Summary
Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina.
Abstract
Os insetos evoluíram sofisticados sistemas de recepção olfativa para detectar sinais químicos exógenos. Esses sinais químicos são transduzidos por neurônios receptores olfatórios (ORNs) alojados em estruturas parecidas com o cabelo, chamados de quimiosensila, das antenas. Nas membranas dos ORN, pensa-se que os receptores de odorantes (RUP) estão envolvidos na codificação de odor. Assim, ser capaz de identificar genes localizados nas ORNs é necessário reconhecer genes OR e fornece uma base fundamental para novos estudos funcionais in situ . Os níveis de expressão de RNA de OR específicos em antenas de insetos são muito baixos e a preservação do tecido de insetos para a histologia é desafiadora. Assim, é difícil localizar um OR para um tipo específico de sensilla usando hibridização in situ RNA. Neste artigo, é introduzido um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes OR de insetos pequenos. Além disso, um OR específico Gene waS identificado pela realização de experiências de hibridação in situ fluorescentes de duas cores utilizando um gene de receptor coexpressivo , Orco , como marcador.
Introduction
As antenas de insetos, que são os órgãos quimiossensores mais importantes, são cobertas com muitas estruturas parecidas com o cabelo - chamadas sensilla - que são inervadas pelos neurônios receptores olfatórios (ORNs). Na membrana de ORN de insetos, os receptores de odorantes (OR), um tipo de proteína contendo sete domínios transmembranares, são expressos com um coreceptor (ORco) para formar um heterômero que funciona como um canal iónico 1 , 2 , 3 odorante. OUs diferentes respondem a diferentes combinações de compostos químicos 4 , 5 , 6 .
Os gafanhotos ( Locusta migratoria ) dependem principalmente de pistas olfativas para desencadear comportamentos importantes 7 . As ERs do Locustão são fatores-chave para a compreensão dos mecanismos olfativos moleculares. Localizando um gene OR específico para o neurônio de umO tipo de sensibilidade morfológicamente específico por ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) é o primeiro passo na exploração da função OR.
RNA ISH usa uma sonda de ARN complementar marcada para medir e localizar uma sequência de ARN específica em uma seção de tecido, células ou montagens inteiras in situ , fornecendo informações sobre processos fisiológicos e patogênese da doença. As sondas de ARN marcadas com marcadores de digoxigenina (marcados com DIG) e de biotina foram amplamente utilizadas na hibridação de ARN. A marcação de ARN com digoxigenina-11-UTP ou biotina-16-UTP pode ser preparada por transcrição in vitro com polimerases de ARN de SP6 e T7. As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina possuem as seguintes vantagens: não radioativas; seguro; estável; altamente sensível; Altamente específico; E fácil de produzir usando PCR e transcrição in vitro . As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina podem ser detectadas cromogenicamente e fluorescentemente. As sondas de ARN marcadas com DIG podem ser detectadas com Alkali anti-digoxigeninaAnticorpos conjugados com fosfatase (AP) que podem ser visualizados quer com os substratos quimioluminescentes altamente sensíveis cloreto de tetrazólio nitroblue / sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizando um microscópio óptico ou com 2 -hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato (HNPP) acoplado com sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazónio (Fast Red) utilizando um microscópio confocal. As sondas de ARN marcadas com biotina podem ser detectadas com anticorpos conjugados anti-biotina com estreptavidina de rabo cavalo (HRP) que podem ser visualizados com fluoresceína-tiramides usando um microscópio confocal. Assim, a hibridação fluorescente in situ de duas cores pode ser realizada para detectar dois genes alvo em uma fatia usando sondas de RNA marcadas com DIG e biotina.
O RNA ISH com sondas marcadas com DIG e / ou biotina foi utilizado com sucesso para localizar genes relacionados ao olfato, tais como OR , receptor ionotrópico, proteína de ligação aos odorantesE proteína da membrana neuronal sensorial, em antenas de insetos de, entre outras, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e gafanhoto do deserto, Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . No entanto, existem dois desafios substanciais ao executar RNA ISH para insetos OR: (1) OU genes (exceto ORco ) são expressos em níveis baixos e somente em algumas células, tornando a detecção de sinal muito difícil e (2) preservando o tecido de insetos para Histologia, de modo que a morfologia seja preservada e o ruído de fundo seja baixo, pode ser desafiador. Neste artigo, um protocolo detalhado e eficaz descrevendo RNA ISH para localizar genes OR em insetosAntenas são apresentadas, incluindo a detecção cromogênica e de ampliação de sinal de Tyramide (TSA).
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Protocol
NOTA: Para limitar a degradação de ARN, prepare soluções usando água destilada em autoclave em húmido (a 121 ° C por 60 min) e também materiais em autoclave em molhado.
1. Preparação de RNA ISH Sondas anti-sentido e sentido
- Objetivo amplificação e purificação de genes
- Primeiro, produza um fragmento de cadeia dupla de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) a partir do plasmídeo contendo o cDNA completo de LmigOR1 com uma Taq DNA Polymerase que adiciona adeninas a ambas as extremidades dos fragmentos.
- Usar um 100 uL de volume de reacção final, contendo 50? L de mistura de reacção 2x, 4 uL de cada sentido e anti-iniciadores (Tabela 1), 1? L de molde do plasmídeo e 41 uL de RNase H 2 O. A utilização do seguinte PCR Protocolo: 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min.
- Repita estes passos para produzir o fragmento de cadeia dupla de LMigOR2 (GenBank: JQ766966) de 1.303 pb e 1.000 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Os iniciadores utilizados nestas experiências são apresentados na Tabela 1 .
- Execute produtos de PCR em géis de agarose a 1,2% em 1x tampão Tris-acetato-EDTA e visualize usando coloração com brometo de etidio.
- Extraia esses produtos de PCR usando um kit de extração de gel.
- Após a eletroforese, adicione as faixas de DNA do gel e coloque as fatias de gel em um tubo de 1,5 mL. Em seguida, adicione 100 μL de tampão de ligação (Buffer PN) por 0,1 g de fatia de gel. Vortex e incubar a 50 ° C até a fatia de gelar completamente dissolvida.
- Insira uma coluna de adsorção CA2 no tubo de coleta e adicione 500 μL de buffer de equilíbrio (Buffer BL). Isso melhora a capacidade de absorção e a estabilidade da membrana de sílica. CentriFugir em 12.400 xg por 1 min.
- Transferir a mistura de gel dissolvido para o conjunto da coluna de adsorção e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.400 xg durante 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta.
- Adicione 600 μL de solução de lavagem (etanol adicionado, Buffer PW) duas vezes. Centrifugar a 12.400 xg por 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta.
- Esvazie o tubo de recolha e recentrifique o conjunto da coluna em 12.400 xg durante 2 minutos para permitir a evaporação de qualquer etanol residual.
- Transfira cuidadosamente a coluna de adsorção para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Secar ao ar a pastilha por 5-10 min e redissolver o DNA num volume adequado ( por exemplo, 30 μL) de água isenta de nuclease.
- Incubar à TA por 2 min. Centrifugar a 12.400 xg por 2 min. Descarte a coluna de adsorção e armazene o DNA a 4 ° C ou -20 ° C.
- Primeiro, produza um fragmento de cadeia dupla de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) a partir do plasmídeo contendo o cDNA completo de LmigOR1 com uma Taq DNA Polymerase que adiciona adeninas a ambas as extremidades dos fragmentos.
- Construa os plasmídeos recombinantes
- Ligar individualmente o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1,303 pb de LmigOR2 e 1,251 pb de LmigORco em um vetor T que contém promotores para as polimerases de ARN T7 (a montante) e SP6 (a jusante) adjacentes ao DNA inserido usando T4 DNA ligase. Prepare a seguinte reação de 10 μL: 5 μL de tampão de ligação 2x, 1 μL de vetor T, 3 μL (~ 100 ng) do DNA do gene inserido e 1 μL de ADN ligase T4 e incuba O / N a 4 ° C.
- Adicionar 5 uL de cada plasmídeo recombinante contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 pb fragmento de LmigOR2 e 1251 pb fragmento de LmigORco separadamente em 50 uL de células de Escherichia coli DH5a competentes em tubos de 1,5 mL esteis.
- Misture suavemente e coloque os tubos em gelo durante 30 min e depois incubri-los durante 90 s a 42ºC.° C. Transfira-os de volta ao gelo por 3 min.
- Adicione 450 μL de meio líquido Luria-Bertani (LB) sem ampicilina a cada tubo e incuba-os em um agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar o E. coli DH5a.
- Pegue uma alíquota de 100 μL de cada transformante e use-os para inocular placas de substrato sólido LB contendo 50 μg / mL de ampicilina, 24 μg / mL de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 40 μg / mL de 5-bromo-4 -cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido (X-gal).
- Incubar estas placas em uma incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Tira os plasmídeos recombinantes alvo usando o método de triagem azul-branco. Seqüencie os plasmídeos recombinantes alvo usando a seqüência de Sanger e identifique as direções de inserção dos genes OR.
- Selecione endonucleases de restrição para linearizar plasmídeos recombinantes
- Usar endonucleases de restrição tNão apenas digerir no site de clonagem múltipla do vetor, mas também não cortar o DNA da inserção. Nesta experiência, todos os 3 genes são inseridos no vetor T na direção correspondente à do vetor.
- Utilize a endonuclease de restrição Nco I para linearizar os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30mm de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco para produzir as sondas anti-sentido. Use a endonuclease de restrição Sp e I para produzir as sondas sensoriais.
NOTA: Se a direção da inserção corresponde à do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a ARN polimerização de SP6 é usada para preparar a sonda anti-sentido. Um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda de detecção. Caso contrário, se a direção da inserção não corresponder a tA direção do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda anti-sentido. O site de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a ARN polimerização SP6 é usada para preparar a sonda de detecção.
- Purificando os plasmídeos recombinantes linearizados
- Digerir 20 μg de cada um dos três plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30ig de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco usando a endonuclease de restrição de Nco I em uma reação de 100 μL que contém 10 μL de tampão 10x, 40 μL de 0,5 ug de plasmídeo / L, 3 mL de Nco I e 47 uL de RNase H 2 O, seguido por uma incubação de 3 h a 37 ° C.
- Da mesma forma, digerir 20 μg de cada um desses três plasmídeos recombinantes vocêCante a endonuclease de restrição Spe I.
- Purifique estes plasmídeos digeridos usando um kit de extração de gel como descrito em 1.1.2. Determine as concentrações destes plasmídeos recombinantes linearizados extraídos por espectrofotometria e ajuste para 0,5 μg / μL.
- Prepare sondas anti-sentido e sensoriais
- Use o sistema de transcrição de ARN T7 / SP6 para gerar sondas anti-sentido e sensoriais. A polimerase de ARN de SP6 é usada para transcrever ARN de cadeia dupla para sondas anti-sentido marcadas com DIG e biotina para esses três genes OR usando plasmídeos recombinantes linearizados como modelos in vitro . A polimerase de ARN T7 é utilizada para produzir sondas sensoriais. Realize a reação em um volume final de 20 μL, contendo 2 μL de mistura de NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição 10X, 1 μL de inibidor de RNase, 2 μL de ARN polimerização T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmídeo linearizado e 9 ul de ARNase isento de H 2 O, seguidoPor uma incubação de 3 h a 37 ° C.
- Incubar as sondas de detecção anti-sentido marcadas com DIG e biotina durante 30 min com 1 μL de DNase a 37 ° C. Adicionar 2,5 μL de LiCl 5 M e 75 μL de etanol absoluto, depois incubar as reações durante 30 min a -70 ° C.
- Centrifugar a 15,000 xg durante 30 min a 4 ° C. Decanta com cuidado o sobrenadante. Adicione 150 μL de etanol a 70% para lavar o precipitante. Prepare o etanol a 70% (1 L) adicionando 95% de etanol (736,8 mL) a água destilada estéril (263,2 mL).
- Centrifugar a 15,000 xg durante 30 minutos a 4 ° C novamente e secar ao ar a pastilha por 5-10 minutos à TA. Adicione 25 μL de H 2 O isento de RNase para dissolver as sondas anti-sentido e sensoriais de RNA.
- Se o comprimento do gene inserido for superior a 1 kb, subseqüentemente fragmenta sondas de sentido antisentido e de detecção de ARN até um comprimento médio de 300 pb por incubação em soluções tampão de carbonato de carbonato. Realize a reação em um volume final de 50 μL, containing 25 pL da sonda de ARN e 25 uL da solução tampão de bicarbonato-carbonato (80 mM de NaHCO3, 120 mM de Na 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. O tempo de hidrólise requerido é dado por uma fórmula 17 previamente publicada.
- Adicione 5 μL de ácido acético a 10% para parar a reação. Neste experimento, fragmentar as sondas de sentido antisense e LmigOR2 LmigOR2 e LmigORco durante 24 e 23 minutos, respectivamente.
T = (L o -L f ) / kXL o XL f
L o = os comprimentos de fragmentos iniciais em kb
L f = o comprimento final dos fragmentos em kb
K = a constante de taxa para hidrólise, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1
T = tempo de hidrólise em min - Finalmente, adicione 250 μL de tampão de hibridação e armazene a -80 ° C.
2. Preparação de seções de criostato
- Precool o freeziNg microtome a -24 ° C.
- Selecione novos gafanhotos adulto em muda que estejam ativos e tenham antenas intactas. Corte as antenas em pedaços de 2-3 mm usando máquinas de barbear estéreis.
- Coloque o composto OCT em um suporte de micrótomo congelante e coloque uma ou duas amostras sobre o composto horizontalmente. Em seguida, transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C para equilibrar até o composto congelar. Retire o suporte e cubra as amostras com um pouco de composto. Transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C novamente durante pelo menos 10 minutos ( Figura 1 ).
NOTA: Evite obter bolhas no composto. - Fixar o suporte com as amostras no micrótomo de congelação, depois separar as amostras congeladas em fatias de 12 μm de espessura a -24 ° C.
- Descongelar as fatias uma a uma nas lâminas (25 x 75 mm, livre de nuclease) e secar ao ar por 10 min.
3. Seções de fixação
- Após a preparação do criostatoSeções, coloque as lâminas em um recipiente de plástico (~ 100 x 40 x 80 mm) e conserte os tecidos incubando as lâminas em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos a 4 ° C.
- Lavar as lâminas em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 min.
- Para eliminar as proteínas alcalinas, transfira as lâminas para HC1 0,2 M por 10 min.
- Para eliminar a proteína superficial do ácido nucleico, transfira as lâminas para 1XPBS com 1% de Triton X-100 durante 2 min.
- Lave os slides duas vezes por 30 s em 1x PBS.
- Finalmente, enxaguar as lâminas na solução de formamida durante 10 min a 4 ° C.
4. Hibridação
- Prepare as sondas anti-sentido e sensoriais
- Use o tampão de hibridação para diluir as sondas antisentido ou sensora de RNA nos tubos livres de nuclease de 1,5 mL. Nesta experiência, para todas as sondas antisentido e sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), adicione 1 μL de sonda a 99 μL buffer de hibridação por slide. Geralmente, o uso de diluições 1: 100 de sondas anti-sentido produz sinais positivos significativos e baixos fundos usando este protocolo.
- Para detecção cromogênica, diluir as sondas marcadas com DIG individualmente.
- Para a detecção de TSA, diluir LmigOR1 marcado com DIG com sondas LmigOrco marcadas com biotina ou LmigOR2 marcado com DIG com sondas LmigOR1 marcadas com biotina em conjunto no tampão de hibridação.
- Aquecer as diluições durante 10 min a 65 ° C e colocá-las em gelo durante pelo menos 5 min.
- Hibridação
- Drene as lâminas e adicione 100 μL de sondas de detecção anti-sentido diluídas (Etapa 4.1) às secções de tecido. Em seguida, coloque lamínulas (24 mm x 50 mm, livres de nuclease) nas seções de tecido.
- Coloque as lâminas cobertas horizontalmente em uma caixa úmida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incubar umaT 55 ° C durante 22 h. Adicione a solução de formamida ou 1X PBS no fundo da caixa para manter o ambiente úmido, mas não submergir as lâminas no líquido.
- Lavagem e bloqueio.
- Após a hibridação, remova cuidadosamente os lamínulas. Lave as lâminas duas vezes por 30 min em citrato de sódio salino 0.1x (SSC) a 60 ° C.
NOTA: A lavagem significa colocar as lâminas em um suporte de deslizamento que é então colocado em um recipiente de plástico e agitado suavemente em um balancim (~ 50 rpm, Figura 2 ). - Enxaguar as lâminas em 1x Tris-Buffered Saline (TBS) durante 30 s.
- Adicionar 1 mL de reagente de bloqueio a 1% em TBS suplementado com Triton X-100 a 0,03% em cada lâmina e incubar durante 30 min. Em seguida, descarte a solução de bloqueio.
- Após a hibridação, remova cuidadosamente os lamínulas. Lave as lâminas duas vezes por 30 min em citrato de sódio salino 0.1x (SSC) a 60 ° C.
- Imuno-histoquímica.
- Para a detecção cromogênica, use reagente de bloqueio no TBS para diluir 750 unidades (U) / mL anti-digoxigenina anti-conjugado APDy a 1,5 U / mL AP solução. Adicione 100 μL de solução AP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm).
- Para detecção de TSA, use reagente de bloqueio em TBS para diluir 750 U / mL de anticorpo anti-digoxigenina AP conjugado e anticorpo anti-biotina com estreptavidina conjugada com HRP para a solução AP / HRP. Adicione 100 μL de solução de AP / HRP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm).
- Incube os slides em uma caixa úmida ( Figura 2 ) durante 60 min a 37 ° C. Use a solução de formamida ou 1X PBS para manter a caixa úmida, mas não encharcada.
5. Coloração
- Remova cuidadosamente os lamínulas. Lavar as lâminas três vezes durante 5 min em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. Enxaguar os slides em tampão DAP (detecção cromogênica: pH 9,5, detecção TSA: pH 8,0) durante 5 min.
- Coloração (detecção cromogênica)
- Adicionar 100 μL de solução de substrato NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluída em DAP;PH 9,5) para cada slide. Coloque cuidadosamente os lamínulos (24 x 50 mm) nos slides.
- Incube as lâminas em uma caixa úmida com solução de substrato por 10 min - O / N a 37 ° C.
NOTA: Verifique o desenvolvimento, olhando os slides de vez em quando ao microscópio. - Quando o desenvolvimento estiver pronto, pare a reação transferindo as lâminas para dentro da água.
- Coloração (detecção TSA)
- Use uma seringa para mover o substrato de HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) do filtro da seringa (0,22 μm, Figura 2 ).
- Adicione 100 μL de HNPP / Substrato Vermelho Rápido por slide coberto com uma lamínula (24 x 50 mm). Incube as lâminas durante 30 minutos com HNPP / Substrato Vermelho Rápido à RT.
- Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes por 5 minutos em 1X TBS suplementado com 0,05% de Tween-20.
- Use 100 μL de substrato TSA / coberto (24 x 50 mm 2 ) deslize. Incube as lâminas com substrato de TSA durante 10 min à TA.
- Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes durante 5 minutos em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20.
- Incorporar as lâminas em PBS / glicerol (1: 3).
NOTA: Depois de concluir estes procedimentos, as lâminas devem ser observadas o mais cedo possível porque o sinal fluorescente vai aplacar rapidamente.
6. Observação
- Detecção cromogênica
- Observe as seções de tecido usando um microscópio óptico. Escolha as lentes objetivas 10X, 20X e 40X para observar os resultados da detecção cromogênica.
- Use o software DP-BSW para analisar os resultados e capturar as imagens.
- Detecção TSA
- Observe seções de tecido usando um microscópio confocal. Os genes marcados com DIG devem ser observados sob luz de 543 nm, apresentando uma cor vermelha, e os genes marcados com biotina devem serObservado sob luz de 488 nm, apresentando uma cor verde. Quando emergem, apresentam cor amarela.
- Escolha as lentes objetivas 20X e 40X para observar os resultados da detecção TSA, respectivamente.
- Use o software FV1000 para analisar os resultados e capturar as imagens.
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Representative Results
Com a detecção cromogênica, um pequeno subconjunto das células antenais em todas as seções antenais adultas foi indicado pelas sondas antisentidades LmigOR1 e LmigOR2 marcadas com DIG ( Figura 3 ). ARN ISH em secções consecutivas para localizar LmigOR1 e LmigOR2 mostrou que as células que expressam antenares os dois genes foram localizados em aglomerados ORN expressam LmigORco, indicando que o LmigOR1 putativo e LmigOR2 foram, na verdade, expressas na ORNs (Figura 4a -4d). Ocasionalmente, as estruturas de tipo dendrítico identificadas foram visualizadas ( Figura 4e -4f ). LmigOR1 e LmigOR2 foram ambos localizados em neurônios na sensilidade básica ( Figura 5a-5b ), mas não foram co-expressos em sensilla individual, indicando que estavam presentes em diferentes basico Subtipos de nic sensillium ( Figura 5c-5 d ).
Na detecção de TSA, a hibridação fluorescente in situ de duas cores mostrou que as células que expressam LmigOR1 (cor vermelha) estavam localizadas em aglomerados ORN que expressavam LmigORco (cor verde), indicando que o LmigOR1 putativo era expresso em ORNs ( Figura 6a ). Uma visão próxima das áreas em caixa na Figura 6a é mostrada na Figura 6b . Os neurônios que expressam LmigOR1 (cor verde, Figura 7a ) e o neurônio de expressão de LmigOR2 (cor vermelha, Figura 7b ) foram localizados em diferentes subtipos de sensículo básico ( Figura 7c ).
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Figura 1: Preparação de secções antenas de insetos para hibridação in situ de ARN. (A) O micrótomo de congelação; ( Bc ) As amostras são incorporadas no congelamento do composto OCT. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Itens experimentais para hibridação in situ de ARN . (A) O suporte da lâmina e o recipiente de plástico. ( B ) A caixa úmida. ( C ) O rocker. ( D ) O filtro de membrana. ( E ) microscópio confocal. .jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Localização celular de LmigOR1 e LmigOR2 em órgãos olfatórios. (A) Visão geral de células -expressing LmigOR1 em um segmento antenal gafanhotos. ( B ) Visão geral das células que expressam LmigOR2 em um segmento antenal de gafas . Arrowheads indicam células que expressam LmigOR1 ( a ) e LmigOR2 ( b ). Barras de escala = 100 μm (a e b). As figuras foram adaptadas de Xu et al. 12 Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4: Identidade Neuronal de Células Antenais Expressando LmigORs por Detecção Cromogênica . ( Ab ) O padrão de rotulagem de LmigOR1 ( a ) e LmigORco ( b ) sonda anti-sentido em seções consecutivas de antena acrílica . ( Cd ) O padrão de rotulagem de LmigORco ( c ) e LmigOR2 ( d ) sonda anti-sentido em seções consecutivas da antena de gafanhoto. ( Ef ) Ilustração de estruturas semelhantes a dendríticas marcadas ocasionalmente (indicadas por setas vermelhas). Barras de escala = 50 μm (ad); 20 μm (e e f). As figuras foram adaptadas de Xu et al. 12 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 5: LmigOR1 e LmigOR2 são expressos em ORNs alojados no Basiconic Sensilla. ( Ab ) sensorial locomotricamente alojado ORNs expressando LmigOR1 ( a ) e LmigOR2 ( b ). ( Cd ) A expressão de LmigOR1 e LmigOR2 em um subconjunto distinto de ORNs antenais foi verificada em seções consecutivas (cd). Arrowheads denotam células antenais que expressam LmigOR1 (a, c) e LmigOR2 (b, d). Ba: sensorial básico. Barras de escala = 20 μm (a e b); 50 μm (c e d). As figuras foram adaptadas de Xu et al. 12 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Identidade Neuronal da Celda Antenal Expressando LmigOR1 por Detecções TSA. (A) de duas cores de hibridação in situ foi realizada em secção longitudinal antenal para ilustrar a expressão de LmigOR1 (vermelho) e LmigORco (verde). Localização de LmigOR1 células -expressing em grupos de células que expressam LmigORco confirmou a sua identidade neural. ( B ) Vista fechada de áreas em caixa em um. As estruturas dendríticas marcadas ocasionalmente foram indicadas pela seta. As áreas circundadas indicam o agrupamento de ORN que expressa o LmigORco e compartilha o mesmo sensillum. Barras de escala = 50 μm (a); 20 μm (b). As figuras foram adaptadas de Xu et al. 12 Por favor cLambe aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 7: LmigOR1 e LmigOR2 foram localizados para diferentes ORN Basiconic Sensilla por detecção TSA. Os sinais fluorescentes foram visualizados usando sistemas de detecção, indicando os neurônios marcados com LmigOR1 por fluorescência verde ( a ) e as células LmigOR2 positivas por fluorescência vermelha ( b ) foram expressas em diferentes subtipos sensoriais básicos ( c ). Arrowheads denotar células antenais que expressam LmigOR1 e LmigOR2 . Barras de escala = 20 μm. As figuras foram adaptadas de Xu et al. 12 Clique aqui para ver umVersão maior desta figura.
| Nome | Sequências |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 ' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 ' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 ' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 ' |
Tabela 1: As Seqüências dos Primers de PCR.
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Discussion
É difícil realizar RNA ISH para localizar genes OU em antenas de insetos porque os níveis de expressão de genes OR, exceto ORco , são muito baixos e a preservação de fatias histológicas de antenas de insetos é muito difícil. Além disso, a detecção TSA também é muito complicada. Para resolver esses problemas, as seguintes medidas devem ser tomadas. As antenas são selecionadas a partir de gafas adultas de muda que possuem cutículas antenas finas e macias, que mantêm sua morfologia no slide. As amostras congeladas são seccionadas em fatias de 12 μm de espessura. São utilizadas sondas altamente sensíveis e específicas de biotina e DIG. Os detergentes, como Tween-20 e Triton X-100, são usados para diminuir o fundo em muitas etapas. Na detecção de TSA, um gene altamente expresso, em relação a outro gene com expressões baixas, deve ser rotulado com biotina-16-UTP. Os slides devem ser observados o mais cedo possível porque os sinais fluorescentes se apagam rapidamente.
DIG- aAs sondas marcadas com biotina têm as vantagens de uma vida útil mais longa, relações de sinal / ruído mais altas e melhores resoluções celulares do que as sondas radioativas 18 , 19 . O protocolo apresentado neste artigo apresenta algumas vantagens em relação à hibridação in situ completa . Este protocolo identifica facilmente as localizações de genes no nível celular, mas não pode ser facilmente usado para investigar os padrões de distribuição de genes, o que é mais facilmente realizado com hibridação in situ inteira.
Para identificar um gene OR, foram realizadas duas abordagens. Uma foi a detecção cromogênica em seções consecutivas e a outra foi detecção fluorescente em uma seção. O ORco é co-expresso com um OR específico como um marcador ORN 10 , 20 , 21 . As células que expressam LmigOR1 ou LmigOR2 foram localizadasPara clusters de células que exprimem LmigORco que os verificaram inequivocamente como ORs ( Figura 4 e Figura 6 ). Usando as mesmas abordagens, descobrimos que LmigOR1 e LmigOR2 não são co-expressos em um sensil. Os resultados dessas duas abordagens são corroborativos.
Este protocolo também foi utilizado com sucesso para localizar LmigORco, SgreORco, SgreIR8a e SgreIR25a em antenas de gafanhoto 10 , 14 . Recentemente, LmigOR3 foi localizado nos neurônios de sensillas tricoides em L. migratoria usando o mesmo protocolo 15 . Este protocolo foi utilizado para localizar duas proteínas sensoriais da membrana neural SgreSNMP1 e SgreSNMP2 nas antenas de S. gregaria 16 . Assim, este protocolo localizou de forma confiável genes relacionados com a quimiossensibilidade em antenas de gafas, o que não só verificou estasGenes candidatos, mas também localizou esses genes em células específicas alojadas em diferentes tipos de sensilla.
Em conclusão, este protocolo altamente eficaz de RNA ISH é descrito especificamente para localizar genes OR, bem como outros genes expressos em níveis baixos, em antenas de insetos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar ou quaisquer outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por uma doação da National Natural Science Foundation of China (nº31472037). A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente para fornecer informações específicas e não implica recomendação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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