Полуавтоматические анализ морфологии скелетных мышц мыши и волоконно тип состава
Summary
Иммуногистохимическое окрашивание изоформ тяжелой цепи миозина стала-искусство дискриминатора скелетных мышечных волокон-типа (т.е., I типа, типа IIA, введите IIX, типа IIB). Здесь мы представляем окрашивание протокола наряду с Роман полуавтоматические алгоритм, который способствует быстрой оценки морфологии тип волокна и волокна.
Abstract
Лет различия между типами скелетных мышечных волокон были лучше визуализированы пятнать миозин АТФазы. Совсем недавно иммуногистохимическое окрашивание изоформ миозин тяжелой цепи (MyHC) стала тоньше дискриминатора волоконно-типа. Тип I, IIA, введите IIX и тип IIB волокна теперь могут быть определены с точностью на основе их MyHC профиля; Однако, ручной анализ этих данных может быть медленным и вниз вправо утомительно. В этой связи Быстрая, точная оценка волоконно тип композиции и морфология является весьма желательным инструментом. Здесь мы представляем протокол-искусство иммуногистохимическое окрашивание MyHCs в Замороженные разделы, полученные от мыши задних конечностей мышцы в концерте с Роман полуавтоматические алгоритм, который ускоряет анализ морфологии тип волокна и волокна. Как и ожидалось, камбаловидной мышце отображается пятная для типа I и типа IIA волокна, но не для типа IIX или типа IIB волокон. С другой стороны мышцы передней tibialis состояла преимущественно из типа IIX и тип IIB волокон, небольшая часть волокон типа IIA и мало или вообще не типа волокна. Несколько преобразований изображения были использованы для составления карт вероятностей для измерения различных аспектов волокна морфологии (т.е., площадь поперечного сечения (CSA), максимальный и минимальный диаметр Ферэ). Значения, полученные для эти параметры были затем по сравнению с вручную полученных значений. Были замечены никаких существенных различий между либо режим анализа отношении CSA, максимальное или минимальное Ферэ диаметр (все p > 0,05), указывающее точность нашего метода. Таким образом протокол анализа наши иммуноокрашивания могут применяться к исследованию воздействия на мышцы состава во многих моделях старения и миопатии.
Introduction
Он был известен на некоторое время, что скелетных мышц состоит из одного волокна многих типов1. Первоначально, две группы волокон были охарактеризованы на основе их сократительных свойств и с именем, соответствующим образом, медленно дергаться (тип I) и быстро дергаться (тип II). Далее, эти категории были отделены на основе волокна метаболизма. С тех пор типа волокна богаты в митохондриях и зависят от окислительного метаболизма, они были раскрыты устойчиво положительных Никотинамидадениндинуклеотид tetrazolium редуктаза (NADH-TR) диафоразы2 или сукцината дегидрогеназа (SDH)3 пятнать. Наоборот, тип II волокна выставлены меньшей и переменных степеней NADH-TR диафоразы или SDH окрашивание и были разделены на две подгруппы быстро дергаться (тип IIA и IIB типа) несколько грубо на основе их относительных окислительного потенциала. Эти различия между волокнами была визуализирована более эффективно путем пятнать миозин АТФазы где типа волокна пятно темно после предварительной инкубации при pH 4.0 и тип IIB волокна поглощают осадок следующим предварительной инкубации при рН 10,0 волокнами типа IIA пятнать промежуточно4.
Совсем недавно иммуногистохимическое окрашивание изоформ миозин тяжелой цепи (MyHC) стала тоньше дискриминатора волоконно тип5. Тип I, тип IIA и IIB типа волокна могут быть все определены с точностью на основе их MyHC профиля. Кроме того другой тип быстро дергаться метаболически промежуточные волокна, тип IIX, были определены6. Гибридные волокон, выражая более чем одного MyHC были также подтверждено5,,78. Некоторые виды, такие как кошка и павиан известны не Экспресс тип IIB MyHCs6. Несмотря на то, что MyHC иммуноокрашивания в настоящее время состояние искусства оценки состава мышц, анализ данных, полученных через этот метод является громоздким и длительным без автоматизированной помощи. С этой целью горсть полу автоматизированных методов для анализа этих данных были развитые5,9,10. Здесь мы представляем относительно стандартный протокол для идентификации иммуногистохимических мышечных волокон типа5,,78,10, вместе с полуавтоматическим Роман алгоритм, который ускоряет анализ морфологии тип волокна и волокна с точностью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставили полезные направления для идентификации типов скелетных мышечных волокон. Поступая таким образом, мы опишем новый алгоритм для анализа данных.
Так как наши результаты во многом подтверждают те из предыдущих докладах5,8</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Фонду Бйотхер и Ассоциация боковой амиотрофический склероз (#17-II-344) за их поддержку этого исследования.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
