Summary
用于研究胚胎和围产期小鼠主动脉的协议使用在体内克隆分析和命运图, 主动脉外植体和孤立平滑肌细胞在这里详述。这些不同的方法有助于调查胚胎和围产期主动脉在正常发育和疾病的发病机制。
Abstract
主动脉是体内最大的动脉。主动脉壁由内皮细胞内层、交变弹性板中层和平滑肌细胞 (校董)、外层成纤维细胞和胞外基质组成。与广泛研究的病理模型 (例如,动脉粥样硬化) 在成人主动脉, 更少的是已知的胚胎和围产期主动脉。在这里, 我们专注于校董, 并提供协议, 分析胚胎和围产期主动脉校董在正常发育和疾病的发生和发病机制。具体来说, 包括的四项协议是: i)在体内胚胎的命运映射和克隆分析;二) 外植体胚胎主动脉培养;三) SMC 与围产期主动脉隔绝;和 iv) 皮下渗透 mini-pump 放置在怀孕 (或非) 小鼠。因此, 这些方法有助于调查的起源 (s), 命运, 和克隆结构的校董在主动脉在体内。他们允许通过持续接触药理学药物来调节胚胎主动脉形态的在子宫内。此外, 孤立的主动脉组织外植体或主动脉校董可用于在诸如 muscularization、增殖和迁移等基本过程中获得对特定基因靶点作用的洞察。这些假说生成实验的孤立校董和说明主动脉, 然后可以评估在体内的情况下, 通过药理和遗传方法。
Introduction
多细胞生物体的循环系统功能向不与外界环境接触的细胞输送养分和氧气, 并从这些细胞中去除废物和二氧化碳。在脊椎动物中, 初级循环系统由心脏组成, 它通过一系列血管泵血。大血管的壁, 如动脉和静脉, 由三层组成: i) 内皮细胞内膜, 或内部层;2) 培养基, 或中间层交替圆周细长平滑肌细胞校董和弹性片状;和 iii) 的膜, 或外层结缔组织和成纤维细胞。绝大多数的血管生物学研究集中在内皮细胞, 通过血管生成研究新的内皮细胞内衬管的形成。相比之下, 校董得到的关注相对较少。然而, 校董是一个关键的细胞类型, 在建设正常动脉壁和血管病理。
主动脉是体内最大口径的动脉, 接受心脏左心室的输出。它受到各种人类疾病的折磨, 包括动脉粥样硬化、动脉瘤和解剖。在成人机体中, 主动脉及其主要分支在血管疾病模型中得到了深入的研究。例如, 高脂肪饮食喂养小鼠是无效的基因编码低密度脂蛋白受体或载脂蛋白 E, 发展动脉粥样硬化, 和最近的命运测绘研究表明, 预先存在的校董产生多种细胞类型的动脉粥样硬化斑块1。在主动脉瘤中, 病理改变包括 SMC 细胞凋亡和细胞外基质重塑2,3。
在胚胎和围产期期间, 对 SMC 的形态发生和发病机制的认识显著减少。在这里, 我们提供了研究胚胎和围产期主动脉校董在体内, 组织外植体和孤立细胞的协议。例如, 该协议的第一部分揭示了胚胎小鼠的命运映射和克隆分析。重组在细胞特异启动子的控制下表达, 促进特定细胞及其子代的标记4,5,6;然而, 在小鼠胚胎发育过程中, 对细胞特异标记的时间控制可能具有挑战性。在这方面, 在校董 (例如, Myh11或Acta2) 和一个综合招聘报告员的 CreER 下, 我们提供了在怀孕的水坝中注射他莫昔芬或其活性代谢物 4-OH-苯氧胺的方法。用于分析胚胎或产后后代的标记细胞。此外, 与命运测绘研究, 这是以一个单一的记者荧光1,7, 克隆分析大大加强与多色综合招聘记者。
第二和第三部分的协议描述的方法, 分离和培养胚胎主动脉外植体和主动脉校董的新生儿, 分别。这些方法允许操纵信号通路, 特别是在主动脉外植体或校董, 并分析药物的直接作用。因此, 在兴趣组织中的特定基因的作用可以比传统的小鼠遗传操作更快速地进行筛选。此外, 孤立的 SMC 研究有助于分析细胞迁移和黏附, 这是技术上有限的在体内。
最后, 第四议定书部分划定了在怀孕 (或非) 小鼠体内装有药理剂的皮下渗透 mini-pump 的位置。这种方法有助于分析由于新陈代谢快而需要连续输液的药剂对胚胎发育的影响。经常注射的替代品对许多药物来说是不可行的, 应该避免, 因为它可能会在怀孕的大坝中造成严重的不适。
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Protocol
所有鼠标协议均由耶鲁大学机构动物保育和使用委员会批准.
1. 在体内 胚胎命运图和克隆分析
注意: 我们在发展和疾病模型中广泛使用这些方法来评估细胞的起源及其克隆结构 7 , 8 , 9 , 10 .
- 设置与 CreER 和小鼠之间的交配与一个综合招聘报告.
注: CreER 用于 SMC 标记;Myh11-CreERT2 或 Acta2-CreERT2 鼠标 11 , 12 通常用于此目的。我们使用了 ROSA26R-CreERT2 小鼠 13 来广泛标记胚胎组织。- 用于克隆分析, 请使用多色综合招聘报告员 ( 例如, 五彩纸屑或彩虹 [Rb] 鼠标) 8 , 14 , 15 和 "命运映射", 使用单色 ( 例如, ROSA26R-YFP 鼠标 16 ) 或色的记者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17 .
注: 此繁育方案使用 2-6 月大的成年小鼠 (一般为30克), 并将在 CreER 和一名综合招聘报告中生成胚胎.
- 用于克隆分析, 请使用多色综合招聘报告员 ( 例如, 五彩纸屑或彩虹 [Rb] 鼠标) 8 , 14 , 15 和 "命运映射", 使用单色 ( 例如, ROSA26R-YFP 鼠标 16 ) 或色的记者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17 .
- 使用金属探头在早上检查阴道插头, 并考虑在插头检测当天中午为胚胎日 (E) 0.5. 当检测到插头时,
- 将雌性与男性分开.
- 准备 4-OH-他莫昔芬和他莫昔芬工作解决方案。
- 为 4-OH-他莫昔芬, 溶解5毫克到50和 #181; l 100% 乙醇, 涡流为2分钟, 然后添加450和 #181; 玉米油的 l。在冰, 几种在输出水平2为十年代周期与休息在周期之间直到样品冷却下来。样品完全溶解后 (通常为 4-5 循环的超声), 采取200和 #181; l 声溶液, 溶解于1800和 #181; l 玉米油, 以使最终的工作解决方案 (4-OH-他莫昔芬, 1 毫克/毫升).
- 对于他莫昔芬, 在100% 乙醇和涡流中稀释到50毫克/毫升, 直到溶解为止。在玉米油中稀释, 使最终的工作溶液 (三苯氧胺, 10 毫克/毫升) 和搅拌45和 #176; C, 以确保它完全溶解.
- 早期胚胎诱导, 注入 4-OH-他莫昔芬腹腔到一个怀孕的大坝。
- 使用 4-OH-他莫昔芬注射液 (高达〜150和 #181; g 每怀孕的老鼠, 或大约5毫克/千克体重) 在 E5.5 和此后, 因为他们产生可行的大坝, 胚胎, 和幼崽.
- 用他莫昔芬在 0.5-1.5 毫克 (或 17-50 毫克/千克) 的情况下, 在 E9 和此后的胚胎中使用的水坝。使用30G 针进行所有注射.
#160; 注: 通过0.22 和 #181 过滤; m 过滤器通常用于在注射前对所有混合物进行消毒。和 #160;
- 用于克隆分析, 使用高剂量的腹腔注射 4-OH-他莫昔芬 (, 5 毫克/千克) 或他莫昔芬 (, 50 毫克/千克) 来标记多个细胞。
- 要标记单个单元格, 请滴定 4-OH-他莫昔芬或他莫昔芬的剂量, 这样, 在感兴趣的组织 ( 即, 主动脉) 中, 几乎所有的胚胎都被分析 (如下所述, 在本节末尾) 没有细胞标记或只有细胞单一颜色的;这是阈值剂量.
- 在中的妊娠期内标记细胞, 并追踪他们的命运或克隆在产后小鼠, 在怀孕的大坝的腹腔内注射孕酮伴随与他莫昔芬在 1:2 (孕酮: 他莫昔芬)剂量比.
注: 他莫昔芬的剂量是 17-50 毫克/千克和孕酮剂量是 8.5-25 毫克/千克 ( 即 , 他莫昔芬剂量的一半)。孕酮注射液可延迟分娩 1-2 天. - 安乐用一个开放滴法将大坝孕育在一个理想年龄的胚胎, 在那里, 大坝被放置在一个装有棉花或纱布的容器中, 用未稀释的异氟醚浸泡。通过打开胸腔以诱发气胸、切除重要器官和/或执行颈椎脱位确认死亡.
- 用70% 乙醇清洗腹部。用剪刀切开腹部, 解剖子宫。从子宫中取出胚胎, 用钳子将胚胎从胎盘和卵黄囊中仔细分离.
- 安乐 E15 或更年长的胚胎通过手术剪刀或锋利的刀片进行颈椎脱位或斩首.
注: 小于 E15 的胚胎在母亲的安乐死和/或从母体中取出胚胎后迅速死亡. - 将胚胎放在 ice-cold PBS 中, 用剪刀将一小片尾巴切开, CreER 和综合招聘报告员.
- 将4% 甲醛中的胚胎固定在4和 #176; C 为2小时. 在 pbs 中冲洗胚胎三次, 然后在30% 毫升的 pbs 中用15蔗糖孵育胚胎, 等待直到它们下沉, 这可能需要两天时间.
- 用最佳切削温度 (OCT) 化合物填充塑料冷冻模具, 最高可达到2/3 的最大水平。将每个胚垂直放置在模具中, 完全浸没在 OCT 中. 室温下孵育10分钟以最小化气泡.
- 将冰冻组织块直立在干冰中, 70% 乙醇浴冻结。将块存储在-80 和 #176; C.
- 将低温温度设置为-22 和 #176; C 和切口块通过整个主动脉、10-20 和 #181 来产生横截面; m 厚。在室温下将这些幻灯片在-80 和 #176 之前干燥30分钟; C.
- 在 RT 中对幻灯片进行解冻, 避免光的荧光。用 PBS-Tween20 0.1% 冲洗幻灯片。
- 进行克隆分析, 染色的幻灯片核 (DAPI, 5 毫克/毫升) 和直接图像其他荧光在彩虹综合招聘记者 (蔚蓝: 433 nm 激发最大, 475 nm 的排放量最大; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
- 使用以下过滤器来检测荧光与直立荧光显微镜: DAPI (励磁最大/带宽 350/50 nm, 发射最大/带宽 460/50 nm), 蔚蓝 (励磁436/20 毫微米, 放射480/40 毫微米), 得克萨斯红色 (励磁 560/40毫微米, 发射630/75 毫微米) 和自定义过滤器分离 mCherry 从 mOrange (励磁577/10 毫微米, 放射630/50 毫微米).
- 用于与 mTmG 的命运映射报告, 通过直接成像或使用免疫检测 GFP (484 nm, 510 nm)。为成像用直立的萤光显微镜使用 GFP 过滤器 (励磁470/40 毫微米, 放射525/50 毫微米).
- 对于免疫, 在4和 #176 的一夜之间孵育具有主抗体的切片, 在 PBS 中用 0.1% X-100, 然后用二次抗体孵育 1 h. 使用 anti-CD31 (最终浓度0.0016 毫克/毫升), 抗 GFP (0.006 毫克/毫升) 和Cy3-directly 共轭抗 SMA (1:500 最终稀释) 主要抗体和使用继 antibodies 直接共轭到荧光 (1:500 最后稀释) (请参见 材料表 ).
- 进行克隆分析, 染色的幻灯片核 (DAPI, 5 毫克/毫升) 和直接图像其他荧光在彩虹综合招聘记者 (蔚蓝: 433 nm 激发最大, 475 nm 的排放量最大; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
- 垂直荧光显微镜 (放大倍数: 4X-20X) 或共聚焦显微镜 (10X-63X) 的图像幻灯片。对于高放大率, 使用共聚焦成像63x 油目标, 数值孔径为 1.4-0.6, 帧大小为 1024 x 1024 像素.
2。外植体胚胎主动脉培养
注意: 此方法以前用于评估整合素 beta3 在说明的狭窄中的作用 民族解放军 (-/) 胚胎主动脉 9 , 18 .
- 安乐在 E15.5 上由过量的异氟醚吸入引起的定时怀孕的大坝, 如步骤1.8 所示. 根据以上步骤 1.9-1.10,
- 收获和安乐胚胎.
- 将胚胎仰并将伸展的四肢固定在解剖板上。可视化解剖立体和使用剪刀切割从腹部垂直切口通过胸骨的上部胸部。切除胸腺、气管、肺部、食道、肝脏和肠道.
- 用镊子轻轻拉心腹, 用剪刀解剖主动脉, 远离胸腔和腹腔的背侧。释放主动脉, 在近端根部和远端腹部位置切开.
- 在细胞培养罩中将主动脉置于 ice-cold 无菌 PBS 中。转移主动脉到一个24井板和文化它在 DMEM 与 0.5% FBS 为 24 h 在37和 #176; C.
注: 培养基可辅以阻断抗体 ( 例如, anti-integrin 和 #945; v 和 #946; 3 抗体 at 0.02 毫克/毫升 9 ; 查看 材料表 ) 或药理剂. - 用 PBS 清洗主动脉两次, 然后用4% 甲醛20分钟来修复它.
- 用 pbs 冲洗三次, 并将主动脉转移到1.5 毫升的导管, 在 pbs 中使用30% 蔗糖。主动脉下沉后, 按照上面的步骤 1.13-1.15 所述, 制作冰冻组织块、切片和免疫.
3。SMC 与围产期主动脉的分离
注意: 该方法目前正被用于比较来自 民族解放军 (-) 和野生围产期小鼠的主动脉校董的生物学.
- 安乐在出生后的一天 (P) 0.5, 如上文步骤1.10 所述, 由颈椎脱位或用手术剪刀或锋利的刀片斩首.
- 执行步骤 2.3, 然后在打开胸腔和腹部后, 用23G 针穿刺左心室。使用塑料管将针头与无菌的 pbs 注射器相连, 垂直放置在高架位置, 以便 pbs 以重力的状态流入左心室。允许将无菌 PBS 注入左心室, 直到肝脏 blanches。
- 使用镊子去除主动脉外侧的外组织, 并按照步骤2.4 中的描述对主动脉进行解剖.
- 在 DMEM (500 和 #181; L) 的单个解决方案中, 使用 225 u/毫升胶原酶, 2.25 u/毫升弹性蛋白酶, 和1x 抗生素-抗, 在37和 #176 中进行45分钟的补充; c. 手动摇动管每 5-10 min.
- 在无菌细胞培养罩中, 通过移200和 #181, 将经消化的组织 titurate; L 吸管生成单细胞悬浮液。将单细胞悬浮液转移到15毫升的管中, 加入2毫升的 DMEM, 并在 920 x g 离心5分钟, 在25和 #176; C.
- 丢弃上清。重3毫升的 SMC 培养基 (DMEM 10% FBS 补充1和 #181; g/毫升 rhFGF, 10 和 #181; g/毫升肽, 100 U/毫升青霉素/链霉素, 和2.5 和 #181; g/毫升两性霉素 B)。转移到一个35毫米的文化板块.
注意: 在最初的隔离, 〜40万细胞是从一个单一的 P0.5 野生主动脉;这些细胞中有30万是校董的. - 将单元格培养为37和 #176; C 每3天更换为新鲜的 SMC 培养基。使用标准技术与胰蛋白酶, 通过细胞时汇合。对于实验, 使用 3-7 通道中的单元格.
4。皮下渗透微型泵在妊娠 (或非怀孕) 小鼠中的放置
注意: 此方法以前用于持续提供药理剂 (如: "整合素和 #946; 3 和 #946; 5 抑制剂cilengitide) 到胚胎 在子宫内 9 。泵入到怀孕的水坝在 E13 . 5 和保持直到分娩 .
- 麻醉 2-5% 异氟醚在氧气中的小鼠 (流量为1升/分) 用于诱导和1-3% 的维护。使用脚趾捏反射来监测麻醉的水平, 并根据需要调整麻醉剂。管理皮下丁丙诺啡 (0.05-0.1 毫克/千克) 镇痛.
- 用快船刮下背部。在手术中使用无菌窗帘、手套和器械, 并在加热手术盘上维护小鼠.
- 将每只老鼠放在俯卧位置, 用控告后再用异丙醇擦洗背部。大约 3-5 cm 侧到尾巴的底部在下背部, 使用手术刀, 使水平皮肤切口 0.5-1.0 厘米的长度, 而不伤害部下的肌肉.
- 插入一个止血到切口, 并创建一个皮下口袋 rostrally 泵植入通过开放和关闭止血颌骨.
- 根据制造商和 #39 的指导原则 (请参阅 材料表 ), 以选择的代理填充渗透 mini-pump。将填充泵插入口袋, 然后用夹子或6-0 吸收缝合线关闭切口。确保手术总时间少于10分钟.
- 手术后, 监测小鼠每15分钟, 直到他们已经从胸骨卧床恢复。管理皮下丁丙诺啡 (0.05-0.1 毫克/千克) 每 6-12 小时为 48 h。当老鼠完全从全身麻醉中恢复过来时, 每天都要监测它们。删除剪辑或缝合线 7-10 天后.
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Representative Results
在一个代表性的克隆分析校董的胚胎突变为民族解放军(基因编码细胞外基质蛋白弹性),民族解放军(+/-), Acta2-CreERT2 小鼠交配的民族解放军(+/-)鼠也携带多色 ROSA26R(rb/rb) 记者。如步骤1所述, 插头被检查, 怀孕的水坝是诱发了一个单一的他莫昔芬注射液 (1.5 毫克) 在 E12.5, 他们牺牲在 E18.5。胚胎被收割、固定、冷冻和基因。横降主动脉 cryosections 切除。从民族解放军(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb/+) 胚胎的部分显示, 在民族解放军-null 小鼠 (从 E15.5 后开始) 累积的过量内层校董是由多种颜色标记的 (图 1)因此, 从多个α-平滑肌肌动蛋白 (SMA) 的+细胞 E12.5。在 E12.5 主动脉中, SMA+单元格仅限于膜介质。
要生成民族解放军(-) 胚胎脉为外植体, 男性和女性民族解放军(+/-) 小鼠交配。使用步骤2中描述的方法, 检查插头并将民族解放军(+/-) 水坝牺牲在 E15.5。脉被分离了从民族解放军(-) 胚胎和培养0或 18 h 存在 anti-integrin β3阻断抗体或 IgG1 控制。脉, 然后固定, 冷冻, 和 cryosectioned, cryosections 被染色 SMA (SMC 标记), CD31 (内皮细胞标记), 和细胞核 (DAPI) (图 2)。结果表明, 在18小时的培养, E15.5民族解放军(-) 主动脉成为 hypermuscular 和狭窄。这个过程被一个 anti-integrin 的β3阻断抗体衰减。
校董 P0.5 野生小鼠主动脉分离。如步骤3所述, 校董被分离, 从解剖新生儿主动脉的酶消化和培养。细胞被传代, 和通道3细胞染色的 SMC 标记 (即, SMA, 平滑肌肌球蛋白重链 (SMMHC), 或 transgelin (也称为 SM22α)), CD31 和核 (DAPI) (图 3)。大多数培养细胞表达 SMC 的标记, 但不是 CD31。
为了评价整合素β3的药理抑制作用是否能减轻民族解放军(-) 主动脉体内的 hypermuscularization 和狭窄, 我们不断注入抑制剂 cilengitide, 因为它的半衰期很短。在血浆中。民族解放军( ++ / − ) 雄性和雌配 , 如步骤 4 所述 , 在 E13 . 5 的怀孕大坝中植入 cilengitide 的渗透 mini - pumps 。在 P0.5, 对幼崽进行了安乐死和基因, 并对其脉进行了分析。在不改变野生主动脉9的情况下, Cilengitide 治疗可显著减轻民族解放军(-) 小鼠 (图 4) 的主动脉狭窄和 hypermuscularization。因此, anti-integrin β3是一种潜在的有前途的无创治疗弹性蛋白 aortopathy 的方法。
图 1.民族解放军(--) 主动脉中的过量校董来自多个预先存在的校董.大坝怀孕与民族解放军(-), Acta2-CreERT2 胚胎也携带多色综合的记者ROSA26R(Rb/+) 是诱导与单腹腔注射的他莫昔芬 (1.5 毫克) 在 E12.5。在 E18.5, 对脉的横断面进行了分析, 并对 DAPI 和 Rb 色素、蔚蓝 (Cer)、mCherry (mCh) 和 mOrange (mOr) 的直接荧光进行了染色。过量的校董堆积在民族解放军的内部方面-E15.518之后的空主动脉。多余的内层校董包括多个颜色 (星号) 的单元格, 表示 polyclonality。吕, 主动脉腔。缩放栏, 10 µm. 转载自 Misra et al., 20169。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.Anti-αvβ3整合素阻断减轻了民族解放军(-) 主动脉外植体的 Hypermuscularization 和狭窄。在 E15.5, 怀孕的水坝被安乐死, 并脉了民族解放军(-) 胚胎的收获。在固定前18小时, 在同种控制 IgG1 或整合素αvβ3阻断抗体的存在下, 分离的脉要么立即修复, 要么被培养。固定脉为 CD31、SMA 和核 (DAPI) 染色。吕, 主动脉腔。缩放栏, 100 µm. 转载自 Misra et al., 20169。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.从新生小鼠中分离和培养的主动脉校董表达平滑肌标记.校董从 P0.5 幼崽中分离出来, 并被培养。第三通道的细胞是固定和染色的 CD31 (EC 标记), 细胞核 (DAPI), 和 SMC 标记 (SMA, SM22α, 或 SMMHC, 如所示)。这一分析表明, 90% 的培养细胞表达 SMC 标记, 没有观察到表达 CD31。标尺, 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.连续输注的 Cilengitide在体内减轻了民族解放军(-/) 主动脉 Hypermuscularization 和狭窄.男性和女性民族解放军(+/-) 鼠标交叉。整合素β3抑制剂 cilengitide 或车辆 (PBS) 不断注入在怀孕大坝使用渗透 mini-pumps 从 E13.5 开始。P0.5 的横断面为 SMA (红色)、CD31 (白色) 和细胞核 (DAPI、蓝色) 染色。吕, 主动脉腔。刻度条, 100 µm。> 请点击这里查看这个数字的一个更大的版本。
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Discussion
与大鼠主动脉及其主要分支在成人病理条件下, 如动脉粥样硬化模型的广泛研究不同, 对胚胎和围生期主动脉的形态发生和发病机制的了解较少。在这里, 我们专注于胚胎/围产期主动脉, 特别是校董, 并提供协议, 以研究主动脉通过在体内, 组织外植体, 和 SMC 隔离方法。这些免费的方法为研究者提供了不同的方法来研究胚胎/围产期主动脉。
克隆分析是一种非常强大的方法, 它允许人们研究单个细胞的行为。我们最近使用这种方法来帮助识别肺血管中的专业校董10。重要的是要认识到, 在一个单独的鼠标携带多色综合招聘记者, 有一个机会, 相同颜色的细胞可以从一个以上的重组事件派生。因此, 用多色记者进行克隆分析, 需要对许多小鼠进行评价。因为在中妊娠期的他莫昔芬可以干扰分娩, 对于在中妊娠期内标记细胞和追踪他们后天、孕酮和他莫昔芬的实验, 应同时注射。与胚胎中的协议类似, 成年小鼠的命运图和克隆分析可以在成人腹腔注射他莫昔芬的情况下进行。
校董用小鼠携带转基因的克隆分析和命运图, 在平滑肌中增强活性的促进剂的作用下, 重组的表达。在这里, 我们描述的协议使用鼠标携带条件转基因Myh11-CreERT2 或Acta2-CreERT2。Myh11 是校董19的最具体的标记;然而, 它是 downregulated 在民族解放军(-) 主动脉9。Acta2 是用校董表示的, 包括那些民族解放军-空主动脉, 但它不是具体的, 因为它也用其他的细胞类型表达。如果这些条件转基因是 "漏" (即,在没有他莫昔芬的情况下诱导重组), 可能会有问题, 因为实验不会描绘细胞标记的时间。对这些转基因的泄漏进行了分析, 评估β-乳糖活动的小鼠携带 lacZ-based 综合招聘记者和Myh11-CreERT2 或Acta2-CreERT2 以下车辆处理 (即, 在没有他莫昔芬感应)11,12。基于这种分析, 这些转基因被认为是不漏水的。
Hypermuscularization 是人类多发性血管病变的特点。例如, 上主动脉狭窄 (SVAS) 是一种破坏性的先天性疾病, 其特点是由于过量的校董而导致大、中型动脉阻塞. SVAS 的结果从一个位基因的丧失功能的民族解放军基因并作为一个孤立的实体发生, 或更常见的, 作为威廉姆斯-蒙塔涅德博伊伦综合征的一部分20,21,22,23,24。民族解放军(-) 突变小鼠 phenocopy 主动脉表型的许多方面 SVAS18,21,22。从民族解放军(-) 的主动脉外植体在培养过程中迅速被阻断, 而来自野生胚胎的外植体仍然是专利的9,18。主动脉外植体的方法, 促进筛选的代理, 衰减狭窄的弹性蛋白 aortopathy9。然而, 这种方法并没有考虑到在身体中主动脉所受的机械或物理力。因此, 在主动脉外植体筛查中的阳性命中应与在体内民族解放军突变的小鼠模型进行评估。
SMC 隔离协议是一种快速、稳健的方法, 可以从围产期小鼠主动脉中获得校董。类似的方法可以外推, 以隔离校董从成年老鼠。由于其相对较大的大小, 成人主动脉可以纵向开放, 膜和内皮细胞解剖。为了评估从围产期或成人主动脉分离出来的细胞的纯度, 必须检查 SMC 标记的表达 (例如, SMMHC、smoothelin、SM22α和 SMA), 以及缺乏内皮细胞标记物的表达 (例如,CD31 和血管内皮钙黏蛋白)。一种潜在的替代隔离方法是使用流式细胞术分离荧光标记校董从解剖主动脉。携带荧光综合招聘报告的小鼠和Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2, 或Tgln-综合招聘可用于荧光标签校董11,12,25, 26,27。另外, 现有的转基因小鼠与 SMA 启动子驱动的表达荧光 (即, GFP, mCherry, 或 RFP) 可以使用28,29,30。
植入式渗透 mini-pumps 用于为实验动物提供持续的药理制剂。我们已经在 E13.5 的孕鼠体内植入了 mini-pumps, 以便在妊娠期余下的时间9中向发育中的胚胎提供药物。为了达到胚胎, 这些药物必须能够通过血-胎盘屏障。一般来说, mini-pumps 是很好的耐受性, 鉴于感染率低, 不推荐常规抗生素。伤口裂开是罕见的;但是, 如果检测到大于4毫米的开裂, 则应 re-anesthetized, 并用外科缝合线再次清洗和闭合。
这项工作描述了一种医疗的方法, 可用于研究在发育过程中的胚胎和围产期主动脉壁的正常形成, 以及在这一进程的扰动后, 在疾病期间。此外, 这些协议可用于研究成人主动脉的维护和疾病。方法可以外推到其他血管, 以及平滑肌肉涂层的血管结构, 如胃肠道或肺气管。最后, 类似的技术可以用于研究校董以外的细胞类型, 如内皮细胞或成纤维细胞, 以及这些细胞类型和校董之间的相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢李院长分享他的实验室的主动脉 SMC 隔离协议。资助由国立卫生研究院 (R21NS088854、R01HL125815 和 R01HL133016 博士 G)、美国心脏协会 (补助金14GRNT19990019 至 D.M.G.) 和耶鲁大学 (布朗-柯克斯奖学金提供给上午和启动资金 D.M.G.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
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