Vervolgens de houder overbrengen in het vriespunt microtome bij -24 ° C om evenwicht te maken tot de verbinding bevriest. Haal de houder uit en bedek de monsters met een kleine verbinding. Draai de houder gedurende tenminste 10 minuten opnieuw in de ijskast bij -24 ° C ( Figuur 1 ).
OPMERKING: Vermijd bellen in de verbinding. - Bevestig de houder met de monsters in de bevriezende microtoom en snijd de bevroren monsters in 12 μm dikke plakjes bij -24 ° C.
- Ontdooi de plakjes een voor één op de glijbanen (25 x 75 mm; nuclease-vrij) en laat 10 min lucht drogen.
3. Bevestigingsafdelingen
- Na het bereiden van cryostatSecties, zet de glijbanen in een plastic houder (~ 100 x 40 x 80 mm) en maak de weefsels vast door de glijbanen in 4% paraformaldehyde oplossing (PFA) gedurende 30 minuten bij 4 ° C te incuberen.
- Was de glijbanen in 1 x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 minuut.
- Om de alkalische eiwitten te elimineren, breng de glijbanen over op 0,2 M HC1 gedurende 10 minuten.
- Om het oppervlak eiwit van nucleïnezuur te elimineren, breng de glijbanen over 1 minuut aan 1XPBS met 1% Triton X-100 gedurende 2 minuten.
- Was de dia's tweemaal gedurende 30 s in 1x PBS.
- Ten slotte spoel de glijbanen in formamide-oplossing gedurende 10 minuten bij 4 ° C af.
4. Hybridisatie
- Bereid de antisense- en sense probes op
- Gebruik hybridisatiebuffer aan verdunde RNA antisense of sense probes in de 1,5 ml nuclease-vrije buizen. In dit experiment, voor alle antisense en sense probes ( LmigOR1, LmigOR2 en LmigOrco ), 1 μL probe aan 99 μL hybridisatiebuffer per dia. In het algemeen produceert het gebruik van 1: 100 verdunningen van antisense probes significante positieve signalen en lage achtergronden met dit protocol.
- Voor chromogene detectie, verdund DIG-gemarkeerde probes afzonderlijk.
- Voor TSA-detectie verdund DIG-gemerkt LmigOR1 met biotine-gelabelde LmigOrco probes of DIG-gemerkt LmigOR2 met biotine-gemerkte LmigOR1 probes samen in de hybridisatie buffer.
- Verwarm de verdunningen gedurende 10 minuten bij 65 ° C en zet ze gedurende tenminste 5 minuten op ijs.
- Hybridisatie
- Dreineer de glijbanen en voeg 100 μL verdunde antisense- en sintestanden (stap 4.1) toe aan de weefselsecties. Plaats dan de deklagen (24 mm x 50 mm, nuclease-vrij) op de weefselsecties.
- Leg de bedekte glijbanen horizontaal in een vochtige doos (~300 x 180 x 50 mm 3 ; figuur 2 ) en incubeer eenT 55 ° C gedurende 22 uur. Voeg formamide-oplossing of 1X PBS in de bodem van de doos om het milieu vochtig te houden, maar doe de dia's niet in de vloeistof.
- Wassen en blokkeren.
- Na hybridisatie, verwijder de deksels zorgvuldig. Was de dia's tweemaal gedurende 30 minuten in 0,1x Zoutzuur Natrium Citraat (SSC) bij 60 ° C.
OPMERKING: Wassen betekent het plaatsen van de glijbanen in een glijhouder die vervolgens in een plastic houder wordt geplaatst en op een tuimelschakelaar wordt geroerd (~ 50 rpm; Figuur 2 ). - Spoel de glijbanen in 1x Tris-Buffered Saline (TBS) gedurende 30 s.
- Voeg 1 ml 1% blokkeringsreagens in TBS toe met 0,03% Triton X-100 op elke glijbaan en incubeer gedurende 30 minuten. Vervolgens de blokkeringsoplossing weggooien.
- Na hybridisatie, verwijder de deksels zorgvuldig. Was de dia's tweemaal gedurende 30 minuten in 0,1x Zoutzuur Natrium Citraat (SSC) bij 60 ° C.
- Immunohistochemie.
- Voor chromogene detectie, gebruik blokkeerreagens in TBS om 750 eenheden (U) / ml anti-digoxigenine AP-geconjugeerde antibiotica te verdunnenDy tot 1,5 U / ml AP-oplossing. Voeg 100 μL AP oplossing per bedekte (24 mm x 50 mm) glijbaan toe.
- Voor TSA detectie, gebruik blokkeerreagens in TBS om 750 U / ml anti-digoxigenine AP-geconjugeerde antilichaam en anti-biotine streptavidine HRP-geconjugeerde antilichaam tegen de AP / HRP oplossing te verdunnen. Voeg 100 μl AP / HRP oplossing per bedekte (24 mm x 50 mm) glijbaan toe.
- Incubeer de glijbanen in een vochtige doos ( Figuur 2 ) gedurende 60 minuten bij 37 ° C. Gebruik de formamideoplossing of 1X PBS om de doos vochtig maar niet vochtig te houden.
5. Staining
- Verwijder de dekglazen zorgvuldig. Was de glijbanen driemaal gedurende 5 minuten in 1x TBS aangevuld met 0,05% Tween-20. Spoel de dia's in DAP-buffer (chromogene detectie: pH 9,5; TSA detectie: pH 8,0) gedurende 5 minuten.
- Staining (chromogene detectie)
- Voeg 100 μL NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) substraatoplossing toe (verdund in DAP;PH 9,5) aan elke glijbaan. Plaats de deksels (24 x 50 mm) zorgvuldig op de glijbanen.
- Incubeer de glijbanen in een vochtige doos met substraatoplossing gedurende 10 minuten - O / N bij 37 ° C.
OPMERKING: Controleer de ontwikkeling door de dia's van tijd tot tijd onder de microscoop te bekijken. - Als de ontwikkeling klaar is, stop de reactie door de dia's over te brengen in water.
- Staining (TSA detectie)
- Gebruik een spuit om het HNPP (100 μg / ml) / Fast Red (250 μg / ml) substraat van het spuitfilter (0,22 μm, Figuur 2 ) te verplaatsen.
- Voeg 100 μL HNPP / Fast Red substraat per dia bedekt met een deklaag (24 x 50 mm). Incubeer de dia's gedurende 30 minuten met HNPP / Fast Red substraat bij RT.
- Verwijder de dekglazen zorgvuldig en doe de slides driemaal gedurende 5 minuten in 1X TBS, aangevuld met 0,05% Tween-20.
- Gebruik 100 μL TSA substraat / bedekt (24 x 50 mm 2 ) glijden. Incubeer de dia's met TSA-substraat gedurende 10 minuten bij RT.
- Verwijder de dekglazen zorgvuldig en wast de dia's driemaal gedurende 5 minuten in 1x TBS aangevuld met 0,05% Tween-20.
- Leg de glijbanen in PBS / glycerol (1: 3) in.
OPMERKING: Nadat u deze procedures hebt afgerond, dienen de glijbanen zo snel mogelijk te worden opgevolgd, omdat het fluorescentie signaal snel uitblaast.
6. Waarneming
- Chromogene detectie
- Let op weefselsecties met behulp van een optische microscoop. Kies de objectieven van 10X, 20X en 40X om de resultaten van chromogene detectie te observeren.
- Gebruik DP-BSW software om de resultaten te analyseren en de afbeeldingen vast te leggen.
- TSA detectie
- Let op weefselsecties met behulp van een confocale microscoop. DIG-gemarkeerde genen moeten worden waargenomen onder 543 nm licht, een rode kleur presenteren en biotine-gemarkeerde genen zouden moeten zijnWaargenomen onder 488 nm licht, met een groene kleur. Als ze opkomen, presenteren ze gele kleur.
- Kies de 20x en 40X objectieve lenzen om de resultaten van TSA detectie respectievelijk te observeren.
- Gebruik FV1000 software om de resultaten te analyseren en de afbeeldingen vast te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij chromogene detectie werd een kleine subset van de antennalcellen in elke volwassen antenne-sectie aangeduid door de DIG-gemerkte LmigOR1- en LmigOR2- antisense-probes ( Figuur 3 ). RNA ISH op opeenvolgende secties lokaliseren LmigOR1 en LmigOR2 gebleken dat antennal cellen die beide genen werden in ORN clusters LmigORco tot expressie, wat aangeeft dat de vermeende LmigOR1 en LmigOR2 daadwerkelijk tot expressie gebracht in ORNs (figuur 4a-4D). Af en toe werden gelabelde dendritische structuren weergegeven ( Figuur 4e- 4f ). LmigOR1 en LmigOR2 waren beide gelokaliseerd aan neuronen in de basische sensilla ( Figuur 5a-5b ), maar ze werden niet uitgedrukt in individuele sensilla, wat aangeeft dat ze aanwezig waren in verschillende basico Nic sensillium subtypen ( figuur 5c-5 d ).
Bij TSA-detectie bleek dat in twee-kleuren fluorescerende in situ hybridisatie LmigOR1-expressieve cellen (rode kleur) in ORN-clusters waren die LmigORco (groene kleur) uitdrukken, wat aangeeft dat de vermeende LmigOR1 uitgedrukt in ORN's ( Figuur 6a ). Een nauwe weergave van de doosgebieden in figuur 6a zijn getoond in figuur 6b . LmigOR1 - het uitdrukken van neuronen (groene kleur, Figuur 7a ) en LmigOR2-expressieve neuron (rode kleur, Figuur 7b ) bevonden zich aan verschillende basische sensillium subtypen ( Figuur 7c ).
4 / 55924fig1.jpg "/>
Figuur 1: Bereiding van insectenantennale secties voor RNA In situ Hybridisatie. (A) De bevriezing microtoom; ( Bc ) De monsters zijn ingebed in ijskoude OCT-verbinding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele voorwerpen voor RNA In Situ Hybridisatie . (A) De slede houder en de kunststofhouder. ( B ) de vochtige doos. ( C ) de tuimelschakelaar. ( D ) het membraanfilter ( E ) Confocal microscoop. .jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cellulaire lokalisatie van LmigOR1 & LmigOR2 in olfactorische organen. (A) Overzicht van LmigOR1 expressie brengende cellen in een sprinkhaan antennaal segment. ( B ) Overzicht van LmigOR2-expressieve cellen in een sprinkaan antennalsegment. Pijlpunten geven aan op cellen die LmigOR1 ( a ) en LmigOR2 ( b ) uitdrukken. Schaalstaven = 100 μm (a en b). Cijfers werden aangepast van Xu et al. 12 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Neuronale identiteit van antennale cellen die LmigOR's uitdrukken door Chromogene Detecties. ( Ab ) Het etiketteringspatroon van LmigOR1 ( a ) en LmigORco ( b ) antisense sonde op opeenvolgende delen van sprinkaanantenne . ( Cd ) Het etiketteringspatroon van LmigORco ( c ) en LmigOR2 ( d ) antisense sonde op opeenvolgende delen van sprinkhanenantenne. ( Ef ) Illustratie van af en toe gemerkte dendritische structuren (aangegeven door rode pijlen). Schaalstaven = 50 μm (ad); 20 μm (e en f). Cijfers werden aangepast van Xu et al. 12 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Nt "voor: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 5: LmigOR1 & LmigOR2 worden uitgedrukt in ORNs in de Basiconic Sensilla. ( Ab ) Basiconic sensillum gehuisvest ORNs die LmigOR1 ( a ) en LmigOR2 ( b ) uitdrukken. ( Cd ) De expressie van LmigOR1 en LmigOR2 in verschillende subset van antennale ORN's werd gecontroleerd in opeenvolgende secties (cd). Arrowheads wijzen op antennalcellen die LmigOR1 (a, c) en LmigOR2 (b, d) uitdrukken. Ba: basiconic sensillum. Schaalstaven = 20 μm (a en b); 50 μm (c en d). Cijfers werden aangepast van Xu et al. 12 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Neuronale Identiteit van Antennale Cel Uitdrukken van LmigOR1 door TSA Detecties. (A) Twee-kleur in situ hybridisatie werd uitgevoerd op longitudinale antennaal gedeelte om de expressie van LmigOR1 (rood) en LmigORco (groen) tonen. Lokalisatie van LmigOR1- expressieve cellen in celclusters die LmigORco uitdrukken , bevestigde zijn neurale identiteit. ( B ) Dichtbijzicht van de vakgebieden in a. Af en toe gemerkte dendritische structuren werden door pijl aangegeven. Cirkelvormige gebieden wijzen op ORNs cluster expressie LmigORco en delen hetzelfde sensillum. Schaalstaven = 50 μm (a); 20 μm (b). Cijfers werden aangepast van Xu et al. 12 Gelieve cLik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 7: LmigOR1 en LmigOR2 bevonden zich op verschillende Basiconic Sensilla ORNs door TSA Detection. Fluorescente signalen werden door middel van detectiesystemen visualiseerd, waarbij LmigOR1- gemerkte neuronen door groene fluorescentie ( a ) en LmigOR2- positieve cellen door rode fluorescentie ( b ) werden aangeduid in verschillende basische sensorische subtypen ( c ). Arrowheads wijzen op antennalcellen die LmigOR1 en LmigOR2 uitdrukken. Schaalstaven = 20 μm. Cijfers werden aangepast van Xu et al. 12 Klik hier om eenGrotere versie van deze figuur.
| Naam | Opeenvolgingen |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
Tabel 1: De sequenties van de PCR Primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is moeilijk om RNA ISH uit te voeren om OR genen in insectenantennen te lokaliseren, omdat de expressieniveaus van OR-genen, behalve ORco , zeer laag zijn en het behoud van histologische plakjes insectenantenne zeer moeilijk is. Bovendien is TSA detectie ook erg lastig. Om deze problemen aan te pakken, dienen de volgende maatregelen te worden genomen. De antennes worden geselecteerd uit nieuwsmoltende sprinkhanen met dunne en zachte antennaleikels, die hun morfologie op de glijbaan handhaven. De bevroren monsters worden gesneden in 12 μm dikke plakjes. Zeer gevoelige en specifieke biotine- en DIG-gelabelde probes worden gebruikt. Wasmiddelen, zoals Tween-20 en Triton X-100, worden gebruikt om de achtergrond in veel stappen te verminderen. Bij TSA-detectie moet een hooguitgedrukt gen, in relatie tot een ander laag uitgedrukt gen, worden gemerkt met biotine-16-UTP. De glijbanen moeten zo snel mogelijk opgevolgd worden, omdat de fluorescente signalen snel knipperen.
DIG-aEn biotine-gemarkeerde probes hebben de voordelen van langere houdbaarheidsduur, hogere signaal-ruisverhoudingen en betere cellulaire resoluties dan radioactieve probes 18 , 19 . Het protocol dat in dit document wordt gepresenteerd, heeft enkele voordelen ten opzichte van gehele mount in situ hybridisatie. Dit protocol identificeert gemakkelijk de lokalisaties van genen op het cellulaire niveau, maar kan niet gemakkelijk worden gebruikt om genverdelingspatronen te onderzoeken, die gemakkelijker uitgevoerd wordt met gehele mount in situ hybridisatie.
Om een OR-gen te identificeren, werden twee benaderingen genomen. Eén was de chromogene detectie in opeenvolgende secties, en de andere was fluorescerende detectie in één sectie. ORco wordt co-uitgedrukt met een specifieke OR als een ORN marker 10 , 20 , 21 . Cellen die LmigOR1 of LmigOR2 uitdrukken waren beide gelegenNaar clusters van LmigORco-expressieve cellen die ze ondubbelzinnig hebben geverifieerd als OR's ( Figuur 4 en Figuur 6 ). Met dezelfde benaderingen vonden we dat LmigOR1 en LmigOR2 niet in één sensillum worden uitgedrukt. De resultaten van deze twee benaderingen zijn bevestigend.
Dit protocol werd ook succesvol gebruikt om LmigORco, SgreORco, SgreIR8a en SgreIR25a in locustanten 10 , 14 te lokaliseren. Recentelijk werd LmigOR3 gelokaliseerd aan trichoid sensilla neuronen in L. migratoria met hetzelfde protocol 15 . Dit protocol werd gebruikt om twee sensorische neurale membraan eiwitten te lokaliseren SgreSNMP1 en SgreSNMP2 in de antennes van S. gregaria 16 . Zo is dit protocol betrouwbaar gelokaliseerde chemosensory-gerelateerde genen in sprinkaanantenne, die deze niet alleen verifiërenKandidaatgenen, maar ook deze genen gelokaliseerd naar specifieke cellen die in verschillende soorten sensilla zijn gehuisvest.
Ten slotte wordt dit zeer effectieve protocol van RNA ISH specifiek beschreven om OR genen te lokaliseren, evenals andere genen die op lage niveaus worden uitgedrukt in insectennennes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te openbaren of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr.31472037). Het vermelden van handelsnamen of handelsproducten in dit artikel is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en houdt geen aanbeveling in.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
