Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Published: September 14, 2017 doi: 10.3791/56021
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Summary

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Abstract

Het bestaan van endotheliale voorlopercellen (Spoon) in perifeer bloed en haar betrokkenheid in vasculogenese werd eerst gemeld door Ashara en collega's1. Later, gedocumenteerd anderen het bestaan van gelijkaardige types van Spoon afkomstig uit beenmerg2,3. Meer recentelijk, Yoder en Ingram bleek dat Spoon afgeleid van navelstrengbloed had een hogere proliferatieve potentieel in vergelijking met degenen geïsoleerd van volwassene perifere bloed4,5,6. Afgezien van betrokkenheid bij postnatale vasculogenese, Spoon ook is gebleken belofte als een bron van de cel voor het maken van weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel constructies7,8. Er zijn diverse protocollen van de isolatie, waarvan sommige betrekking hebben op de cel sorteren van mononucleaire cellen (MDL) afkomstig van de bronnen die eerder vermeld met behulp van endotheliale en hematopoietische markers of kweken van deze multinationals met gespecialiseerde endothelial groei medium, of een combinatie van deze technieken-9. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en cultuur van Spoon met behulp van gespecialiseerde endothelial medium aangevuld met factoren die de groei, zonder het gebruik van immunosorting, gevolgd door de karakterisatie van de geïsoleerde cellen gebruikend het westelijke bevlekken en immunokleuring.

Introduction

Enkele onderzoekers hebben onderzocht de kenmerken en mogelijkheden van menselijke Spoon5,10,11,12,13. Spoon kunnen worden omschreven als het circulerende cellen die de mogelijkheid om te voldoen aan endothelial weefsel in sites van hypoxie, ischemie, letsel of tumor vorming en bijdragen tot de vorming van nieuwe vasculaire structuren4,14. Hun waargenomen betrokkenheid in neovascularization, in de vorm van postnatale vasculogenese, heeft geleid tot een goed begrip van de pathofysiologie van deze cellen en hun gebruik in therapeutische toepassingen4,15, 16. het aantal Spoon in een individu is aangetoond te worden gecorreleerd met cardiovasculaire pathologie9,15,16,17,18,19 ,20. Andere studies hebben ook onderscheid gemaakt tussen Spoon een ventiel fibroblast-achtige fenotype en voorgesteld dat deze cellen kunnen worden gebruikt voor weefselengineering hart kleppen7,21.

De bepaalde cel oppervlakte moleculen die nodig zijn voor het isoleren van Spoon zijn niet duidelijk geïdentificeerd als gevolg van de verschillen tussen de onderzoeken4. De hechting van MDL naar een bepaalde matrix, met de blootstelling aan een verscheidenheid van kweekomstandigheden, is uitgevoerd door verschillende groepen1,17,22,23, suggereren dat vermeende Spoon kan verschillende fenotypische eigenschappen weergeven Deze eigenschappen omvatten een gebrek aan phagocytotic vermogen, buis vorming in Matrigel, en de opname van low-density lipoproteins Dil-geacetyleerd. De hoge clonogenic en proliferatieve potentieel zijn twee eigenschappen met welke Spoon hierarchized5 kunnen. Spoon kunnen ook in vitro tubuli wanneer cocultured met menselijke foetale Long fibroblasten4vormen. Deze cellen zijn bekend uitspreken endothelial cel oppervlakte markeringen en sommige van de hematopoietische markeringen13,24,25te delen. De positief geformuleerde markeringen die zijn geaccepteerd voor fenotypering Spoon zijn CD31, CD34, vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (vWF), CD133, c-Kit, en vasculaire endothelial cadherine (VE-cadherine)4 , 18. cellen die mede express CD90, CD45, CD14, CD115 of alpha-gladde spier actine (α-SMA) worden niet beschouwd als Spoon omwille van hun beperkte proliferatieve potentiële, vermogen om de phagocytose van bacteriën, en het onvermogen om te vormen van DOVO menselijke schepen in vivo4,7. Dit artikel schetst een gewijzigd protocol voor de isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed zonder de behoefte aan een willekeurige cel sorteren van protocollen. Voor dit artikel, hebben we een aantal CD31, CD34 en VEGFR2 als de positieve markers, met α-SMA als negatieve indicator gebruikt.

In dit artikel, stellen wij voor een methode van isoleren en kweken van endotheliale voorlopercellen van navelstrengbloed zonder cel sorteren via gespecialiseerd endothelial groeimedium aangevuld met groeifactoren (BAVA). Deze BAVA bevat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor (FGF), die de overleving, proliferatie, en migratie van endotheliale cellen26te vergroten. Het omvat ook ascorbinezuur, die verantwoordelijk is voor het behoud van de geplaveide morfologie van cellen; insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1), waarin angiogenic en trekkende functie; en heparine, waardoor verbeterde stabiliteit op lange termijn van de factoren die de groei in de middelgrote26. Andere factoren die de groei toegevoegd aan het kweekmedium endothelial cel bevat suppletie met epidermale groeifactor (EGF), die helpt bij het stimulerende celproliferatie en differentiatie en hydrocortison, die de cellen met EFG26 sensibiliseert . We laten zien dat het gebruik van deze specifieke groeisnelheid medium hogere aantallen Spoon t.o.v. endothelial Basaal medium (EBM) of Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM levert).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

dit onderzoek werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van Arkansas institutionele Review Board (erkenningsnummer 16-04-722). Navelstreng bloed eenheden werden verzameld in citraatoplossing fosfaat dextrose (CPD) op de Arkansas navelstrengbloed Bank en eenheden die niet voldeed aan de eis voor opslag werden geschonken voor onderzoek. Koord bloed eenheden werden methoden.NETeller naar het lab binnen de 24u van collectie bij omgevingstemperaturen.

1. isolatie van endotheliale voorlopercellen uit navelstrengbloed

  1. bereiding van reagentia.
    1. Bereiden BAVA door endothelial Basaal medium (EBM) toe te voegen aan 10% foetale runderserum (FBS) aangevuld met 20 ng/mL van insuline-achtige groei factor (IGF), 1 µg/mL ascorbinezuur, 5 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor (rhEGF), 22.5 µg Mo/mL heparine en 0,5 ng/mL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), samen met 10 ng/mL van recombinante menselijke Fibroblast groeifactor B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortison en 2% penicilline-streptomycine-glutamine. Steriliseren van het kweekmedium met behulp van een 0,2 µm polyethersulfon (PES) vacuüm membraanfilter.
    2. Voorbereiden rat staart ik collageen oplossing bij een concentratie van 50 µg/mL met behulp van 0,02 N azijnzuur. Steriliseren van deze oplossing met behulp van een filter van de spuit 0,2 µm.
    3. Pre vacht 6-Wells-platen met 2 mL bereid rat staart ik collageen oplossing voor elk putje. Plaats ze in een incubator gehandhaafd op 5% CO 2 en 37 ° C gedurende ten minste 1 uur vóór het zaaien.
    4. Verdun ongeveer 25 mL van navelstrengbloed met Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met een concentratie van 1:1.
    5. Neerslag van voorbereiden radio-immuno assay (RIPA) Buffer met behulp van 150 mM natriumchloride, 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxycholate, 1 mM β-glycerophosphate, 0,1% SDS en 50 mM Tris (pH 8,0).
  2. Isolatie van endotheliale voorlopercellen.
    1. Warme all bereid reagentia in een waterbad op 37 ° C vóór isolatie gehouden.
    2. 20 mL dichtheid kleurovergang middellange reagens toevoegen aan een centrifugebuis 50 mL.
    3. Zorgvuldig laag 20 mL verdunde navelstrengbloed in de centrifugebuis met kleurovergang medium dichtheid zonder deze laag door te streven de pipet naar de zijwanden van de buis breken.
    4. Scheiden de componenten van bloed op basis van hun dichtheid ( Figuur 1) door centrifugatie bij 800 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, met de remmen van de centrifugerotor af. De verschillende lagen niet storen.
    5. Verwijder de plasma laag waarbij eveneens het zorgvuldig uit de buis zonder verstoring van andere cel lagen totdat het uiteinde van de pipet vermag bereiken de MNC horizont (Zie Figuur 1). Negeren van het plasma is verwijderd.
      Opmerking: Tijdens het gebruik Pipetteer tips voor het verwijderen van het plasma, laat een kleine laag van plasma boven de MNC laag ( Figuur 1) om verstoringen.
    6. De buffy coat waarin de multinationals met behulp van een injectiespuit op een 18-gauge naald gemonteerd verzamelen en overbrengen naar een verse centrifugebuis.
    7. Een gelijk volume van EBM op toevoegen aan de verzamelde Centrifuge MDL. deze buizen 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Discard het supernatant.
      Opmerking: De cel pellet verschijnt rode vanwege de aanwezigheid van rode bloedcellen/erytrocyten.
    8. Voeg 5 mL van de ammoniumchlorideoplossing lyse van de rode bloedcellen. Incubeer deze buis op ijs gedurende 5-10 minuten, met af en toe schudden.
      Opmerking: Let op moet worden genomen tijdens deze stap niet meer bedragen dan de tijdsduur, zoals het schadelijk voor de MDL zijn kan.
    9. Centrifugeren van de buizen bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Als de erytrocyten aanhouden, herhaal stap 1.2.8 en 1.2.9 totdat geen rode kleur wordt waargenomen in de pellet.
    10. Resuspendeer de pellet in bereid BAVA en gebruiken de hemocytometer om te tellen van de MDL.
    11. Aspirate de rat staart ik collageen beklede 6-well plaat (uit stap 1.1.3) en was de putjes drie keer met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    12. Zaad de MNC pellet geresuspendeerde in BAVA aan de collageen-plaat met een concentratie van 1 x 10 7 MDL in elk putje. Plaats deze in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    13. Na 24 h, gecombineerd het medium en was de putjes goed eenmaal met BAVA. Voeg 3 mL van BAVA medium aan elk putje en plaats deze terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    14. Vullen de plaat met verse BAVA medium elke dag gedurende 7 dagen. Na 7 dagen, wijzigen de BAVA medium om de andere dag.
    15. Afbeeldingen van de 6-well plaat met behulp van een helder-veld Microscoop, neem elke dag om bij te houden van de progressie van endothelial cel kolonies. Mark van de plaat waar de kolonies ontstaan voor het bijhouden van hun groei.
      Opmerking: Het duurt meestal tussen de 5 en 9 dagen voor de koloniën die in cultuur.
  3. Uitbreiding van endotheliale voorlopercellen.
    1. Jas de T-25 cultuur kolf met rat staart ik collageen (50 µg/mL) en plaats deze in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor ten minste 60 min. Aspirate en wassen van de T-25 cel cultuur kolf driemaal met 1 x PBS vóór het zaaien van de cellen.
    2. Trypsinize de kolonies endothelial cel wanneer ze ongeveer 3 mm in grootte met 150 µL trypsine-EDTA-oplossing 0,05% in elk putje bereiken. Plaats de 6-well plaat terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator gedurende 2-3 minuten
    3. Tik zachtjes op de 6-well plaat om te verjagen van de gekoppelde cellen. Onmiddellijk Voeg toe 2 mL BAVA en herstellen de cellen in een centrifugebuis 15 mL.
    4. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en berekenen van de eerste seeding dichtheid.
    5. Spin de 15 mL centrifuge buizen bij 400 x g gedurende 5 min. resuspendeer de pellet cel in BAVA en de T-25 fles met ~ 500.000 cellen beënt. Markeer deze kolf als Passage 1 en plaats de kolf T-25 terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
      Opmerking: Cellen kunnen worden bekleed in de EBM en DMEM te vergelijken van de groei met BAVA.
    6. Voor verdere passages, wanneer de kolf 90% samenvloeiing bereikt, stappen 1.3.1 - 1.3.5 en reseed de cellen op 10 4 cellen/cm 2 in T-75 of T-175 cel cultuur kolven. Gaat u verder met de karakterisering van de geïsoleerde cellen (stap 2 en 3).

2. Karakterisering van geïsoleerde cellen met behulp van westelijke bevlekken

  1. toevoegen 50-100 µL van lysis buffer bij elke passage wanneer de uitbreiding als volgt te karakteriseren de geïsoleerde cellen. Verzamelen van eiwitten uit ongeveer 500.000 of meer cellen.
  2. Pipetteer krachtig op en neer te scheuren van de cellen en de vrijgave van de eiwitten. Verzamelen en overdragen van de buffer aan een buis microcentrifuge.
  3. De microcentrifuge buis 500 x g spin en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Label en opslaan van de buizen bij-80 ° C voor langetermijnopslag.
  4. Kwantificeren van de hoeveelheid eiwitten in elke buis met behulp van beide Bradford ' s of BCA assay 27 , 28 , 29.
  5. Verrichten westelijke bevlekken met behulp van standaardprocedures 27 , 28 , 29. Analyseren 5 µg van totale eiwitten voor de expressie van CD31, CD34, VEGFR2 en α-SMA. Α-tubuline gebruiken voor de gegevens normaliseren.

3. Indirecte immunofluorescentie

  1. Bewerk ultrasone trillingen ten 18-mm glas coverslips in 50% ethanol en droog ze af. Laat de schone coverslips in een 12-well plaat overnachting in de bioveiligheid kap met een UV licht op om ze te steriliseren.
  2. Jas de coverslips met 50 & #181; g/mL rat staart ik collageen en overdracht van de plaat naar een 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor ten minste 60 min.
  3. Gecombineerd de collageen en voeg 1 mL 1 x PBS aan de 12-well plaat te wassen van de coverslips. De PBS 1 x gecombineerd en tweemaal herhalen.
  4. Zaad 250.000 gekweekte Spoon in elk goed en plaats ze terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor ten minste 3 dagen vóór de uitvoering van immunokleuring.
  5. Wassen de plaat 3 keer met 1 x PBS. Voeg 1 mL ijskoud methanol aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om op te lossen van de cellen.
  6. Verrichten immunokleuring met behulp van een standaard protocol 27 , 28 , 29. Gebruik de antilichamen in hun juiste verdunningen (b.v., CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1:100) en VEGFR2 (1:50)).
  7. Nemen de beelden van de coverslips van de immunostained met behulp van een Microscoop epifluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolatie en uitbreiding van endotheliale voorlopercellen:
Een schema (Figuur 1) wordt geleverd aan de beeltenis van het algemeen protocol. De verschillende bloed component lagen werden waargenomen na verloop centrifugeren van de dichtheid van menselijke navelstrengbloed met kleurovergang medium dichtheid. Bij zaaien MDL op de platen van collageen-behandeld, werd de uitgroei van de koloniën eerst waargenomen tussen dagen 5 en 7(Figuur 2). Deze kolonies bleef groeien en had een spindel-vormig cel morfologie (Figuur 2A-2D) in de vroege stadia, die later stapte over naar een geplaveide-achtige morfologie (Figuur 2E-2F). Figuur 3 A toont het totale aantal cellen ten opzichte van de tijd in cultuur, en elk gegevenspunt vertegenwoordigt het cumulatieve aantal cellen geoogst op elke passage. Figuur 3 B toont de gemiddelde tijd die voor de eerste kolonie te ontstaan in de collageen-behandelde 6-well plaat na het zaaien van de multinationals.

Karakterisering gebruikend het westelijke bevlekken:
Figuur 4 A toont de vertegenwoordiger van de resultaten van de Western blot membraan dat werd getest tegen de verschillende antilichamen. Onze resultaten suggereren dat de cellen positief voor CD31 en CD34 waren. De expressie van het CD31 (Figuur 4B) en CD34 (Figuur 4C) verscheen loop van latere passages, afnemen, terwijl VEGFR2 (Figuur 4D) kwam ook tot uitdrukking in latere passages, met de eerste doorgang met hogere expressie. Ook zien we dat de Spoon niet de mesenchymale cel marker α-SMA (Figuur 4E) te uiten. Menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC) en terugstroming interstitiële cellen (VIC) cel lysates werden gebruikt als positieve en negatieve controles, respectievelijk. HUVECs is bekend dat het geven van CD31, CD34 en VEGFR2, terwijl VICs express α-SMA.

Figure 1
Figuur 1 : Schematische EPC isolement. Start het isolement door verdunnen koord bloed met HBSS en het zorgvuldig stapelen op de top van de dichtheid van de kleurovergang medium, zoals wordt weergegeven. Kleurovergang centrifugeren van de dichtheid van de gelaagde bloed wordt uitgevoerd om de verschillende lagen van het bloed, die uit multinationals (buffy coat), gradiënt medium dichtheid, granulocyten en RBC bestaat. De afbeelding van de deelverzameling geboden toont deze verschillende lagen. Multinationals worden verzameld en op een bord van collageen-behandelde cel cultuur reseeded. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Progressie van de cel kolonie. (A-E) Representatieve helder-veld beelden van EPC kolonie progressie na verloop van tijd. Merk op dat de kolonie spindel-vormig cellen in de vroege stadia heeft, tot vaststelling van de morfologie van de kasseien. (E) representatieve afbeelding van EPC gekweekt in een T-75 kolf bij passage 3. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Groeikrommes van Spoon. (A) de grafiek toont het aantal cellen groeien over een periode van tijd, en elk van het gegevenspunt duidt de cel nummer geoogst tijdens elke passage (P0 - P10) (n = 4). (B) tijd genomen voor de eerste kolonie van de EPC om te verschijnen in de 6-well plaat (n = 4). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Geen statistische significantie werd gevonden met one-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Westelijke bevlekken. (A) westelijke vlek membraan gekleurd met verschillende antilichamen. HUVEC lysate en VIC lysate werden gebruikt als positieve controle. (B) gemiddelde intensiteit van CD31 bands genormaliseerd met α-tubuline. (C) gemiddelde intensiteit van CD34 bands genormaliseerd met α-tubuline. (D) gemiddelde intensiteit van VEGFR2 bands genormaliseerd met α-tubuline. (E) de gemiddelde intensiteit van α-SMA bands genormaliseerd met α-tubuline (n = 3-6). Foutbalken geven de SEM. Geen statistische significantie werd gevonden met one-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Immunokleuring. Representatieve beelden van Spoon gekweekt in BAVA voor 7 dagen en immunostained in verschillende passages voor CD31, CD34, VEGFR2 en α-SMA. Schaal bar - 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental Figure 1
Aanvullende figuur 1: De grafiek toont het aantal cellen per oppervlakte-eenheid gedurende een periode van 7 dagen wanneer gekweekt in BAVA EBM en DMEM. BAVA bleek hoger celgroei in vergelijking met de media (EBM en DMEM). De gegevens toonden statistische significantie, met p < 0,01, met one-way ANOVA (n = 2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental Figure 2

/ > Aanvullende figuur 2: representatieve beelden van Spoon gekweekt in EBM voor 7 dagen en immunostained voor CD31, CD34, VEGFR2 en α-SMA. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental Figure 3
Aanvullende figuur 3: Representatieve beelden van Spoon gekweekt in DMEM voor 7 dagen en immunostained voor CD31, CD34, VEGFR2 en α-SMA. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zoals eerder vermeld, aanhanger Spoon bezitten een geplaveide morfologie. Onze geïsoleerde MDL gevorderd van een spindel-vormig cel kolonie (Figuur 2A-2D) in een vroeg stadium naar een geplaveide kolonie (Figuur 2E-2F) over een periode van tien dagen in cultuur. Spoon hebben het label verschillend door verschillende onderzoeksgroepen, namelijk als laat endothelial progenitor cellen10, endotheel kolonievormende cellen5, of Endotheel progenitor cellen12. Opgemerkt moet worden dat deze cellen functioneel hetzelfde zijn en express vergelijkbare cel oppervlakte markeringen. Het aantal cellen opgemerkt tijdens de periode met cultuur (Figuur 3) verhoogd tot bijna 108 cellen, analoog aan eerdere publicaties en typische van het hoge proliferatieve potentieel van Spoon3,5. Inderdaad bleek dat Spoon uit menselijke navelstrengbloed toonde een hoge proliferatieve potentiële en aangetoonde diverse bevolking verdubbelingen verkregen voordat ondergaan senescentie t.o.v. Spoon geïsoleerd van de volwassen menselijke perifeer bloed5 , 10.

Onze westelijke bevlekkende resultaten (Figuur 4A) bleek de aanwezigheid van CD31, CD34 en VEGFR2 op de cel lysates Spoon in vergelijking met de positieve controle, HUVEC verkregen. HUVECs geven CD31, CD34 en VEGFR2 en VIC uitdrukkelijke α-sSMA geactiveerd. Vergelijkbaar met eerdere verslagen10,18, de uitdrukking van CD31 daalde met hogere passages. Het expressiepatroon was ook gelijk in het geval van CD34 en VEGFR2, waar zowel de markeringen sterk in de eerste passage en in relatief lager, maar gelijke bedragen in latere passages uitgedrukt waren. Deze gegevens tonen een trend die in overleg met de resultaten van de vorige groepen, waarin immunosorting gebaseerde protocollen werden gebruikt voor het isoleren van koord bloed afkomstige Spoon12. In het algemeen, Spoon doen niet express mesenchymale markeringen en, om te verifiëren dat de geïsoleerde cellen niet mesenchymale in de natuur, waren wij immunolabeled onze westelijke vlek membranen met α-SMA. Onze resultaten tonen duidelijk aan dat er was geen uitdrukking van de α-SMA in de gekweekte Spoon in vergelijking met positieve controle cel lysates verzameld van VICs, die sterke uitdrukking van α-SMA antilichaam vertonen.

Om aan te tonen dat BAVA voorziet in grotere celproliferatie in vergelijking met andere Kweekmedia gebruikt voor Spoon, we gekweekte cellen in drie verschillende soorten media: DMEM, EBM en BAVA (dat wil zeggen, EBM aangevuld met groeifactoren, zoals eerder beschreven). Alle werden aangevuld met 10% FBS. We zaadjes cellen van verschillende passages in elk putje van de plaat van een 12-well. Aanvullende figuur 1 toont het aantal cellen per oppervlakte-eenheid in elk putje na verloop van tijd in cultuur in de formuleringen van de verschillende media. Wij stellen vast dat de Spoon gekweekte in BAVA bleek een gestage toename in celaantal en voor cellen in EBM, er was een trager tempo van de toename van aantal cellen tijdens de eerste drie dagen, die vervolgens plateaued. Dit suggereert dat de Spoon nog in EBM overleven kon, maar de afwezigheid van factoren die de groei belemmerd proliferatie. We constateren ook dat Spoon in DMEM daling in aantal gekweekt, suggereren dat deze bepaalde middelgrote formulering niet geschikt voor hun overleving of proliferatie is. Onze immunokleuring gegevens blijkt dat de Spoon gekweekte in BAVA (Figuur 5) uitgesproken CD31 meer in vergelijking met Spoon gekweekt in EBM (aanvullende figuur 2) en DMEM (aanvullende figuur 3). Figuur 5 met aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3vergelijkt, blijkt dat de cellen niet met andere celtypes besmet waren. Ook bij het vergelijken van de immunostained Spoon (Figuur 5), kunnen we kwalitatief stellen dat de uitdrukking van CD31 en CD34 gedaald is van hogere passages, ter ondersteuning van onze westelijke vlek gegevens (Figuur 4).

Nogmaals, is het hoofddoel van onze voorgestelde protocol om aan te tonen dat een endotheliale voorlopercellen door kweken bloed MDL in gespecialiseerde selectieve media kunt isoleren. Dit is aan te tonen dat Spoon kunnen worden geïsoleerd zonder geavanceerde apparatuur en procedures, in tegenstelling tot andere methoden die betrekking hebben op het gebruik van stroom cytometry - hetzij onmiddellijk na MNC isolatie1,3,20 , 30 of nadat de koloniën zijn uitgegroeid tot een enkelgelaagde - gevolgd door het replating4,10,12,13,23. De EPC-kolonies staan meestal tussen de 5 en 9 dagen. Onze methode is dus een snellere en meer kosten-efficiënte methode voor het isoleren van Spoon. De belangrijkste beperking van deze techniek is dat de uitdrukking van CD31 en CD34 met latere passages, die zou kunnen duiden dat de cellen hun voorvader fenotype verliezen afneemt. Dus is het aangeraden dat men moet gebruiken om cellen verkregen uit passage 5 of lager te voeren experimenten als met behulp van dit protocol.

Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen na het centrifugeren van de dichtheid om de verschillende lagen niet te storen bij het nemen van de gecentrifugeerde buizen terug in de kap en ook bij het verwijderen van het plasma. Een andere belangrijke stap heeft betrekking op lysis van de erytrocyt, waar een langere incubatietijd de MNC beschadigen kan. Het is dus aangeraden niet te Herhaal deze stap meer dan twee keer. Inderdaad, omdat de middellange aspiratie 24 h na plating verricht is, sporen van erytrocyten worden verwijderd, omdat ze niet-aanhanger. Alternatieve ondergronden, zoals fibronectine of gelatine, kunnen terwijl niet getest door ons, ook worden gebruikt volgens de specifieke protocollen voor het maken van cel cultuur coatings. Door gebruik te maken van kleine wijziging in de eerste stappen, kunnen onderzoekers niet-aanhanger Spoon30isoleren.

Tot slot hebben we een methode voor het isoleren van Spoon uit navelstrengbloed gemeld. Het is belangrijk op te merken dat de Spoon doen niet express markeringen als α-SMA, suggereren dat zij zich niet mesenchymale-achtige cellen. Inderdaad, α-SMA fungeert als een belangrijke markering wanneer het proberen om te studeren het endotheel-mesenchymale overgang (endo-MT) van Spoon. Endo-MT is een proces van de cellulaire transdifferentiatie gedurende welke endotheliale cellen zijn bekend om te verliezen hun specifieke markers en te transformeren tot een mesenchymale-achtige cel fenotype. Het is aangetoond dat Spoon kunnen deze overgang in het bijzijn van de groeifactor-β7 transformatie ondergaan en kunnen het vrijgeven van extracellulaire membraaneiwitten op hun weefsel-engineered steigers8. Al deze opmerkingen geven de belofte van Spoon voor gebruik als een bron van autologe cellen een hartklep of andere cardiovasculaire weefsels-engineered constructies maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder Grant nr. CMMI-1452943 en door de Universiteit van Arkansas Honors College. Wij willen ook te erkennen van de Arkansas navelstrengbloed Bank voor het verstrekken van ons met koord bloed eenheden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermofisher Scientific 10378016
Ficoll-Paque GE Heatlhcare 17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution Thermofisher Scientific 14170-112
Ammonium Chloride Stem Cell Technologies 7850
1x Phosphate Buffer Saline Thermofisher Scientific 14190250
Rat Tail I Collagen Corning 354236
Glacial Acetic Acid Amresco 0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25300054
HEPES buffer Thermofisher Scientific 15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Thermofisher Scientific 10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31  Abcam ab28364 1:250 dilution  for Western blotting
CD34 Santa Cruz Biotechnology sc-7045 1:100 dilution for Western blotting
α-SMA abcam ab5694 1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin abcam ab7291 1:2,500 dilution for Western blotting
VEGFR2 abcam sc504 1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate Santa Cruz Biotechnology sc24709 
Valve interstitial cell lysate Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10x Tris/Glycine/SDS buffer Biorad 161-0772 Used as running buffer
10x Tris/Glycine buffer Biorad 161-0771 Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane Merck Millipore IPFL0010 This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4x Laemmli sample buffer Biorad 161-0747
2-mercaptoethanol Biorad 161-0710
10% Criterion TGX precast gel Biorad 5671033
Prolong Gold antifade Thermofisher Scientific P36930 Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol VWR Analytical BDH1135-4LP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  2. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
  3. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
  4. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  5. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
  8. Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
  9. Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
  10. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  11. Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
  12. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  13. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
  14. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
  15. Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
  16. Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
  17. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  18. Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
  19. Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
  20. Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
  21. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
  22. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  23. Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
  24. Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
  25. Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
  26. Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
  27. Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
  28. Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
  29. Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
  30. Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 127 endotheliale voorlopercellen circulerende progenitorcellen laat endotheliale voorlopercellen bloed mononucleaire cellen weefselkweek navelstrengbloed
Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravishankar, P., Zeballos, M. A.,… More

Ravishankar, P., Zeballos, M. A., Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (127), e56021, doi:10.3791/56021 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter