Summary
Протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной мышиных аорты, используя в vivo Клональный анализ и сопоставление судьба, аорты эксплантов и изолированных гладких мышц, которые подробно клетки здесь. Эти разнообразные подходы облегчить расследование морфогенеза эмбриональных и перинатальной аорты в нормальное развитие и патогенезе заболеваний.
Abstract
Аорты является крупнейшим артерий в организме. Аорты стена состоит из внутреннего слоя эндотелиальных клеток, средний слой знакопеременных упругих ламелей и гладкомышечные клетки (SMCs) и наружный слой фибробластов и внеклеточного матрикса. В отличие от широко распространенной изучение патологических моделей (например, атеросклероз) в взрослых аорты гораздо меньше известно о эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь, мы ориентируемся на SMCs и предоставить протоколы для анализа Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной aortic SMCs нормального развития и болезней. В частности, являются четыре протоколы включены: я) в естественных условиях эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ; II) экспланта эмбриональных аорты культуры; III) SMC изоляции от перинатальной аорты; и iv) подкожной осмотического мини-насос размещение в беременных (или небеременных) мышах. Таким образом эти подходы облегчить расследование origin(s), судьба и клоновых архитектуры SMCs в аорте в естественных условиях. Они позволяют для плавного эмбриональных аорты морфогенеза в утробе матери , продолжительное фармакологических агентов. Кроме того изолированные аорты ткани эксплантах или aortic SMCs может использоваться для получения понимание роли конкретных генов цели во время основных процессов, таких как muscularization, распространением и миграции. Эти гипотезы генерации эксперименты на изолированных SMCs и explanted аорты затем может оцениваться в контексте в естественных условиях через фармакологических и генетических подходов.
Introduction
Сосудистой системы многоклеточных организмов функции для доставки питательных веществ и кислорода к клеткам, которые не контакт с внешней окружающей среды и удаления отходов и диоксида углерода из этих клеток. В позвоночных первичной сердечно-сосудистой системы состоит из сердца, которые насосы крови через серию кровеносных сосудов. Стены из крупных кровеносных сосудов, артерий и вен, состоят из трех слоев: я) интима, или внутренний слой эндотелиальных клеток; II СМИ, или средний слой чередующихся окружности удлиненные гладкомышечные клетки SMCs и упругие ламели; и iii) адвентиции или наружный слой соединительной ткани и фибробластов. Подавляющее большинство исследований в сосудистая биология сосредоточиться на эндотелиальных клеток, расследование формирования новой эндотелиальных клеток выстроились трубок по ангиогенез. В сравнении SMCs получают относительно мало внимания. Однако SMCs являются тип критической ячейки в строительстве нормальной артериальной стенки и в сосудистой патологии.
Аорты является крупнейшим калибр артерий в организме, получении сердечного выброса из левого желудочка сердца. Она страдает от различных заболеваний человека, включая атеросклероз, аневризма и рассечение. В взрослых организмов аорты и ее ветвей крупных интенсивно учился в модели сосудистых заболеваний. Например, высоким содержанием жиров кормили мышей, которые являются null для кодирования рецепторов липопротеинов низкой плотности или аполипопротеин E, ген развитие атеросклероза, и недавние судьба сопоставления исследования показывают, что существующие SMCs порождают множественные типы клеток в 1атеросклеротических бляшек. В аневризмы аорты патологические изменения включают SMC апоптоза и внеклеточного матрикса, Ремоделирование2,3.
Значительно меньше известно относительно SMC морфогенеза и патогенез периоды эмбрионального и перинатальной. Здесь мы предоставляем протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной аорты SMCs в естественных условиях, в ткани эксплантов и изолированных клеток. Например первый раздел протокола определены судьба сопоставления и Клональный анализ в эмбриональных мышей. CRE рекомбиназа выразил под контролем клетки конкретной промоутера облегчает маркировка отдельных ячеек и их потомства4,5,6; Однако временной контроль клеток конкретных маркировки может быть сложным во время эмбрионального развития у мышей. В этом контексте с эмбрионами, выражая условного CreER под промоутер активно SMCs (e.g.,Myh11 или Acta2) и Cre репортер, мы предоставляем методы для инъекций тамоксифен или его активный метаболит 4-OH-тамоксифен в беременных плотин и для анализа помечены клетки эмбрионов или послеродовой потомство. Кроме того в отличие от судьбы картографические исследования, которые преимущественно используют Cre Репортеры с один репортер Флюорофор1,7, Клональный анализ существенно повышается с многоцветной Cre журналистами.
Второго и третьего протокола описаны методы для изоляции и культивировании эмбриональных эксплантов аорты и аортального SMCs от новорожденных, соответственно. Эти подходы позволяют для манипулирования сигнальных путей, специально в аортальной эксплантов или SMCs и для анализа прямых последствий фармакологических агентов. Таким образом роль конкретных генов в тканях интерес может проверяться в гораздо более быстрой моды чем через традиционные генетические манипуляции в мышах. Кроме того отдельные исследования SMC облегчить анализ миграции клеток и адгезии, которые технически являются ограниченными в естественных условиях.
Наконец в четвертом разделе протокол очерчивает размещения подкожной осмотического мини-насос, загружен с фармакологическими агентами в беременных (или небеременных) мышах. Этот метод облегчает анализ воздействия на эмбриональное развитие, вызванные агентов, которые требуют постоянного притока из-за быстрого метаболизма. Альтернатива частые инъекции не является практичным для многих агентов и следует избегать, так как это может вызвать значительный дискомфорт в беременных дам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все протоколы мыши утверждаются институциональный уход животных и использования Комитетом в Йельском университете.
1. In Vivo эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ
Примечание: мы использовали эти подходы широко для оценки происхождение клеток и их клоновых архитектуры в модели развития и болезней 7 , 8 , 9 , 10.
- создана спаривания между мышей с CreER и мышей с репортером Cre.
Примечание: CreER используется для SMC маркировки; Myh11-CreERT2 или Acta2-CreERT2 мышей 11 , 12 обычно используется для этой цели. Мы использовали ROSA26R-CreERT2 мышей 13 широко маркировки эмбриональных тканей.- Для Клональный анализ, использовать многоцветные Cre репортер (например, конфетти, или Радуга [Rb] мышей) 8 , , 14 15 и судьба картирования, использовать одноцветный Cre репортер (например, ROSA26R-рекламы ЯФП мышей 16) или двойной цвет Cre репортер ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG)- 17.
Примечание: Эта схема разведения использует взрослых мышей, которые 2-6 месяцев (обычно ~ 30 g) и будет генерировать эмбрионов с CreER и репортер Cre.
- Для Клональный анализ, использовать многоцветные Cre репортер (например, конфетти, или Радуга [Rb] мышей) 8 , , 14 15 и судьба картирования, использовать одноцветный Cre репортер (например, ROSA26R-рекламы ЯФП мышей 16) или двойной цвет Cre репортер ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG)- 17.
- Проверить вагинальных свечей в утром, используя металла зонда и рассмотреть полдень на день обнаружения вилка как эмбриональные день (E) 0,5.
- Отдельные женщины от мужчины при обнаружении вилкой.
- Подготовка 4-OH-тамоксифен и тамоксифен рабочие решения.
- Для 4-OH-тамоксифен, растворяют 5 мг в 50 мкл, 100% этанола, вихревые для 2 мин и затем мкл 450 кукурузного масла. На льду sonicate на 2 уровне вывода для 10 s циклов с отдыха между циклами до тех пор, пока образец охлаждает вниз. После того, как образец полностью не растворится (обычно ~ 4-5 циклов sonication), Возьмите 200 мкл sonicated раствора и растворить в 1800 мкл кукурузного масла, чтобы сделать окончательный рабочий раствор (4-OH-тамоксифен, 1 мг/мл).
- Для тамоксифен, разбавляют до 50 мг/мл в 100% этанола и вихревой до тех пор, пока она растворяется. Разбавляют в кукурузном масле, чтобы сделать окончательный рабочий раствор (тамоксифен, 10 мг/мл) и перемешать в 45 ° C, чтобы обеспечить, что он полностью не растворится.
- Для ранних эмбриональных индукции, придать 4-OH-тамоксифен внутрибрюшинно беременных дам.
- Использовать 4-OH-тамоксифен инъекции (до ~ 150 мкг на беременных мышь, или примерно 5 мг/кг массы тела) на E5.5 и в дальнейшем, поскольку они дают жизнеспособные плотины, эмбрионы и детенышей.
- Использование тамоксифен в дозах 0,5 - 1,5 мг (или 17-50 мг/кг) для плотин беременных с эмбрионами в ~ E9 и в последующий период. Используйте иглой 30G для всех инъекций.
Примечание: Фильтрации через фильтр 0,22 мкм обычно используется для стерилизации все смеси до инъекции.
- Для Клональный анализ, используйте внутрибрюшинной инъекции высоких доз 4-OH-тамоксифен (например, 5 мг/кг) или тамоксифен (например, 50 мг/кг) для обозначения нескольких ячеек.
- Отметить отдельные ячейки, титровать вниз дозы 4-OH-тамоксифен или тамоксифен, таким образом, что в тканях интереса (то есть, аорты), почти все эмбрионы, проанализированы (как описано ниже в конце данного раздела) имеют либо не помечены и только ячейки одного цвета; это порог дозы.
- Отметить ячейки в середине конце гестационного периода и проследить их судьбе или clonality в постнатальном мыши, привнести прогестерона в полость внутрибрюшинного беременных дам сопутствующе обстоятельств тамоксифен в 1:2 (прогестерон: Тамоксифен) соотношение доза.
Примечание: Тамоксифен дозы 17-50 мг/кг и прогестерон дозы 8,5-25 мг/кг (т.е., половина тамоксифен доз). Прогестерон инъекции может задержать труда ~ 1-2 дней. - Euthanize плотины, беременных с эмбрионами желаемый возраст с помощью метода открытой падения, где плотина помещается в сосуд, содержащий хлопка или марлей смоченной неразбавленный изофлюрановая. Подтвердить смерть, открыв грудную полость побудить пневмоторакса, удалив жизненно важных органов или выполняя шейки матки вывихов.
- Очистить живота с 70% этиловом спирте. Используйте ножницы, чтобы разрезать живот и вскрыть вне матки. Удалите из матки эмбрионы и осторожно отделить эмбрионы от плаценты и желточного мешка, используя пинцет.
- Усыпить эмбрионов в E15 или старше, выполняя шейки матки вывих или обезглавливание с Ножницы хирургические или острым лезвием.
Примечание: Эмбрионов моложе E15, быстро умирают после эвтаназии матери и/или удаление эмбрионов от матери. - Эмбрионы в ледяной PBS и вырезать небольшой кусок хвост с помощью ножниц в генотипе CreER и Cre репортером.
- Исправить эмбрионов в параформальдегида 4% на 4 ° C на 2 ч. мыть эмбрионов три раза в PBS и затем инкубировать эмбрионов в 30% сахарозы в ФБР в 15 мл трубки, ожидание до тех пор, пока они раковины, которые может занять до двух дней и.
- Заполнения пластиковые замораживание формы до 2/3 максимального уровня с оптимальной резки температуры (OCT) соединения. Место каждого эмбриона вертикально в плесени, полностью погружен в инкубировать Окт 10 мин при комнатной температуре (RT) для сведения к минимуму пузыри.
- Место замораживание блоков ткани upright в сухой лед, 70% этанол ванна для замораживания. Храните блоков на -80 ° C.
- Установите криостата температуру до-22 ° C и вырезать блоков для создания поперечных секции через весь аорты, толщиной 10-20 мкм. Сухие слайды в РТ за 30 мин до их хранение на -80 ° C.
- Оттепель слайды на RT, защищенном от света во избежание обесцвечивания флуорофоров. Вымойте слайды с PBS-Tween20 0,1%.
- Для Клональный анализ, пятно слайды для ядер (DAPI, 5 мг/мл) и непосредственно изображения других флуорофоров в Rainbow Cre репортер (Церулеан: 433-Нм возбуждения Макс, 475 Нм выбросов Макс; mOrange: 548 Нм, 562 Нм; mCherry: 587 Нм, 610 Нм).
- Используйте следующие фильтры для обнаружения флуорофоров с вертикально флуоресцентный микроскоп: DAPI (возбуждения Макс/пропускания 350/50 Нм, выбросов Макс/пропускная способность 460/50 Нм), Лазурный (возбуждения 436/20 Нм, выбросов 480/40 Нм), Техас красный (возбуждения 560 / 40 Нм, выбросов 630/75 Нм) и настраиваемый фильтр, чтобы отделить mCherry от mOrange (возбуждения 577/10 Нм, выбросов 630/50 Нм).
- Для сопоставления судьбу с mTmG Cre репортер, обнаружить GFP (484 Нм, 510 нм), либо непосредственно изображений или с помощью иммуноокрашивания. Для изображений с вертикально флуоресцентный Микроскоп использовать фильтр GFP (возбуждения 470/40 Нм, выбросов 525/50 Нм).
- Для иммуноокрашивания, инкубировать секции с первичных антител на ночь при 4 ° C, мыть с 0,1% тритон X-100 в PBS и затем инкубации с вторичные антитела на 1 ч. использование анти CD31 (конечная концентрация 0,0016 мг/мл), анти GFP (0,006 мг/мл) и Cy3-непосредственно конъюгированных анти SMA (окончательное разведение 1: 500) первичных антител и использование вторичных antibodies, непосредственно конъюгированных флуорофоров (окончательное разведение 1: 500) (см. Таблицу материалы).
- Для Клональный анализ, пятно слайды для ядер (DAPI, 5 мг/мл) и непосредственно изображения других флуорофоров в Rainbow Cre репортер (Церулеан: 433-Нм возбуждения Макс, 475 Нм выбросов Макс; mOrange: 548 Нм, 562 Нм; mCherry: 587 Нм, 610 Нм).
- Изображения слайдов с вертикально флуоресцентный микроскоп (увеличение: 4 X - 20 X) или конфокального микроскопа (10 X-63 X). Для большого увеличения, используйте конфокальный изображений 63 x нефти цель с числовой апертуры 1.4-0,6 и размер кадра 1 024 x 1 024 пикселей.
2. Explant эмбриональных аорты культуры
Примечание: этот подход использовался ранее для оценки роли Интегрин beta3 в стеноз описаны АНО (- / -) эмбриональных аорто- 9 , 18.
- усыпить приурочен беременных плотины на E15.5 при вдыхании избыток изофлюрановая, в соответствии с шагом 1.8, выше.
- Урожай и усыпить эмбрионы, согласно шаги 1.9-1.10, выше.
- Supinely положение эмбриона и ПИН-кода расширенного конечностей в Правление рассечение. Визуализация с стереоскоп диссекции и используйте ножницы, чтобы вырезать вертикальный разрез от живота через грудины к верхней грудной клетки. Вскрыть прочь тимуса, трахеи, легких, пищевода, печени и кишечника.
- Осторожно потяните сердце вентрально с помощью щипцов и используйте ножницы, чтобы вскрыть аорты от спинной части грудной и брюшной полостей. Чтобы освободить аорты, сократить его в корне проксимальных и дистальных брюшной позиций.
- Место аорты в ледяной стерильные PBS в капюшоне культуры клеток. Передавать 24-ну плита аорты и культура в среде DMEM с 0,5% FBS для до 24 ч при 37 ° C.
Примечание: Питательной среды могут быть дополнены блокирующих антител (например, анти Интегрин αvβ3 антитела на 0,02 мг/мл 9; см. Таблицу материалов) или агента фармакологических. - Вымойте аорты дважды с PBS и затем исправить ее с параформальдегида 4% за 20 мин.
- Мыть в три раза с PBS и передачи аорты в 1,5 мл 30% сахарозы в ФБР. После того, как раковины аорты, сделать блоков замороженные ткани, вырезать секции и имунноконтраст, как описано в шагах 1.13-1,15, выше.
3. SMC изоляции от перинатальной аорты
Примечание: этот подход в настоящее время используется для сравнения биологии aortic SMCs изолированы от АНО (- / -) и wildtype перинатальной мышей.
- Euthanize, мышиных pup на послеродовой день (P) 0.5, либо путем шейки матки дислокации обезглавливание с Ножницы хирургические или острым лезвием, как описано в шаге 1.10, выше.
- Выполнить шаг 2.3 и затем, после открытия грудной клетки и живота, пункции левого желудочка с иглой 23G. Использование пластиковых труб для подключения иглы к стерильный шприц PBS-содержащих провел вертикально на возвышенности так что PBS впадает в левого желудочка под действием силы тяжести. Разрешить вливание стерильных PBS в левый желудочек, до тех пор, пока печень бланша.
- Использовать щипцы для удаления adventitial ткани на внешней стороне аорты и вскрыть аорты, как описано в шаге 2.4.
- Дайджест аорты в единое решение DMEM (500 мкл) дополнены 225 ед/мл коллагеназы, 2,25 эластазы ед/мл и 1 x противогрибковое антибиотик-для 45 минут при 37 ° C. вручную трясти трубку каждые 5-10 мин
- В стерильных клетки культуры Гуд, titurate усваивается ткани, закупорить вверх и вниз с 200 мкл пипетки для создания одной ячейки подвеска. Передавать подвеска одноклеточного до 15 мл, добавить 2 мл DMEM и центрифуги на 920 x g 5 мин 25 ° C.
- Удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл SMC питательной среды (DMEM, содержащие 10% FBS дополнена rhFGF 1 мкг/мл, 10 мкг/мл rhEGF, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицин B). Трансфер в 35-мм культуры тарелку.
Примечание: После первоначального изоляции, ~ 400000 клетки получены от одного P0.5 wildtype аорты; ~ 300 000 этих клеток являются SMCs. - Культура клетки при 37 ° C и изменить на свежие SMC культуры среднего каждые 3 дня. С помощью стандартных методов трипсином, проход клетки когда вырожденная. Для экспериментов, использовать клетки из отрывков 3-7.
4. Подкожной осмотического мини-насос размещение в беременных женщин (или Non беременных) мышах
Примечание: этот подход использовался ранее постоянно доставить фармакологических агентов (например, Интегрин β3 и β5 ингибитор cilengitide) до эмбриона в утробе матери 9. Насос был вставлен в беременных дам в E13.5 и до отела.
- Анестезировать мышей с изофлюрановая 2-5% кислорода (скорость потока 1 Л/мин) для индукции и 1-3% за обслуживание. Позволяет контролировать уровень анестезии рефлекс мыс щепотка и настройте агент анестезии при необходимости. Администрировать подкожной бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг) для анальгезии.
- Бритья нижней части спины с садовыми ножницами. Используйте стерильные шторы, перчатки и инструменты и поддерживать мышей на нагревательной пластинки хирургические во время операции.
- Место каждой мыши в лежачем положении и скраб спину betadine, следуют изопропиловый спирт. Приблизительно 3-5 см ростральной к основанию хвоста в нижней части спины, использовать скальпель сделать горизонтальный разрез 0,5 - 1,0 см в длину без ранив основные мышцы.
- Вставить кровоостанавливающий в разрез и создание подкожной карман рострально для имплантации насоса путем открывания и закрывания челюстей кровоостанавливающий.
- Заполнить осмотического мини-насос с агентом по выбору, в соответствии с производителем ' s руководящие принципы (см. Таблицу материалов). Вставьте заполненный насоса в карман и закрыть разрез с зажимами или 6-0 не рассасывающиеся швы. Убедитесь, что общее время хирургических находится менее чем в 10 минутах
- Постоперационно, контролировать мышей каждые 15 мин, до тех пор, пока они оправились от грудины recumbency. Администрировать подкожной бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг) каждые 6-12 ч в течение 48 часов. Когда мышей полностью оправились от общей анестезии, наблюдать за ними ежедневно. Удалять клипы или зашивает 7-10 дней после операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель клоновых анализа SMCs в мутанта эмбрионов для АНО (ген кодирования белков эластина внеклеточная матрица), АНО(+/-), Acta2-CreERT2 мышей были повязана АНО(+/-) мышах также перевозящих многоцветные ROSA26R(РБ/Rb) репортер. Как описано в шаге 1, вилки были проверены, беременных плотины были индуцированной с одной тамоксифен инъекции (1,5 мг) в E12.5, и они были принесены в жертву на E18.5. Эмбрионы были собранного, фиксированная, замороженные и генотипируемого. Поперечная нисходящей аорты cryosections были сокращены. Разделы с АНО(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(РБ / +) эмбрионы указывают, что избыточный внутренний слой SMCs, накапливаться в АНО-null мышей (начиная после E15.5) отмечены несколько цветов ( Рисунок 1) и следовательно являются производными от нескольких актина альфа гладких мышц (SMA)+ клетки, которые присутствуют в ~ E12.5. В E12.5 аорты SMA+ клетки ограничены туника СМИ.
Для создания АНО(- / -) эмбриональных аорты эксплантов, мужчины и женщины были вязка АНО(+/-) мышах. Используя методы, описанные в шаге 2, вилки были проверены и беременных АНО(+/-) плотины были принесены в жертву на E15.5. Аорты были изолированы от АНО(- / -) эмбрионов и культивировали 0 или 18 h присутствии анти Интегрин β3 блокирование антитела или элемент IgG1. Затем были зафиксированы аорты, заморожены, и cryosectioned и cryosections были витражи для SMA (SMC маркер), CD31 (маркер эндотелиальных клеток) и ядер (DAPI) (Рисунок 2). Результаты показывают, что в течение 18 ч культивирования, E15.5/АНО(- / -) аорты становится hypermuscular и стенозирующего. Этот процесс является аттенуированных блокирующие антитела анти Интегрин β3.
SMCs были изолированы от аорты wildtype мышей на P0.5. Как описано в шаге 3, SMCs были изолированы от расчлененных неонатальной аорты, пищеварение энзима и культивировали. Клетки были пассированной, и проход 3 клетки окрашивали SMC маркеров (например, SMA, тяжелой цепи миозина гладких мышц (SMMHC) или transgelin (также известный как SM22α)), CD31 и ядер (DAPI) (рис. 3). Большинство культивируемых клеток выразить SMC маркеры, но не CD31.
Для оценки ли фармакологических ингибирование Интегрин β3 может смягчить hypermuscularization и стенозом АНО(- / -) аорты в естественных условиях, мы постоянно переплетаются ингибитор cilengitide из-за небольшой half-life в плазме крови. АНО(+/ −) были вязка мужчины и женщины, и, как описано в шаге 4, осмотической мини насосы загружен с cilengitide были имплантированы в беременных плотины в E13.5. В P0.5 щенки были Усыпленных и генотипируемого, и были проанализированы их аорты. Cilengitide лечения значительно ослабляет аортальным стенозом и hypermuscularization в АНО(- / -) мышах (рис. 4) не изменяя аорты wildtype9. Таким образом анти Интегрин β3 является потенциально перспективных неинвазивная подход к лечению aortopathy эластина.
Рисунок 1 . Избыток SMCs в АНО(- / -) аорты вытекают из нескольких существующих SMCs. Плотин беременных с АНО(- / -), Acta2-CreERT2 эмбрионов также перевозящих многоцветной репортер Cre ROSA26R(РБ / +) были индуцированной с однократной внутрибрюшной инъекции тамоксифена (1,5 мг) на E12.5. Плотины были принесены в жертву на E18.5, и поперечной разделы нисходящей аорты эмбрионы были проанализированы, с пятнать DAPI и прямой флуоресценции цветов РБ, Лазурный (Cer), mCherry (mCh) и mOrange (Мор). Избыток SMCs накапливаются в внутренний аспект АНО-null аорты после E15.518. Избыточный внутренний слой SMCs включают ячейки нескольких цветов (звездочки), указывающее polyclonality. Лу, просвета аорты. Линейки, 10 мкм. переиздание от Мисра et al., 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Анти αvβ3 Интегрин блокады ослабляет Hypermuscularization и стеноз аорты экспланта АНО(- / -) . В E15.5 были умерщвлены беременных плотин и аорты АНО(- / -) эмбрионы были собраны. Изолированные аорты были исправлены немедленно или культивируемых в присутствии элемента изотипа IgG1 или Интегрин αvβ3 блокирующие антитела для 18 h до фиксации. Фиксированной аорты окрашивали CD31, SMA и ядер (DAPI). Лу, просвета аорты. Линейки, 100 мкм. переиздание от Мисра et al., 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Изолированные и культивировали Aortic SMCs от маркеров Экспресс гладких мышц новорожденных мышей. SMCs были изолированы от P0.5 щенков и культивировали. Клетки из третий проход были исправлены и витражи для CD31 (EC маркер), ядра (DAPI) и маркер SMC (SMA, SM22α или SMMHC, как указано). Этот анализ показывает, что ~ 90% культивируемых клеток выразить SMC маркеры, и ни одна были замечены выразить CD31. Шкалы, 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Непрерывная инфузия Cilengitide в Vivo ослабляет АНО(- / -) аорты Hypermuscularization и стенозом. Мужские и женские АНО(+/-) мышах были скрещены. Интегрин β3 ингибитор cilengitide или транспортного средства (PBS) был постоянно вливается в беременных плотин, используя осмотического мини насосы, начиная с E13.5. Поперечная секций на P0.5 были витражи для SMA (красный), CD31 (белый) и ядра (DAPI, синий). Лу, просвета аорты. Линейки, 100 мкм.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В отличие от тщательного расследования мышиных аорты и ее крупных филиалов в взрослых патологических состояний, такие как модели атеросклероза меньше известно относительно Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь мы ориентируемся на эмбриональных/перинатальной аорты, специально SMCs и предоставить протоколы для изучения в аорту через в естественных условиях, тканях экспланта, и SMC изоляции подходов. Эти бесплатные подходы обеспечивают следователь с различных подходов к изучению эмбриональных/перинатальной аорты.
Клональный анализ представляет собой очень мощный подход, который позволяет исследовать поведение отдельных клеток. Недавно мы использовали этот подход для выявления специализированные SMCs в легких сосудистую10. Важно признать, что в отдельных мыши, перевозящих многоцветные Cre репортер, есть шанс, что клетки одного цвета может вытекать из более чем одного события рекомбинации. Таким образом Клональный анализ с репортером многоцветные требует оценки многочисленных мышей. Потому что тамоксифен в середине конце гестационного периода может мешать отела, для экспериментов, которые пометки ячеек в середине конце гестационного периода и отслеживать их постнатально, прогестерон и тамоксифен следует вводить сопутствующе обстоятельств. Аналогичные протоколы в эмбрион, судьба картирования и Клональный анализ клеток у взрослых мышей может осуществляться с внутрибрюшинной инъекции тамоксифен в взрослых.
Клональный анализ и судьба картирование SMCs использует мышь, перевозящих трансгенов с выражением Cre рекомбиназа под контролем промоутеров с расширенной деятельностью в гладких мышц. Здесь мы описываем протоколов, с помощью мыши, перевозящих условного трансгенов Myh11-CreERT2 или Acta2-CreERT2. Myh11 является наиболее конкретным маркер SMCs19; Однако это downregulated в аорте АНО(- / -) 9. Acta2 выражается в SMCs, в том числе АНО-null аорты, но это не конкретные, потому что он выражается также в других типах клеток. Если эти условные трансгенов были «Дырявый» (то есть, побудить рекомбинации в отсутствие тамоксифен), это может быть проблематичным, как эксперименты не будет определить сроки клеток маркировки. Негерметичности этих трансгенов была проанализирована путем оценки активности бета галактозидазы в мышей, перевозящих на основе lacZ Cre репортер и Myh11-CreERT2 или Acta2-CreERT2 после лечения транспортного средства ( т.е., в отсутствие тамоксифен индукции)11,12. Основываясь на этом анализе, эти трансгенов считались не вытекающей.
Hypermuscularization характеризует несколько сосудистой патологии в организме человека. К примеру аортальным стенозом надклапанной (SVAS) является разрушительные врожденное состояние, которое характеризуется обструкции крупных и средних артерий вследствие избыточного SMCs. SVAS результаты от потери функции одной аллели гена, АНО и происходит как отдельные сущности или, более широко, как часть Уильямс-Бойрен синдром20,,21,22,23,,24. АНО(- / -) мутантных мышей Фенокопия многие аспекты аорты фенотип SVAS18,21,22. Аорты эксплантов от АНО(- / -) эмбрионов быстро стать закрыта во время культуры, тогда как эксплантов от wildtype эмбрионы остаются патентных9,18. Аорты экспланта подход облегчает скрининга для агентов, которые смягчить стеноза в эластина aortopathy9. Однако этот подход не учитывает механических или физической силы, которые аорты подвергается в организме. Таким образом позитивный хитов в скрининг аорты экспланта следует оценивать с моделей мутантных мышей в естественных условиях АНО .
Протокол изоляции SMC-это быстрый и надежный метод для получения SMCs от перинатальной мышиных аорты. Аналогичный подход может быть экстраполированы изолировать SMCs от взрослых мышей. Из-за его относительно большого размера Взрослый аорты может быть открыт в продольном направлении и адвентиции и эндотелиальных клеток расчлененный прочь. Чтобы оценить чистоту клетки изолированы от перинатальных или взрослый аорты, важно для проверки выражения SMC маркеров (например, SMMHC, smoothelin, SM22α и SMA) и отсутствие экспрессии маркеров эндотелиальных клеток (например, CD31 и сосудистого эндотелия Кадгерины). Потенциал, что альтернативные изоляции подход заключается в использовании проточной цитометрии изолировать дневно обозначить SMCs из расчлененных аорты. Ношение флуоресцентные Cre репортер и Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2или Tgln-Cre мышей может использоваться дневно обозначить SMCs11,12,25, 26,27. Кроме того существующие трансгенных мышей с SMA промоутер, вождение выражение Флюорофор (т.е., GFP, mCherry или RFP) может быть используемые28,29,30.
Имплантированные осмотического мини насосы используются для обеспечения непрерывной поставки фармакологических агентов для лабораторных животных. Мы имплантированы мини насосы для беременных мышей на E13.5 доставить развивающихся эмбрионов во время остальной части гестационного периода9агентов. Чтобы достичь эмбрионы, такие агенты должны уметь пройти крови плацентарный барьер. В общем мини насосы очень хорошо переносится и, учитывая низкий уровень инфицирования, не рекомендуются обычные антибиотики. Зияние раны редко; Однако если обнаружен зияние, больше, чем 4 мм, мыши должен быть повторно наркотизированных и Рана очищается и снова закрыл с шовного.
Эта работа описывает взята подходов, которые могут быть использованы для изучения нормального формирования эмбриональных и перинатальной стены аорты во время разработки, а также после возмущения в этом процессе во время болезни. Кроме того эти протоколы могут применяться для изучения обслуживания и болезни взрослого аорты. Подходы могут быть экстраполированы других кровеносных сосудов, а также гладкой мускулатуры покрытием сосудистых структур, таких как желудочно-кишечного тракта или легких airways. Наконец аналогичные методы может использоваться для изучения типов ячеек за пределами SMCs, например эндотелиальных клеток и фибробластов, а также взаимодействие между этими типами клеток и SMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Дин ли для обмена его лаборатории протокол для аорты SMC изоляции. Финансовая поддержка была оказана национальных институтов здравоохранения (R21NS088854, R01HL125815 и R01HL133016 к D.M.G), Американской ассоциации сердца (целевые субсидии 14GRNT19990019 до D.M.G.) и Йельский университет (Браун-Кокс стипендий до утра и запуска средства для D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R.
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
