Summary
本文描述了一种详细和高效的RNA 原位杂交方案，特别是对于低水平表达的气味受体（OR）基因以及其他基因，在使用地高辛（DIG）标记或生物素标记的探针的昆虫天线中。
Abstract
昆虫已经发展了复杂的嗅觉接收系统来感测外源化学信号。这些化学信号由嗅觉受体神经元（ORNs）转导，其位于天线的头发状结构（称为化学感光体）中。在ORN的膜上，认为气味受体（ORs）参与气味编码。因此，能够识别定位于ORN的基因是识别OR基因所必需的，为进一步的功能性原位研究提供了基础。昆虫天线中特异性OR的RNA表达水平非常低，用于组织学的保存昆虫组织具有挑战性。因此，使用RNA 原位杂交难以将OR定位到特定类型的感觉器。在本文中，介绍了详细和高效的RNA 原位杂交方案，特别是对昆虫的低表达OR基因。另外还有一个具体的OR 基因哇通过使用共表达受体基因Orco进行双色荧光原位杂交实验鉴定 。
Introduction
作为最重要的化学感觉器官的昆虫天线被许多由嗅觉受体神经元（ORN）支配的头发状结构（称为感觉）覆盖。昆虫ORNs的膜，气味受体（ORS），一种类型的包含七个跨膜结构域的蛋白质，与共同受体（ORCO）以形成杂聚体表示其功能如同一个加臭剂门控离子通道1，2，3。不同的OR响应化学化合物4，5，6的不同组合。
蝗虫（ Locusta migratoria ）主要依靠嗅觉信号触发重要行为7 。蝗虫OR是理解分子嗅觉机制的关键因素。将特定的蝗虫OR基因定位到a的神经元通过RNA的形态特异性感觉类型原位杂交（RNA ISH）是探索ORs功能的第一步。
RNA ISH使用标记的互补RNA探针来测量和定位组织，细胞或整个原位部分的特异性RNA序列，从而提供对生理过程和疾病发病机理的见解。地高辛标记（DIG标记）和生物素标记的RNA探针已被广泛用于RNA杂交。用地高辛-11-UTP或生物素-16-UTP进行RNA标记可以通过SP6和T7 RNA聚合酶的体外转录来制备。 DIG-和生物素标记的RNA探针具有以下优点：非放射性;安全;稳定;高度敏感;高度特异性并且使用PCR和体外转录容易产生。 DIG-和生物素标记的RNA探针可以发色和荧光检测。 DIG标记的RNA探针可以用抗地高辛碱碱检测使用光学显微镜或2位可以用高度敏感的化学发光底物硝基蓝四唑氯化物/ 5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸酯甲苯胺盐（NBT / BCIP）可视化的ne磷酸酶（AP）共轭抗体使用共聚焦显微镜与4-氯-2-甲基苯并噻唑半氯化锌盐（Fast Red）偶合的3-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐（HNPP）。可以用抗生物素链霉亲和素马萝卜过氧化物酶（HRP） - 共轭抗体检测生物素标记的RNA探针，该抗体可以使用共聚焦显微镜用荧光素 - 酪酰胺显色。因此，可以进行双色荧光原位杂交以使用DIG-和生物素标记的RNA探针在一个切片中检测两个靶基因。
具有DIG和/或生物素标记的探针的RNA ISH已被成功地用于定位嗅相关基因，如OR ，离子型受体，加味剂结合蛋白和感觉神经元的膜蛋白，在昆虫天线，但不限于， 黑腹果蝇 ， 冈比亚按蚊 ，L.飞蝗和沙漠蝗虫Schistocera蝗 8，9，10，11，12，13，14，15，16。然而，为昆虫ORs进行RNA ISH时有两个实质性的挑战：（1）OR基因（ ORco除外）以低水平表达，仅在少数细胞中表达，使信号检测非常困难，（2）保存昆虫组织组织学，使得形态被保留并且背景噪声低，可能是具有挑战性的。在本文中，详细和有效的方案描述了用于在昆虫中定位OR基因的RNA ISH提出了天线，包括显色和Tyramide信号放大（TSA）检测。
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Protocol
注意：为了限制RNA降解，请使用湿式高压灭菌蒸馏水（121℃，60分钟）和湿式高压釜材料制备溶液。
RNA ISH反义和检测探针的制备
- 靶基因扩增和纯化
- 首先，从含有LmigOR1全长cDNA的质粒与Taq DNA聚合酶一起产生A. migratoria OR1 （ LmigOR1 ，GenBank：JQ766965）的387bp双链片段，该Taq DNA聚合酶在片段的两端添加腺嘌呤。
- 使用100μL最终反应体积，含有50μL的2x反应混合物，4μL有义和反义引物（ 表1 ），1μL质粒模板和41μL无RNase的H 2 O.使用以下PCR方案：94℃5分钟，然后是94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟的30个循环，72℃10分钟。
- 重复这些步骤以产生LmigOR2的1,303bp双链片段（GenBank：JQ766966）和Lmigorco （GenBank：JN989549）的1,251bp双链片段。这些实验中使用的引物列于表1 。
- 在1％Tris-acetate-EDTA缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，并使用溴化乙锭染色观察。
- 使用凝胶提取试剂盒提取这些PCR产物。
- 电泳后，从凝胶中切下DNA条带，将凝胶切片置于1.5 mL管中。然后，每0.1克凝胶切片加入100μL结合缓冲液（缓冲液PN）。涡旋并在50℃下孵育直到凝胶切片完全溶解。
- 将CA2吸附柱插入收集管，加入500μL平衡缓冲液（Buffer BL）。这提高了二氧化硅膜的吸收能力和稳定性。 CENTRI以12,400 x g的速度。for 1分钟。
- 将溶解的凝胶混合物转移到吸附柱组件，并在室温下孵育2分钟。然后，以12,400 xg离心管1分钟。放弃流通并将吸附柱重新插入收集管。
- 加入600μL洗液（乙醇加缓冲液PW）两次。以12,400 xg离心1分钟。放弃流通并将吸附柱重新插入收集管。
- 将收集管清空并以12,400×g离心柱组件2分钟以允许蒸发残留的乙醇。
- 小心地将吸附塔转移到干净的1.5 mL离心管中。将沉淀物干燥5-10分钟，并将DNA重新溶解在合适体积（ 例如 30μL）无核酸酶的水中。
- 在室温下孵育2分钟。以12,400 xg离心2分钟。丢弃吸附柱，并将DNA储存在4°C或-20°C。
- 首先，从含有LmigOR1全长cDNA的质粒与Taq DNA聚合酶一起产生A. migratoria OR1 （ LmigOR1 ，GenBank：JQ766965）的387bp双链片段，该Taq DNA聚合酶在片段的两端添加腺嘌呤。
- 构建重组质粒
- 单独结扎LmigOR1，LmigOR2的1303 bp片段和LmigORco的1251 bp的片段插入到包含用于T7（上游）和邻近于使用T4DNA连接酶的插入DNA SP6（下游）的RNA聚合酶启动子一T载体的387 bp片段。准备以下10μL反应：5μL2x连接缓冲液，1μLT载体，3μL（〜100 ng）插入的基因DNA和1μLT4 DNA连接酶，并在4°C孵育O / N。
- 添加含有LmigOR1的387 bp片段，LmigOR2的1303 bp片段和LmigORco的1251 bp的片段分别导入在无菌的1.5mL管主管大肠杆菌 DH5α细胞的50微升的各重组质粒的5μL。
- 轻轻混合并将管置入冰中30分钟，然后在42℃孵育90秒C。将它们转移回冰中3分钟。
- 在每个管中加入450μL无氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）液体培养基，并在振荡器中以37℃将其孵育1小时，以恢复大肠杆菌 DH5α。
- 取每个转化体的100μL等分试样，并使用它们接种含有50μg/ mL氨苄青霉素，24μg/ mL异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和40μg/ mL 5-溴-4 - 氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）。
- 在37℃恒温培养箱中孵育这些板18小时。使用蓝白色筛选方法筛选靶标重组质粒。使用Sanger测序序列目标重组质粒，并鉴定三个OR基因的插入方向。
- 选择限制性内切核酸酶线性化重组质粒
- 使用限制性内切核酸酶帽子不仅在载体的多克隆位点消化，而且不切割插入DNA。在该实验中，将所有3个基因以相对于载体的方向插入到T载体中。
- 使用的Nco I限制性核酸内切酶进行线性化含有LmigOR1的387 bp片段，LmigOR2的1303 bp片段和LmigORco的1251 bp片段，以产生反义探针的重组质粒。使用Sp e I限制性内切核酸酶产生感应探针。
注意：如果插入方向与载体方向相符，则选择T7末端的唯一限制性位点，使重组质粒线性化，并使用SP6 RNA聚合酶制备反义探针。选择SP6末端的独特的限制性位点使重组质粒线性化，并使用T7 RNA聚合酶制备感官探针。否则，如果插入方向不对应于t选择载体方向，然后从SP6末端选择一个独特的限制性位点，使重组质粒线性化，并使用T7 RNA聚合酶制备反义探针。选择T7末端的唯一限制性位点使重组质粒线性化，并使用SP6 RNA聚合酶制备有义探针。
- 纯化线性重组质粒
- 消化20微克每片含LmigOR1的387 bp片段，LmigOR2的1303 bp的片段，并使用的Nco I限制性核酸内切酶在包含10x缓冲液10微升100微升反应LmigORco的1251 bp的片段，40μL三个重组质粒的0.5μg/μL质粒， 3μLNco I和47μL无RNA酶的H 2 O，然后在37℃下孵育3小时。
- 类似地，消化20μg这三种重组质粒中的每一种唱Spe I限制性内切核酸酶。
- 使用如1.1.2所述的凝胶提取试剂盒纯化这些消化的质粒。通过分光光度法测定这些提取的线性化重组质粒的浓度，调整为0.5μg/μL。
- 准备反义和有义探针
- 使用T7 / SP6 RNA转录系统产生反义和感官探针。使用SP6 RNA聚合酶转录用于DIG-和生物素标记的反义探针的双链RNA用于这三种OR基因，使用线性化重组质粒作为体外模板。 T7 RNA聚合酶用于产生有义探针。在20μL终体积中进行反应，含有2μL10x NTP混合物，2μL10X转录缓冲液，1μLRNA酶抑制剂，2μLT7或SP6 RNA聚合酶，4μL0.5μg/μL线性化质粒和9μL无RNase的H 2 O，其次为在37℃孵育3小时。
- 在37℃下，用1μLDNA酶将DIG-和生物素标记的反义和感应探针孵育30分钟。加入2.5μL5M LiCl和75μL无水乙醇，然后在-70℃下将反应物温育30分钟。
- 在4℃下以15,000xg离心30分钟。仔细倾倒上清液。加入150μL70％乙醇洗涤沉淀剂。通过向无菌蒸馏水（263.2mL）中加入95％乙醇（736.8mL）制备70％乙醇（1L）。
- 在4℃下以15,000xg离心30分钟并在室温下空气干燥沉淀5-10分钟。加入25μL无RNase的H 2 O溶解RNA反义和感应探针。
- 如果插入的基因的长度长于1kb，随后通过在碳酸氢盐 - 碳酸盐缓冲溶液中温育，将片段RNA反义和有义探针平均长度达〜300bp。以50μL的最终体积进行反应，c的RNA探针的ontaining 25μL和碳酸氢盐碳酸盐缓冲溶液的25μL（80mM的碳酸氢钠 ，120毫的Na 2 CO 3，pH值10.2）在60℃下。所需的水解时间由先前公布的公式17给出 。
- 加入5μL的10％乙酸停止反应。在本实验中，分别将LmigOR2和LmigORco反义和感应探针片段分离 24和23分钟。
t =（L o -L f ）/ kXL o XL f
L o =以kb为单位的初始片段长度
L f =以kb为单位的最终片段长度
k =水解速率常数，约0.11 kb -1 min -1
t =水解时间（分钟） - 最后加入250μL杂交缓冲液，储存于-80°C。
2.制备低温恒温器部分
- 预冷自由子ng切片机至-24℃。
- 选择新的蜕皮成虫蝗虫，并且具有完整的天线。使用无菌剃刀将天线切成2-3毫米。
- 将OCT化合物置于冷冻切片机支架上，并将一个或两个样品水平放置在化合物上。然后，将支架转移到-24℃的冷冻切片机中以平衡直到化合物冻结。取出持有人，并用少许复合物覆盖样品。将支架置于-24°C的冷冻切片机中至少10分钟（ 图1 ）。
注意：避免在化合物中吸入气泡。 - 将样品固定在冷冻切片机中，然后在-24℃下将冷冻样品切成12μm厚的切片。
- 将切片在载玻片（25 x 75 mm;不含核酸酶）上逐个安装切片，风干10分钟。
3.固定部分
- 准备低温恒温器后切片，将载玻片置于塑料容器（约100 x 40 x 80 mm）中，并通过将载玻片在4％多聚甲醛溶液（PFA）中4℃孵育30分钟来固定组织。
- 在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤载玻片1分钟。
- 为了消除碱性蛋白质，将载玻片转移到0.2M HCl 10分钟。
- 为了消除核酸的表面蛋白，用1％Triton X-100将载玻片转移到1XPBS 2分钟。
- 在1x PBS中洗涤载玻片两次30秒。
- 最后，在4℃下将载玻片在甲酰胺溶液中冲洗10分钟。
杂交
- 准备反义和感应探针
- 使用杂交缓冲液稀释1.5毫升无核酸酶管中的RNA反义或感应探针。在本实验中，对于所有反义和有义探针（ LmigOR1，LmigOR2和LmigOrco ），加入1μL探针至99μL杂交缓冲液。通常使用1：100稀释的反义探针可以使用该方案产生显着的正信号和低背景。
- 对于显色检测，分别稀释DIG标记的探针。
- 对于TSA检测，稀释DIG标记LmigOR1与生物素标记的探针LmigOrco或DIG标记的LmigOR2与生物素标记探针LmigOR1一起在杂交缓冲液中。
- 在65℃下将稀释液加热10分钟，并将其放在冰上至少5分钟。
- 杂交
- 排出载玻片，并将100μL稀释的反义和感应探针（步骤4.1）加入到组织切片中。然后，将盖玻片（24毫米×50毫米，无核酸酶）放置在组织切片上。
- 将覆盖的水平放置在潮湿的箱子中（〜300 x 180 x 50 mm 3 ; 图2 ），并孵化at 55°C 22 h。将甲酰胺溶液或1X PBS加入到盒子的底部，以保持环境潮湿，但不要将载玻片浸没在液体中。
- 洗涤和阻塞。
- 杂交后，小心取出盖玻片。在0.1x盐水柠檬酸钠（SSC）中，60℃下将载玻片两次洗涤30分钟。
注意：洗涤意味着将滑块放入滑动架中，然后将其放入塑料容器中，并在摇臂上轻轻搅动（约50 rpm; 图2 ）。 - 在1x Tris缓冲盐水（TBS）中冲洗载玻片30秒。
- 在每个载玻片上补充有0.03％Triton X-100的TBS中加入1mL的1％封闭试剂，并孵育30分钟。然后，丢弃阻塞解决方案。
- 杂交后，小心取出盖玻片。在0.1x盐水柠檬酸钠（SSC）中，60℃下将载玻片两次洗涤30分钟。
- 免疫组化。
- 对于显色检测，使用TBS中的封闭试剂稀释750单位（U）/ mL抗地高辛AP-缀合的抗体dy至1.5 U / mL AP溶液。每个覆盖（24 mm x 50 mm）幻灯片添加100μLAP溶液。
- 对于TSA检测，使用TBS中的封闭试剂稀释到AP / HRP溶液中750U / mL抗地高辛AP-缀合的抗体和抗生物素链霉亲和素HRP-缀合的抗体。每个覆盖（24 mm x 50 mm）幻灯片添加100μLAP / HRP溶液。
- 在潮湿的箱子（ 图2 ）中孵育玻片在37℃下孵育60分钟。使用甲酰胺溶液或1X PBS保持箱子潮湿但不潮湿。
染色
- 仔细取出盖玻片。在补充有0.05％Tween-20的1×TBS中洗涤载玻片3次5分钟。在DAP缓冲液（显色检测：pH9.5; TSA检测：pH8.0）中冲洗载玻片5分钟。
- 染色（显色检测）
- 加入100μLNBT（375μg/ mL）/ BCIP（188μg/ mL）底物溶液（稀释于DAP;pH 9.5）。小心地将玻片（24 x 50毫米）放在幻灯片上。
- 在含有底物溶液的潮湿箱中，将载玻片在37℃下孵育10分钟--O / N。
注意：通过在显微镜下不时查看幻灯片来检查发展。 - 当开发准备就绪时，通过将载玻片转移到水中来停止反应。
- 染色（TSA检测）
- 使用注射器从注射器过滤器（0.22μm; 图2 ）移动HNPP（100μg/ mL）/ Fast Red（250μg/ mL）底物。
- 在每片玻片上加盖100μL的HNPP / Fast Red底物，盖玻片（24 x 50 mm）。在室温下用HNPP / Fast Red底物孵育载玻片30分钟。
- 仔细取出盖玻片，并在补充有0.05％Tween-20的1X TBS中洗涤载玻片三次5分钟。
- 使用100μLTSA底物/覆盖（24 x 50 mm 2 ）幻灯片。使用TSA底物孵育载玻片10分钟。
- 仔细取出盖玻片，并在补充有0.05％Tween-20的1x TBS中洗涤载玻片三次，持续5分钟。
- 将载玻片嵌入PBS /甘油（1：3）中。
注意：完成这些程序后，应尽快观察幻灯片，因为荧光信号会快速熄灭。
观察
- 显色检测
- 使用光学显微镜观察组织切片。选择10X，20X和40X物镜观察显色检测结果。
- 使用DP-BSW软件分析结果并捕获图像。
- TSA检测
- 使用共焦显微镜观察组织切片。应在543nm光下观察DIG标记的基因，呈现红色，生物素标记的基因应为在488nm光下观察，呈现绿色。当它们出现时，它们呈现黄色。
- 选择20X和40X物镜分别观察TSA检测结果。
- 使用FV1000软件分析结果并捕获图像。
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Representative Results
通过显色检测，每个成年天线部分的小部分触角细胞由DIG标记的LmigOR1和LmigOR2反义探针表示（ 图3 ）。连续切片上的RNA ISH定位LmigOR1和LmigOR2显示表达两个基因的触角细胞位于表达LmigORco的 ORN簇中，表明推定的LmigOR1和LmigOR2实际上在ORN中表达（ 图4a -4d ）。有时，标记的树状样结构可视化（ 图4e -4f ）。 LmigOR1和LmigOR2均位于基底细胞感觉器中的神经元（ 图5a-5b ），但它们在单个感觉体中不共表达，表明它们存在于不同的碱性敏感敏感亚型（ 图5c- 5d ）。
在TSA检测中，双色荧光原位杂交显示LmigOR1表达细胞（红色）位于表达LmigORco （绿色）的ORN簇，表明推测的LmigOR1在ORN中表达（ 图6a ）。 图6a中的盒装区域的近视图 如图6b所示。 LmigOR1表达神经元（绿色， 图7a ）和LmigOR2表达神经元（红色， 图7b ）位于不同的基底感觉神经元亚型（ 图7c ）。
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图1：RNA 原位杂交的昆虫天线切片的制备。 （ a ）冷冻切片机; （ bc ）将样品嵌入冷冻的OCT化合物中。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：RNA 原位杂交的 实验项目 。 （ a ）滑动架和塑料容器。 （ b ）湿箱。 （ c ）摇杆。 （ d ）膜过滤器。 （ e ）共焦显微镜。 .jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图3：嗅觉器官中LmigOR1和LmigOR2的细胞定位。 （ a ）蝗虫触角段中LmigOR1表达细胞的概述。 （ b ）蝗虫触角段中LmigOR2表达细胞的概述。箭头表示表达LmigOR1 （ a ）和LmigOR2 （ b ）的细胞。刻度棒=100μm（a和b）。数据来自Xu 等人 12 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：通过显色检测表达LmigOR的天体细胞的神经元识别。 （ ab ）蝗虫天线连续部分的LmigOR1 （ a ）和LmigORco （ b ）反义探针的标记模式。 （ cd ）蝗虫天线连续部分的Lmigorco （ c ）和LmigOR2 （ d ）反义探针的标记模式。 （ ef ）偶尔标记的树枝状结构（由红色箭头表示）的图示。刻度棒=50μm（ad）; 20μm（e和f）。数据来自Xu 等人 12 请点击此处查看此图的较大版本。 nt“fo：keep-together.within-page =”1“>
图5： LmigOR1和LmigOR2在位于基底神经敏感的ORN中表达。 （ ab ）Basiconic Sensillum容纳表达LmigOR1 （ a ）和LmigOR2 （ b ）的ORN 。 （ cd ）在连续切片（cd）上验证了触角ORN的不同子集中LmigOR1和LmigOR2的表达。箭头表示表达LmigOR1 （a，c）和LmigOR2 （b，d）的触角细胞。 Ba：basiconic sensillum。刻度棒=20μm（a和b）; 50μm（c和d）。数据来自Xu 等人 12 请点击此处查看此图的较大版本。
图6：TSA检测表达LmigOR1的天门细胞的神经元识别。 （ a ）在纵向天线部分进行双色原位杂交，以说明LmigOR1 （Red）和Lmigorco （Green）的表达。表达Lmigorco的细胞簇中LmigOR1表达细胞的定位证实了其神经认知 。 （ b ）关闭一个盒装区域的视图。用箭头表示偶尔标记的树状结构。圆形区域表示ORNs簇表达Lmigorco并且共享相同的感官 。刻度棒=50μm（a）; 20μm（b）。数据来自Xu 等人 12 请坐舔这里查看这个数字的较大版本。
图7： LmigOR1和LmigOR2位于不同的Basiconic Sensilla ORNs通过TSA检测。使用检测系统显现荧光信号，通过绿色荧光（ a ）表明LmigOR1标记的神经元和红色荧光（ b ）的LmigOR2阳性细胞在不同的基底感觉亚型（ c ）中表达。箭头表示表达LmigOR1和LmigOR2的天线细胞。刻度棒=20μm。数据来自Xu 等人 12 请点击这里查看这个数字的较大版本。
| 名称 | 序列 |
| Lmig OR1探针 | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2探针 | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco探测器 | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
表1：PCR引物的序列。
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Discussion
这是很难执行RNA ISH本地化或昆虫触角基因，因为的表达水平或基因除了ORCO，是非常低的和保存的组织学切片的昆虫触角是非常困难的。另外TSA检测也很棘手。为解决这些问题，应采取以下措施。天线选自具有薄且软的触角表皮的新蜕皮成虫蝗虫，其保持其在幻灯片上的形态。将冷冻样品切成12μm厚的切片。使用高灵敏度和特异性的生物素和DIG标记的探针。洗涤剂如Tween-20和Triton X-100用于在许多步骤中降低背景。在TSA检测中，相对于另一个低表达基因的高表达基因应用生物素-16-UTP进行标记。应尽快观察幻灯片，因为荧光信号会快速熄灭。
DIG- a第二生物素标记的探针具有较长的货架寿命的优点，更高的信噪比和更好的蜂窝分辨率高于放射性探针18,19。本文提出的方案具有优于整体原位杂交的优点。该方案很容易识别基因在细胞水平上的定位，但是不能容易地用于研究基因分布模式，其更容易在全原位杂交中进行。
为了鉴定OR基因，采用了两种方法。一个是连续切片中的显色检测，另一个是在一个部分中的荧光检测。 ORCO是共表达与特定的或作为ORN标记10，20，21。均位于表达LmigOR1或LmigOR2的细胞到LmigORco表达细胞的簇， 将其明确地验证为OR（ 图4和图6 ）。使用相同的方法，我们发现LmigOR1和LmigOR2在一个感官中不共表达。这两种方法的结果是肯定的。
该协议还成功地用于定位LmigORco，SgreORco，SgreIR8a和SgreIR25a在刺槐天线10，14。最近LmigOR3使用相同的方案15定位于L. migratoria中的毛状感觉神经元。该方案用于定位两种感觉神经膜蛋白 SgreSNMP1和SgreSNMP2在S. gregaria 16的天线中。因此，该方案可靠地定位蝗虫天线中的化学感应相关基因，不仅验证了这些基因候选基因，但也将这些基因定位在不同类型感觉器中的特定细胞。
总之，RNA ISH的这种高效的方案被具体描述为在昆虫天线中定位OR基因以及低水平表达的其他基因。
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Disclosures
作者没有披露或任何其他利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到国家自然科学基金资助项目（No.1472037）的支持。本文中提及的商品名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着推荐。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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