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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par ARN Published: July 13, 2017 doi: 10.3791/55924
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

Summary

Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ ARN détaillé et hautement efficace, en particulier pour les gènes de récepteur à l'odorant (OR) à faible niveau, ainsi que d'autres gènes, dans les antennes d'insectes utilisant des sondes marquées par de la digoxigénine (DIG) ou biotinées.

Abstract

Les insectes ont développé des systèmes sophistiqués d'accueil olfactif pour détecter les signaux chimiques exogènes. Ces signaux chimiques sont transduits par Olfactory Receptor Neurons (ORN) logés dans des structures capillaires, appelées chemosensilla, des antennes. Sur les membranes des ORN, on pense que les récepteurs à l'odorant (OR) sont impliqués dans le codage des odeurs. Ainsi, être capable d'identifier les gènes localisés dans les ORN est nécessaire pour reconnaître les gènes OU, et constitue une base fondamentale pour d'autres études fonctionnelles in situ . Les niveaux d'expression d'ARN d' OR spécifiques dans les antennes d'insectes sont très faibles et la conservation des tissus d'insectes pour l'histologie est difficile. Ainsi, il est difficile de localiser un OR à un type spécifique de sensilla en utilisant l'hybridation in situ de l' ARN. Dans cet article, un protocole d'hybridation in situ ARN détaillé et très efficace, en particulier pour les gènes OU à faible expression des insectes, est introduit. En outre, un OR spécifique Gène waS identifiés en effectuant des expériences d'hybridation in situ fluorescentes à double couleur en utilisant un gène de récepteur coextratifiant, Orco , comme marqueur.

Introduction

Les antennes à insectes, qui sont les organes chimiosensibles les plus importants, sont recouvertes de nombreuses structures capillaires - appelées sensilla - qui sont innervées par les neurones récepteurs olfactifs (ORN). Sur la membrane des ORN d'insectes, les récepteurs odorants (OR), un type de protéine contenant sept domaines transmembranaires, sont exprimés avec un corecepteur (ORco) pour former un hétérother qui fonctionne comme un canal ionique 1 , 2 , 3 odorant-gated. Différentes OR répondent à différentes combinaisons de composés chimiques 4 , 5 , 6 .

Les langoustes ( Locusta migratoria ) s'appuient principalement sur des indices olfactifs pour déclencher des comportements importants 7 . Les OR sont des facteurs clés pour la compréhension des mécanismes moléculaires olfactifs. Localiser un gène spécifique OR acridien au neurone d'unLe type sensillum morphologiquement spécifique par ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) est la première étape dans l'exploration de la fonction OR.

L'ARN ISH utilise une sonde d'ARN complémentaire marquée pour mesurer et localiser une séquence d'ARN spécifique dans une section de tissu, des cellules ou des montures entières in situ , fournissant des informations sur les processus physiologiques et la pathogenèse de la maladie. Les sondes d'ARN marquées à la digoxigénine (DIG-marquées) et à la biotine ont été largement utilisées dans l'hybridation d'ARN. L'étiquetage de l'ARN avec la digoxigénine-11-UTP ou la biotine-16-UTP peut être préparé par transcription in vitro avec des ARN polymérases SP6 et T7. Les sondes d'ARN marquées par DIG et biotine présentent les avantages suivants: non radioactifs; sûr; stable; très sensible; Très spécifique; Et facile à produire en utilisant la PCR et la transcription in vitro . Les sondes d'ARN marquées par des DIG et des biotines peuvent être détectées de manière chromogène et fluorescente. Les sondes d'ARN marquées par DIG peuvent être détectées avec de l'anti-digoxigénine AlkaliNe phosphatase (AP) - anticorps conjugués qui peuvent être visualisés soit avec des substrats chimioluminescents très sensibles, chlorure de nitroblue tétrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine (NBT / BCIP) en utilisant un microscope optique ou avec 2 -hydroxy-3-naphtoïque-2'-phénylanilide phosphate (HNPP) couplé au sel de chlorure de hemi-zinc de 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium (Fast Red) en utilisant un microscope confocal. Les sondes d'ARN marquées par la biotine peuvent être détectées avec des anticorps conjugués anti-biotine et streptavidine avec des peroxydases de pistax (HRP) qui peuvent être visualisés avec des fluorescéine-tyramides à l'aide d'un microscope confocal. Ainsi, une hybridation fluorescente in situ à deux couleurs peut être effectuée pour détecter deux gènes cibles dans une tranche en utilisant des sondes d'ARN marquées par DIG et biotine.

L'ARN ISH avec des sondes marquées par DIG et / ou biotine a été utilisé avec succès pour localiser des gènes liés à l'olfactif, tels que l' OR , le récepteur ionotropique, la protéine de liaison aux odeursEt la protéine membranaire des neurones sensoriels, dans les antennes d'insectes, mais sans s'y limiter, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria et la crique du désert Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Cependant, il existe deux défis importants lors de l'exécution de l'ARN ISH pour les OR d'insecte: (1) Les gènes OU (sauf ORco ) sont exprimés à des niveaux faibles et seulement dans quelques cellules, ce qui rend la détection du signal très difficile et (2) la préservation des tissus d'insectes pour L'histologie, de sorte que la morphologie est préservée et que le bruit de fond est faible, peut être difficile. Dans cet article, un protocole détaillé et efficace décrivant l'ARN ISH pour la localisation des gènes OU dans les insectesDes antennes sont présentées, y compris la détection chromogène et l'amplification du signal Tyramide (TSA).

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Protocol

NOTE: Pour limiter la dégradation de l'ARN, préparer des solutions en utilisant de l'eau distillée autoclavée humide (à 121 ° C pendant 60 min) et également des matériaux autoclave humides.

1. Préparation des sondes antisens et sentiques RNA ISH

  1. Amplification et purification des gènes cible
    1. Premièrement, produire un fragment bicaténaire de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) à partir du plasmide contenant l'ADNc complet de LmigOR1 avec une ADN polymerase Taq qui ajoute des adénines aux deux extrémités des fragments.
      1. Utiliser un volume de réaction final de 100 μL, contenant 50 μL de mélange réactionnel 2x, 4 μL chacun d'amorces sens et anti-sens ( Tableau 1 ), 1 μl de gabarit plasmidique et 41 μL d'H 2 O exempt de RNase. Utiliser la PCR suivante Protocole: 94 ° C pendant 5 minutes, suivi de 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min, Suivi de 72 ° C pendant 10 min.
      2. Répétez ces étapes pour produire le fragment double brin de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) et le fragment double brin de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Les amorces utilisées dans ces expériences sont présentées dans le tableau 1 .
      3. Exécuter des produits de PCR sur 1,2% de gels d'agarose dans un tampon 1x Tris-acétate-EDTA et visualiser l'utilisation de coloration au bromure d'éthidium.
    2. Extrayez ces produits de PCR en utilisant un kit d'extraction de gel.
      1. Après électrophorèse, ajouter des bandes d'ADN du gel et placer les tranches de gel dans un tube de 1,5 ml. Ensuite, ajouter 100 μl de tampon de liaison (Buffer PN) pour 0,1 g de tranche de gel. Vortex et incuber à 50 ° C jusqu'à ce que la tranche de gel soit complètement dissoute.
      2. Insérez une colonne d'adsorption CA2 dans le tube de collecte et ajoutez 500 μL de tampon de balance (Buffer BL). Cela améliore la capacité d'absorption et la stabilité de la membrane de la silice. CentriÀ 12 400 xg pendant 1 min.
      3. Transférer le mélange de gel dissous dans l'assemblage de la colonne d'adsorption et incuber à la température ambiante pendant 2 min. Ensuite, centrifuger les tubes à 12 400 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement et réinsérer la colonne d'adsorption dans le tube de collecte.
      4. Ajouter 600 μL de solution de lavage (éthanol ajouté, Buffer PW) deux fois. Centrifuger à 12 400 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement et réinsérer la colonne d'adsorption dans le tube de collecte.
      5. Videz le tube de collecte et recentrifiez l'assemblage de la colonne à 12 400 xg pendant 2 minutes pour permettre l'évaporation de tout éthanol résiduel.
      6. Transférer soigneusement la colonne d'adsorption à un tube de centrifugation propre de 1,5 mL. Sécher à l'air la pastille pendant 5 à 10 minutes et redissoudre l'ADN dans un volume approprié ( par exemple 30 μL) d'eau exempte de nuclease.
      7. Incuber à TA pendant 2 min. Centrifuger à 12 400 xg pendant 2 min. Rejeter la colonne d'adsorption et stocker l'ADN à 4 ° C ou -20 ° C.
  2. Construire les plasmides recombinants
    1. Individuellement ligaturer le fragment de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragment de LmigOR2 et 1251 pb fragment de LmigORco dans un vecteur de T qui contient des promoteurs de T7 ( en amont) et SP6 ( en aval) des ARN polymérases adjacentes à l'ADN inséré en utilisant l' ADN ligase T4. Préparer la réaction 10 μL suivante: 5 μL de tampon de ligature 2x, 1 μL de vecteur T, 3 μL (~ 100 ng) de l'ADN du gène inséré et 1 μL d'ADN ligase T4, et incuber O / N à 4 ° C.
    2. Ajouter 5 ul de chaque plasmide recombinant contenant le fragment de 387 pb de LmigOR1, fragment 1303 pb du fragment LmigOR2 et 1251 pb de LmigORco séparément dans 50 pl de cellules compétentes d' Escherichia coli DH5a dans des tubes stériles de 1,5 ml.
      1. Mélanger doucement et mettre les tubes dans de la glace pendant 30 min, puis les incuber pendant 90 s à 42° C. Transformez-les en glace pendant 3 min.
      2. Ajouter 450 μL de milieu liquide Luria-Bertani (LB) sans ampicilline à chaque tube et les incuber dans un agitateur à 150 tr / min pendant 1 h à 37 ° C pour restaurer le E. coli DH5α.
      3. Prendre une aliquote de 100 μL de chaque transformant et les utiliser pour inoculer des plaques de substrat solide LB contenant 50 μg / mL d'ampicilline, 24 μg / mL de ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) isopropylique et 40 μg / mL de 5-bromo-4 -chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal).
      4. Incuber ces plaques dans un incubateur constant à 37 ° C pendant 18 h. Écran des plasmides recombinants cibles en utilisant la méthode de criblage bleu-blanc. Séquencez les plasmides recombinants cibles en utilisant le séquençage de Sanger et identifiez les directions des insertions des trois OR.
  3. Sélectionnez les endonucléases de restriction pour linéariser les plasmides recombinants
    1. Utiliser des endonucléases de restriction tIl suffit non seulement de digérer dans le site de clonage multiple du vecteur, mais aussi de ne pas couper l'ADN de l'insert. Dans cette expérience, tous les 3 gènes sont insérés dans le vecteur T dans la direction correspondant à celle du vecteur.
    2. Utiliser l'endonucléase de restriction Nco I pour linéariser les plasmides recombinants contenant le fragment 387 pb de LmigOR1 , le fragment de LmigOR2 de 1,303 pb et le fragment de LmigORCO de 1,251 pb pour produire les sondes antisens. Utilisez l'endonucléase de restriction Sp e I pour produire les sondes sens.
      NOTE: Si la direction d'insertion correspond à celle du vecteur, un site de restriction unique à partir de la fin de T7 est sélectionné pour linéariser le plasmide recombinant et l'ARN polymérase SP6 est utilisée pour préparer la sonde antisens. Un site de restriction unique à partir de la fin de SP6 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant, et l'ARN polymérase T7 est utilisée pour préparer la sonde de détection. Sinon, si la direction de l'insertion ne correspond pas à tLa direction du vecteur, puis un site de restriction unique à partir de la fin de SP6 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant et l'ARN polymérase T7 est utilisée pour préparer la sonde antisens. Le site de restriction unique à partir de la fin de T7 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant, et l'ARN polymérase SP6 est utilisée pour préparer la sonde de détection.
  4. Purifier les plasmides recombinants linéarisés
    1. Digest 20 pg de chacun des trois plasmides recombinants contenant le fragment de 387 pb du fragment LmigOR1, 1303 pb de LmigOR2 et le fragment 1251 bp de LmigORco en utilisant la restriction Nco I endonucléase dans une réaction de 100 ul contenant 10 ul de 10 x tampon, 40 ul de plasmide de 0,5 pg / pl, 3 pl de Nco I et 47 ul de RNase h 2 O, suivie d'une incubation de 3 h à 37 ° C.
    2. De même, digérer 20 μg de chacun de ces trois plasmides recombinants, vousChantez l'endonucléase de restriction Spe I.
    3. Purifier ces plasmides digérés en utilisant un kit d'extraction de gel tel que décrit au 1.1.2. Déterminer les concentrations de ces plasmides recombinants linéarisés extraits par spectrophotométrie et ajuster à 0,5 μg / μL.
  5. Préparer des sondes antisens et sensorielles
    1. Utilisez le système de transcription de l'ARN T7 / SP6 pour générer des sondes antisens et sens. L'ARN polymérase SP6 est utilisée pour transcrire l'ARN bicaténaire pour les sondes antisens marquées par la DIG et la biotine pour ces trois gènes OR utilisant des plasmides recombinants linéarisés comme matrice in vitro . L'ARN polymérase T7 est utilisée pour produire des sondes sens. Effectuer la réaction dans un volume final de 20 μL, contenant 2 μL de mélange 10 fois NTP, 2 μL de 10X tampon de transcription, 1 μl d'inhibiteur de RNase, 2 μl d'ARN polymérase T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmide linéarisé et 9 μL de H 2 O exempt de RNase, suiviPar incubation de 3 h à 37 ° C.
    2. Incuber les sondes antisens et senseuses marquées par DIG et biotine pendant 30 minutes avec 1 μL d'ADNase à 37 ° C. Ajouter 2,5 μL de LiCl 5 M et 75 μL d'éthanol absolu, puis incuber les réactions pendant 30 min à -70 ° C.
    3. Centrifuger à 15 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Découper soigneusement le surnageant. Ajouter 150 μL d'éthanol à 70% pour laver le précipitant. Préparer l'éthanol à 70% (1 L) en ajoutant de l'éthanol à 95% (736,8 mL) à de l'eau distillée stérile (263,2 ml).
    4. Centrifuger à 15 000 xg pendant 30 min à 4 ° C à nouveau et sécher à l'air libre la pastille pendant 5 à 10 minutes à la température ambiante. Ajouter 25 μL d'H 2 O exempt de RNase pour dissoudre les sondes antisens et sens de l'ARN.
    5. Si la longueur du gène inséré est supérieure à 1 kb, par la suite, fragmenter les sondes antisens et sondes ARN à une longueur moyenne de ~ 300 pb par incubation dans des solutions tampons bicarbonate-carbonate. Effectuer la réaction dans un volume final de 50 μL, contenant 25 ul de la sonde d'ARN et 25 ul de 60 ° C à la solution de tampon bicarbonate-carbonate de (80 mM de NaHCO 3, 120 mM de Na 2 CO 3, de pH 10,2). Le temps d'hydrolyse requis est donné par une formule 17 précédemment publiée.
    6. Ajouter 5 μL d'acide acétique à 10% pour arrêter la réaction. Dans cette expérience, fragmenter les sondes antisens et sens LmigOR2 et LmigORco pendant 24 et 23 minutes, respectivement.
      T = (L o -L f ) / kXL o XL f
      L o = longueur initiale des fragments en kb
      L f = la longueur finale des fragments en kb
      K = la constante de vitesse pour l'hydrolyse, environ 0,11 kb -1 min -1
      T = temps d'hydrolyse en min
    7. Enfin, ajouter 250 μl de tampon d'hybridation et stocker à -80 ° C.

2. Préparation des sections de cryostat

  1. Precool le freeziNg microtome à -24 ° C.
  2. Sélectionnez de nouveaux criquets mous adultes qui sont actifs et ont des antennes intactes. Couper les antennes en morceaux de 2-3 mm à l'aide de rasoirs stériles.
  3. Mettre le composé OCT sur un support de microtome à congélation et mettre un ou deux échantillons sur le composé à l'horizontale. Ensuite, transférez le support dans le microtome de congélation à -24 ° C pour équilibrer jusqu'à ce que le composé gèle. Retirez le support et recouvrez les échantillons avec un petit composé. Transférer le support dans le microtome de congélation à -24 ° C à nouveau pendant au moins 10 min ( Figure 1 ).
    REMARQUE: Évitez d'obtenir des bulles dans le composé.
  4. Fixez le support avec les échantillons dans le microtome de congélation, puis sectionnez les échantillons congelés dans des tranches de 12 μm d'épaisseur à -24 ° C.
  5. Décongeler les tranches une à une sur les diapositives (25 x 75 mm, sans nuclease) et sécher à l'air pendant 10 min.

3. Fixation des sections

  1. Après la préparation du cryostat, Mettez les diapositives dans un récipient en plastique (~ 100 x 40 x 80 mm) et réparez les tissus en incubant les diapositives dans une solution de paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 30 minutes à 4 ° C.
  2. Laver les diapositives dans une solution salée tamponnée au phosphate 1X (PBS) pendant 1 min.
  3. Pour éliminer les protéines alcalines, transférez les diapositives à 0,2 M HCl pendant 10 min.
  4. Pour éliminer la protéine de surface de l'acide nucléique, transférez les diapositives à 1XPBS avec 1% de Triton X-100 pendant 2 min.
  5. Lavez les diapositives deux fois pendant 30 s en 1x PBS.
  6. Enfin, rincer les lames dans la solution de formamide pendant 10 min à 4 ° C.

4. Hybridation

  1. Préparer les sondes antisens et sens
    1. Utilisez un tampon d'hybridation pour diluer des sondes antisens ou sens dans l'ARN dans les tubes sans nuclease de 1,5 ml. Dans cette expérience, pour toutes les sondes antisens et sens ( LmigOR1, LmigOR2 et LmigOrco ), ajouter 1 μL de sonde à 99 μL tampon d'hybridation par diapositive. D'une manière générale, l'utilisation de dilutions 1: 100 de sondes antisens produit des signaux positifs significatifs et de faibles antécédents utilisant ce protocole.
    2. Pour la détection chromogène, diluer individuellement les sondes marquées par DIG.
    3. Pour la détection TSA, diluer LmigOR1 marqué au DIG avec des sondes LmigOrco marquées par la biotine ou LmigOR2 marqué au DIG avec des sondes LmigOR1 marquées par la biotine ensemble dans le tampon d'hybridation.
    4. Chauffer les dilutions pendant 10 min à 65 ° C et les mettre sur de la glace pendant au moins 5 min.
  2. Hybridation
    1. Vidangez les glissières et ajoutez 100 μL de sondes antisens diluées et sens (étape 4.1) aux sections de tissu. Ensuite, placez les lamelles (24 mm x 50 mm, sans nuclease) sur les sections de tissu.
    2. Placez les diapositives couvertes horizontalement dans une boîte humide (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figure 2 ) et incupez uneT 55 ° C pendant 22 h. Ajouter la solution de formamide ou 1X PBS au fond de la boîte pour garder l'environnement humide, mais ne pas immerger les glissières dans le liquide.
  3. Lavage et blocage.
    1. Après l'hybridation, retirez soigneusement les lamelles. Laver les diapositives deux fois pendant 30 min dans une citrate de sodium salée (SSC) 0,1x à 60 ° C.
      REMARQUE: le lavage permet de placer les glissières dans un porte-coulisseau qui est ensuite placé dans un récipient en plastique et agité doucement sur une bascule (~ 50 tours par minute, figure 2 ).
    2. Rincer les glissières dans une solution salée tamponnée à tris (TBS) pendant 30 s.
    3. Ajouter 1 mL de réactif bloquant à 1% dans du TBS additionné de Triton X-100 à 0,03% sur chaque diapositive et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, jetez la solution de blocage.
  4. Immunohistochimie.
    1. Pour la détection chromogène, utiliser un réactif de blocage dans le TBS pour diluer 750 unités (U) / mL Anti-digoxigenine AP-anti-anti-conjugaisonDy à 1,5 U / mL AP solution. Ajouter 100 μL de solution AP par coulisseau couvert (24 mm x 50 mm).
    2. Pour la détection TSA, utiliser un réactif de blocage dans le TBS pour diluer 750 U / mL d'anticorps conjugués anti-digoxigénine AP et anticorps conjugué anti-biotine streptavidine HRP à la solution AP / HRP. Ajouter 100 μL de solution AP / HRP par diaphragme couvert (24 mm x 50 mm).
    3. Incuber les glissières dans une boîte humide ( Figure 2 ) pendant 60 min à 37 ° C. Utilisez la solution de formamide ou 1X PBS pour garder la boîte humide mais pas détrempée.

5. Coloration

  1. Retirez les lamelles avec précaution. Laver les diapositives trois fois pendant 5 min dans 1x TBS additionné de 0,05% de Tween-20. Rincer les glissières dans du tampon DAP (détection chromogène: pH 9,5, détection TSA: pH 8,0) pendant 5 min.
  2. Coloration (détection chromogène)
    1. Ajouter 100 μL de solution de substrat NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluée dans DAP;PH 9,5) à chaque diapositive. Placez soigneusement des lamelles (24 x 50 mm) sur les glissières.
    2. Incuber les diapositives dans une boîte humide avec une solution de substrat pendant 10 min - O / N à 37 ° C.
      REMARQUE: Vérifiez le développement en regardant les diapositives de temps en temps sous le microscope.
    3. Lorsque le développement est prêt, arrête la réaction en transférant les diapositives dans l'eau.
  3. Coloration (détection TSA)
    1. Utilisez une seringue pour déplacer le substrat HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) à partir du filtre de la seringue (0,22 μm, Figure 2 ).
    2. Ajouter 100 μL de HNPP / Fast Red substrat par glissière recouvert d'une lamelle (24 x 50 mm). Incuber les diapositives pendant 30 min avec HNPP / Fast Red substrat à la RT.
    3. Retirez les lamelles avec soin et lavez les diapositives trois fois pendant 5 minutes dans 1X TBS additionné de 0,05% de Tween-20.
    4. Utiliser 100 μL de substrat TSA / recouvert (24 x 50 mm 2 ) glisser. Incuber les glissières avec un substrat TSA pendant 10 min à la RT.
    5. Retirez les lamelles avec soin et lavez les diapositives trois fois pendant 5 min dans 1x TBS additionné de 0,05% de Tween-20.
  4. Incorporer les glissières dans du PBS / glycerol (1: 3).
    REMARQUE: après avoir terminé ces procédures, les diapositives doivent être observées dès que possible parce que le signal fluorescent s'arrête rapidement.

6. Observation

  1. Détection chromogène
    1. Observez les sections de tissu à l'aide d'un microscope optique. Choisissez les lentilles d'objectif 10X, 20X et 40X pour observer les résultats de la détection chromogène.
    2. Utilisez le logiciel DP-BSW pour analyser les résultats et capturer les images.
  2. Détection TSA
    1. Observer les coupes de tissus à l'aide d'un microscope confocal. Les gènes marqués par DIG doivent être observés sous une lumière de 543 nm, présentant une couleur rouge, et les gènes marqués par la biotine devraient êtreObservé sous une lumière de 488 nm, présentant une couleur verte. Quand ils émergent, ils présentent une couleur jaune.
    2. Choisissez les lentilles d'objectif 20X et 40X pour observer les résultats de la détection TSA, respectivement.
    3. Utilisez le logiciel FV1000 pour analyser les résultats et capturer les images.

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Representative Results

Avec une détection chromogène, un petit sous-ensemble des cellules antenales dans chaque section antenale adulte a été désigné par les sondes antisens LmigOR1 et LmigOR2 marquées par DIG ( Figure 3 ). RNA ISH sur des sections consécutives pour localiser LmigOR1 et LmigOR2 a montré que les cellules antenales exprimant les deux gènes étaient situées dans des grappes d'ORN exprimant LmigORco , ce qui indique que les LmigOR1 putatifs et LmigOR2 étaient réellement exprimés dans les ORN ( Figure 4a -4d ). Parfois, les structures dendritiques marquées comme étiquettes ont été visualisées ( Figure 4e -4f ). LmigOR1 et LmigOR2 étaient tous deux localisés dans les neurones dans la sensilla basique ( Figure 5a-5b ), mais ils n'étaient pas co-exprimés dans la sensilla individuelle, indiquant qu'ils étaient présents dans différents basico Nic sensillium sous-types ( figure 5c-5 d ).

Dans la détection TSA, l'hybridation fluorescente in situ à double couleur a montré que les cellules exprimant LmigOR1 (couleur rouge) étaient situées dans des grappes ORN exprimant LmigORco (couleur verte), ce qui indique que le LmigOR1 putatif était exprimé dans les ORN ( Figure 6a ). Une vue rapprochée des zones en caisse de la figure 6a est illustrée à la figure 6b . LmigOR1 - neurones exprimant (couleur verte, figure 7a ) et neurone d' expression LmigOR2 (couleur rouge, figure 7b ) ont été localisés à différents sous-types de sensricus basiques ( Figure 7c ).

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Figure 1: Préparation des sections ancrées des insectes pour l'hybridation in situ ARN. (A) Le microtome de congélation; ( Bc ) Les échantillons sont incorporés dans la congélation du composé OCT. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: éléments expérimentaux pour l' hybridation in situ ARN . (A) Le support de diapositives et le récipient en plastique. ( B ) La boîte humide. ( C ) Le rocker. ( D ) Le filtre à membrane. ( E ) Microscope confocal. .jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: Localisation cellulaire de LmigOR1 et LmigOR2 dans les organes olfactifs. (A) Vue d'ensemble de cellules exprimant LmigOR1 dans un segment antennaire criquet. ( B ) Vue d'ensemble des cellules exprimant LmigOR2 dans un segment d' antenne acridienne. Les pointes de flèche indiquent les cellules exprimant LmigOR1 ( a ) et LmigOR2 ( b ). Barres d'échelle = 100 μm (a et b). Les figures ont été adaptées de Xu et al. 12 Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4: Identité neuronale des cellules anténiques exprimant les LmigOR par des détections chromogènes. ( Ab ) Le motif d'étiquetage de LmigOR1 ( a ) et LmigORco ( b ) sondes antisens sur des sections consécutives d'antenne acridienne. ( Cd ) Le motif d'étiquetage de la sonde antisens LmigORco ( c ) et LmigOR2 ( d ) sur les sections consécutives de l'antenne acridienne. ( Ef ) Illustration de structures dendritiques semblables à des étiquettes (indiquées par des flèches rouges). Barres d'échelle = 50 μm (ad); 20 μm (e et f). Les figures ont été adaptées de Xu et al. 12 Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 5
Figure 5: LmigOR1 et LmigOR2 sont exprimés dans les ORN hébergés dans Basiconic Sensilla. ( Ab ) Sensonum Basiconic contenait des ORN exprimant LmigOR1 ( a ) et LmigOR2 ( b ). ( Cd ) L'expression de LmigOR1 et LmigOR2 dans un sous-ensemble distinct d'ORN antenaux a été vérifiée sur des sections consécutives (CD). Les têtes de flèche indiquent les cellules antenales exprimant LmigOR1 (a, c) et LmigOR2 (b, d). Ba: sensonic basique. Barres d'échelle = 20 μm (a et b); 50 μm (c et d). Les figures ont été adaptées de Xu et al. 12 Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


Figure 6: Identité neuronale de la cellule antenale exprimant LmigOR1 par les détections TSA. (A) deux couleurs hybridation in situ a été réalisée sur la section longitudinale antennaire pour illustrer l'expression de LmigOR1 (rouge) et LmigORco (vert). La localisation des cellules exprimant LmigOR1 dans des clusters de cellules exprimant LmigORco a confirmé son identité neurale. ( B ) Vue rapprochée des zones encadrées dans un. Des structures dendritiques assimilées à d'autres étiquettes ont été indiquées par la flèche. Les zones périphériques indiquent que les ORN regroupent LmigORco et partagent le même sensillum. Barres d'échelle = 50 μm (a); 20 μm (b). Les figures ont été adaptées de Xu et al. 12 S'il te plait CLèche ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7: LmigOR1 et LmigOR2 étaient localisés à différents ORN Basiconic Sensilla par détection TSA. Les signaux fluorescents ont été visualisées en utilisant des systèmes de détection, ce qui indique LmigOR1 marqué à des neurones par fluorescence verte (a) et LmigOR2 cellules positives en fluorescence rouge (b) ont été exprimées dans différents sous - types de sensilles basiconiques (c). Les têtes de flèche indiquent les cellules antenales exprimant LmigOR1 et LmigOR2 . Barres d'échelle = 20 μm. Les figures ont été adaptées de Xu et al. 12 Cliquez ici pour voir unPlus grande de cette figure.

prénom Séquences
Lmig OR1-probe-s 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 '
Lmig OR1-probe-as 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 '
Lmig OR2-probe-s 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 '
Lmig OR2-probe-as 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 '
Lmig Orco-probe-s 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 '
Lmig Orco-probe-as 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 '

Tableau 1: Les séquences des amorces PCR.

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Discussion

Il est difficile d'effectuer l'ARN ISH pour localiser les gènes OU dans les antennes d'insectes car les niveaux d'expression des gènes OR, à l'exception de l' ORco , sont très faibles et la conservation des tranches histologiques d'antennes d'insectes est très difficile. En outre, la détection TSA est également très délicate. Pour résoudre ces problèmes, les mesures suivantes devraient être prises. Les antennes sont sélectionnées à partir de criquets adultes nouvellement moustaches qui ont des cuticules antennes minces et douces, qui maintiennent leur morphologie sur la glissière. Les échantillons congelés sont sectionnés dans des tranches de 12 μm d'épaisseur. Des sondes hautement sensibles et spécifiques à la biotine et au DIG sont utilisées. Les détergents, tels que Tween-20 et Triton X-100, sont utilisés pour diminuer l'arrière-plan en plusieurs étapes. Dans la détection TSA, un gène très exprimé, par rapport à un autre gène humilien, devrait être étiqueté avec la biotine-16-UTP. Les diapositives doivent être observées dès que possible parce que les signaux fluorescents s'arrêteront rapidement.

DIG- aLes sondes marquées par biotine présentent les avantages d'une durée de conservation plus longue, des rapports signal / bruit plus élevés et de meilleures résolutions cellulaires que les sondes radioactives 18 , 19 . Le protocole présenté dans cet article présente des avantages par rapport à l' hybridation in situ intégrée. Ce protocole identifie facilement les localisations des gènes au niveau cellulaire mais ne peut pas être utilisé facilement pour étudier les schémas de distribution des gènes, ce qui est plus facilement réalisé avec l'hybridation in situ intégrée.

Pour identifier un gène OR, deux approches ont été prises. L'une était la détection chromogène dans les sections consécutives, et l'autre était la détection fluorescente dans une section. ORco est co-exprimé avec un OR spécifique en tant que marqueur ORN 10 , 20 , 21 . Les cellules exprimant LmigOR1 ou LmigOR2 étaient toutes deux situéesÀ des grappes de cellules exprimant LmigORco qui les ont vérifiées de manière non équivoque comme des OR ( Figure 4 et Figure 6 ). En utilisant les mêmes approches, nous avons constaté que LmigOR1 et LmigOR2 ne sont pas co-exprimés dans un sensillum. Les résultats de ces deux approches sont corroborants.

Ce protocole a également été utilisé avec succès pour localiser LmigORco, SgreORco, SgreIR8a et SgreIR25a dans les antennes acridiennes 10 , 14 . Récemment, LmigOR3 a été localisé dans les neurones de sensilla trichoïde dans L. migratoria en utilisant le même protocole 15 . Ce protocole a été utilisé pour localiser deux protéines sensorielles de la membrane neurale SgreSNMP1 et SgreSNMP2 dans les antennes de S. Gregaria 16 . Ainsi, ce protocole a localisé de manière fiable des gènes liés à la chimiosensibilité dans les antennes acridiennes, qui non seulement ont vérifié cesCandidats, mais aussi localisé ces gènes à des cellules spécifiques logées dans différents types de sensillas.

En conclusion, ce protocole hautement efficace d'ARN ISH est spécifiquement décrit pour localiser les gènes OU, ainsi que d'autres gènes exprimés à des niveaux faibles, dans les antennes d'insectes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer ni aucun autre conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par une subvention de la National Natural Science Foundation of China (No.31472037). La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cet article est uniquement destinée à fournir des informations spécifiques et n'implique pas une recommandation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix TSINGKE, China TSE004
RNase-free H2O TIANGEN, China RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10 BIOWEST, SPAIN 91622
Binding buffer TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
Balance buffer TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
Wash solution TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
T Vector Promega, USA A362A
T4 DNA Ligase Promega, USA M180A
Escherichia coli DH5α TIANGEN, China CB101
Ampicillin Sigma, USA A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Inalco, USA 1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside SBS Genetech, China GX1-500
Nco I BioLabs, New England R0193S
Spe I BioLabs, New England R0133M
DIG RNA Labeling Kit Roche, Switzerland 11175025910
Biotin RNA Labeling Kit Roche, Switzerland 11685597910
DNase DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland 11175025910
LiCl Sinopharm, China 10012718
Ethanol Sinopharm, China 10009257
Acetic acid BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China 10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands 4583
Slides TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China FISH0010
HCl Sinopharm, China 80070591
Millex Millipore, USA SLGP033RS
Tween 20 AMRESCO, USA 0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt Roche, Switzerland 11175041910
Glycerol Sinopharm, China 10010618
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA Sigma, USA V900483-1KG 0.04 mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China 10000292 0.12% acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA Sigma, USA 03677 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium Sinopharm, China 10019392 10 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium MERCK, Germany VM335231 10 g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium MERCK, Germany VM361526 5 g/L Yeast extract
LB solid substrate plate Sinopharm, China 10019392 10 g/L NaCl
LB solid substrate plate MERCK, Germany VM335231 10 g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate MERCK, Germany VM361526 5 g/L Yeast extract
LB solid substrate plate WISENT ING, Canada 800-010-CG 15 g/L Agar Bacteriological Grade
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sinopharm, China 10019392 8.5% NaCl
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sigma, USA V900041-500G 14 mM KH2PO4
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sigma, USA V900268-500G 80 mM Na2HPO4
10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) Sigma, USA V900483-1KG 1 M Tris-Base
10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) Sinopharm, China 10019392 1.5 M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sigma, USA V900483-1KG 100 mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sinopharm, China 10019392 100 mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sigma, USA V900020-500G 50 mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH 7.0) Sinopharm, China 10019392 3 M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH 7.0) Sigma, USA V900095-500G 0.3 M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) Sigma, USA V900894-100G 4% paraformaldehyde
Sodium Carbonate Buffer Sigma, USA V900182-500G 0.1 M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) Sigma, USA V900182-500G 80 mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) Sigma, USA S7795-500G 120 mM Na2CO3
Formamide Solution (pH 10.2) MPBIO, USA FORMD002 50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH 10.2) 5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in TBS Roche, Switzerland 11175041910 1% Blot
Blocking Buffer in TBS AMRESCO, USA 0694-500ML 0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in TBS 1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution Roche, Switzerland 11175041910 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution Blocking Buffer in TBS
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution Roche, Switzerland 11175041910 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution Blocking Buffer in TBS
Hybridization Buffer MPBIO, USA FORMD002 50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer 2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer Sigma, USA D8906-50G 10% dextran sulphate
Hybridization Buffer invitrogen, USA AM7119 20 µg/mL yeast t-RNA
Hybridization Buffer Sigma, USA D3159-10G 0.2 mg/mL herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Roche, Switzerland 11758888001 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Roche, Switzerland 11758888001 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT 2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT Amplification Diluent
Name Company Catalog Number Comments
Instrument
Freezing microtome Leica, Nussloch, Germany Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer Thermo SCIENTIFIC, USA NANODROP 2000
Optical microscope Olympus, Tokyo, Japan Olympus IX71microscope
Confocal microscope Olympus, Tokyo, Japan Olympus BX45 confocal microscope

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References

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Neuroscience Numéro 125 récepteur odorant ARN neurone sensillum antennes d'insectes
Localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par ARN<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation
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Xu, X., You, Y., Zhang, L.… More

Xu, X., You, Y., Zhang, L. Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (125), e55924, doi:10.3791/55924 (2017).

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