Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón
Summary
La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.
Abstract
Durante años, distinciones entre tipos de fibras de músculo esquelético se visualizaron mejor manchando de la miosina-ATPasa. Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX y fibras de tipo IIB ahora pueden ser identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC; sin embargo, manual análisis de estos datos puede ser lento y abajo-derecha tedioso. En este sentido, rápida y precisa evaluación de morfología y composición del tipo de fibra es una herramienta muy accesible. Aquí, presentamos un protocolo para la coloración de immunohistochemical de la estado-de-arte de MyHCs en secciones congeladas de músculo de ratón trasera junto con un algoritmo novela semi-automatizado que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra. Como era de esperar, el músculo de soleus muestra coloración para tipo I y tipo las fibras IIA, pero no para las fibras tipo IIX o tipo IIB. Por otro lado, el músculo anterior de tibialis fue compuesto predominante de fibras de tipo IIX y tipo IIB, una pequeña fracción de fibras de tipo IIA y poca o ninguna tipo I fibras. Varias transformaciones de imagen fueron utilizadas para generar mapas de probabilidad con el fin de medir diferentes aspectos de la morfología de la fibra (es decir, área de sección transversal (CSA), diámetro de Feret máximo y mínimo). Los valores obtenidos para estos parámetros entonces fueron comparados con los valores obtenidos manualmente. No hubo diferencias significativas se observaron entre ambos modos de análisis con respecto a la CSA, máxima o mínima diámetro de Feret (todos p > 0.05), indicando la precisión de nuestro método. Así, nuestro protocolo de análisis de inmunotinción puede aplicarse a la investigación de los efectos en la composición de músculo en muchos modelos de envejecimiento y miopatía.
Introduction
Se ha sabido por una cierta hora que músculo esquelético se compone de fibras individuales de muchos tipos1. Inicialmente, dos grupos de fibras se caracterizaron basado en sus propiedades contráctiles y llamado, apropiadamente, contracción lenta (tipo I) y de contracción rápida (tipo II). Estas categorías se distinguen sobre la base de metabolismo de la fibra. Desde el tipo I fibras son ricas en mitocondrias y dependen del metabolismo oxidativo, se aclarado por sólidamente positiva de nicotinamida-adenin-dinucleótido-tetrazolio reductasa (NADH-TR) diaphorase2 o Succinato deshidrogenasa (SDH)3 de tinción. Por el contrario, exhiben menor fibras de tipo II y grados variables de NADH-TR diaphorase o SDH la coloración y se dividieron en dos subgrupos de contracción rápida (tipo IIA y tipo IIB) algo crudamente basados en su relativa capacidad oxidativa. Estas distinciones entre las fibras han sido visualizadas más eficazmente por miosina-ATPasa la coloración donde el tipo I fibras de manchan oscuras después de una preincubación a pH 4.0 y fibras de tipo IIB absorben precipitado siguiente preincubación a pH 10.0 con fibras de tipo IIA la coloración intermedio4.
Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de fibra tipo5. Tipo I, tipo IIA y tipo IIB fibras pueden ser todos identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC. Además, otro tipo metabólico intermedio fibra de contracción rápida, tipo IIX, ha sido identificado6. Las fibras híbridas expresando más MyHC también han sido confirmados5,7,8. Algunas especies como el gato y el Babuino se saben expresa tipo IIB MyHCs6. Aunque MyHC inmunotinción es actualmente la evaluación de estado de la técnica de la composición del músculo, el análisis de los datos obtenidos mediante esta técnica es engorrosa y requiere mucho tiempo sin asistencia automática. Para ello, un puñado de métodos semiautomáticos para analizar estos datos han sido desarrollados5,9,10. Aquí, presentamos un protocolo relativamente estándar para la identificación inmunohistoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, junto con una novela semi-automatizada algoritmo que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra con precisión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos proporcionado una dirección útil para la identificación de tipos de fibras de músculo esquelético. De esta manera, se describe un nuevo algoritmo para el análisis de los datos.
Puesto que en gran parte, nuestros resultados los anteriores informes5,8,10 confirman y reflejan nuestras propias mediciones manuales, el algoritmo parece ser exacta. Aún así, nos encontramos con algunas tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Fundación Boettcher y la Asociación de Esclerosis Lateral Amiotrófica (#17-II-344) su apoyo a esta investigación.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
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