Summary
Protocolli per lo studio dell'aorta murino embrionale e perinatale, usando in vivo analisi clonale e destino mapping, espianti aortiche e muscolo liscio isolato cellule sono dettagliate qui. Questi diversi approcci l'espletamento dell'indagine della morfogenesi dell'aorta embrionale e perinatale nello sviluppo normale e la patogenesi in malattia.
Abstract
L'aorta è la più grande arteria del corpo. La parete aortica è composto da uno strato interno di cellule endoteliali, uno strato intermedio di alternanza di lamelle elastiche e cellule muscolari lisce (CML) e uno strato esterno di fibroblasti e la matrice extracellulare. In contrasto con lo studio diffuso di modelli patologici (ad es., aterosclerosi) nell'aorta adulto, molto meno è conosciuto circa l'aorta embrionale e perinatale. Qui, ci concentriamo su SMCs e fornire protocolli per l'analisi di morfogenesi e patogenesi di SMCs aortico embrionale e perinatale nello sviluppo normale e malattia. In particolare, sono i quattro protocolli inclusi: io) in vivo embrionali destino Mappatura e analisi clonale; II) espianto embrionale dell'aorta cultura; III) isolamento di SMC dall'aorta perinatale; e iv) posizionamento sottocutaneo mini pompa osmotica nei topi in gravidanza (o non gravide). Quindi, questi approcci facilitano l'indagine del finale, destino e architettura clonale di SMCs nel aorta in vivo. Essi consentono di modulazione morfogenesi embrionale dell'aorta in utero tramite l'esposizione continua agli agenti farmacologici. Inoltre, espianti di tessuto aortico isolato o SMCs aortico può essere utilizzato per approfondire il ruolo di specifici geni bersaglio durante processi fondamentali quali muscularization, la proliferazione e la migrazione. Questi esperimenti di generazione di ipotesi su SMCs isolato e l'aorta explanted quindi possono essere valutati nel contesto in vivo attraverso approcci farmacologici e genetici.
Introduction
Il sistema circolatorio del funzione di organismi multicellulari a fornire sostanze nutritive e ossigeno alle cellule che sono non a contatto con l'ambiente esterno e per rimuovere i prodotti di scarto e biossido di carbonio da queste cellule. Nei vertebrati, il sistema circolatorio primario consiste del cuore, che pompa il sangue attraverso una serie di vasi sanguigni. Le pareti dei vasi sanguigni, come arterie e vene, sono costituiti da tre strati: i) la biancheria intima, o strato interno delle cellule endoteliali; II) la media, o strato intermedio della alternando circonferenzialmente allungata in cellule muscolari lisce CML e lamelle elastiche; e iii) il adventitia, o strato esterno del tessuto connettivo e fibroblasti. La stragrande maggioranza degli studi nella biologia vascolare concentrarsi sulle cellule endoteliali, indagando la formazione di nuovi tubi alberati su cellule endoteliali attraverso l'angiogenesi. In confronto, SMCs ricevuto relativamente poca attenzione. Tuttavia, Paesi del Mediterraneo meridionale sono un tipo di cellula fondamentale nella costruzione della parete arteriosa normale e nella patologia vascolare.
L'aorta è l'arteria più grande calibro nel corpo, ricevendo il sangue arterioso dal ventricolo sinistro del cuore. È afflitto da patologie umane, tra cui l'aterosclerosi, aneurisma e dissezione. Negli organismi adulti, l'aorta ed i relativi rami principali sono intensamente studiati nei modelli della malattia vascolare. Per esempio, dieta grassa alta alimentato i topi che sono null per il gene che codifica il recettore di lipoproteina a bassa densità o dell'apolipoproteina E, sviluppano l'aterosclerosi, e recenti studi di mappatura destino indicano che pre-esistenti SMCs dar luogo a più tipi di cellule nella la placca aterosclerotica1. In aneurismi aortici, alterazioni patologiche sono SMC apoptosi e2,3di rimodellamento della matrice extracellulare.
Sostanzialmente di meno è conosciuto per quanto riguarda la morfogenesi SMC e patogenesi durante il periodo embrionale e perinatale. Qui, forniamo protocolli per studiare embrionali e perinatale aortica SMCs in vivo, in espianti di tessuto e in cellule isolate. Per esempio, la prima sezione del protocollo delinea destino Mappatura e analisi clonale in topi embrionali. Cre ricombinasi espresso sotto il controllo di un promotore di cellula-specifico facilita la marcatura di cellule specifiche e la loro progenie4,5,6; Tuttavia, il controllo temporale della cellula-specifico di etichettatura può essere impegnativo durante lo sviluppo embrionale nei topi. In questo contesto, con embrioni che esprimono il condizionale CreER sotto un promotore attivo nei paesi del Mediterraneo meridionale (e.g.,Myh11 o Acta2) e un reporter di Cre, forniamo i metodi per l'iniezione di tamoxifene o del suo metabolita attivo 4-OH-tamoxifen in dighe incinte e per analizzare le cellule con etichettate in embrioni o prole postnatale. Inoltre, in contrasto con gli studi di mappatura del destino, che prevalentemente utilizzano Cre reporter con un singolo giornalista fluoroforo1,7, analisi clonale è sostanzialmente migliorata con i giornalisti di Cre multi-colori.
Le sezioni di seconda e terza del protocollo descrivono metodi per isolare e coltura embrionale espianti aortiche e SMCs aortico da neonati, rispettivamente. Questi approcci consentono per la manipolazione delle vie di segnalazione, in particolare in espianti aortiche o paesi del Mediterraneo meridionale e per analizzare gli effetti diretti degli agenti farmacologici. Così, il ruolo di geni specifici nel tessuto di interesse può essere selezionato in modo molto più rapido rispetto attraverso manipolazioni genetiche tradizionale nei topi. Inoltre, gli studi SMC isolati facilitano l'analisi della migrazione cellulare e adesione, che sono tecnicamente limitato in vivo.
Infine, la quarta sezione di protocollo delinea il posizionamento di una mini-pompa osmotico sottocutaneo caricato con agenti farmacologici nei topi in gravidanza (o non gravide). Questo metodo facilita l'analisi dell'effetto sullo sviluppo embrionale causato da agenti che richiedono infusione continua a causa del rapido metabolismo. L'alternativa di frequenti iniezioni non è pratico per molti agenti e dovrebbe essere evitato, in quanto può causare disagio significativo nella diga incinta.
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Protocol
tutti i protocolli del mouse sono approvati dal comitato di uso alla Yale University e istituzionali Animal Care.
1. In Vivo embrionali destino Mappatura e analisi clonale
Nota: abbiamo usato ampiamente questi approcci per valutare le origini delle cellule e la loro architettura clonale in modelli di sviluppo e malattia 7 , 8 , 9 , 10.
- impostare accoppiamento fra i topi con un CreER e topi con un reporter di Cre.
Nota: Un CreER viene utilizzato per SMC marcatura; Myh11-CreERT2 o Acta2-CreERT2 topi 11 , 12 è comunemente usato per questo scopo. Abbiamo usato ROSA26R-CreERT2 topi 13 per marcatura largamente tessuti embrionali.- Per analisi clonale, utilizzare un multi-colore Cre reporter (ad es., coriandoli o Rainbow [Rb] topi) 8 , 14 , 15 e per la mappatura di destino, utilizzare un colore unico Cre reporter (ad es., ROSA26R-YFP topi 16) o il reporter di Cre di doppio-colore ROSA26R-mTomato-EGFP (mTmG) 17.
Nota: Questo schema di allevamento utilizza topi adulti che sono 2-6 mesi di età (in genere ~ 30 g) e genereranno gli embrioni con un CreER e un reporter Cre.
- Per analisi clonale, utilizzare un multi-colore Cre reporter (ad es., coriandoli o Rainbow [Rb] topi) 8 , 14 , 15 e per la mappatura di destino, utilizzare un colore unico Cre reporter (ad es., ROSA26R-YFP topi 16) o il reporter di Cre di doppio-colore ROSA26R-mTomato-EGFP (mTmG) 17.
- Verificare le spine vaginale al mattino utilizzando un metallo sonda e considerano il mezzogiorno del giorno di rilevazione di spina come giorno embrionale (E) 0.5.
- Separare la femmina dal maschio quando viene rilevato un plug.
- Preparare 4-OH-tamoxifen e soluzioni di lavoro di tamoxifene.
- Per 4-OH-tamoxifen, sciogliere 5 mg in 50 µ l di etanolo al 100%, vortex per 2 min e poi 450 µ l di olio di mais. Su ghiaccio, Sonicare a livello di uscita 2 per 10 cicli di s con il riposo tra cicli fino a quando il campione si raffredda. Dopo che il campione è completamente sciolto (solitamente ~ 4-5 cicli di sonicazione), prendere 200 µ l di soluzione lisati mediante e sciogliere in 1.800 µ l di olio di mais per rendere la soluzione di lavoro finale (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
- Per tamoxifen, diluire a 50 mg/mL di etanolo al 100% e vortice fino a che è sciolto. Diluito in olio di mais per rendere la soluzione di lavoro finale (tamoxifene, 10 mg/mL) e mescolare a 45 ° C per garantire che esso sia completamente disciolta.
- Per induzione embrionale iniziale, iniettare 4-OH-tamoxifen intraperitonealmente in una diga incinta.
- Uso di iniezioni di 4-OH-tamoxifen (fino a ~ 150 µ g / mouse incinto, o circa 5 mg/kg di peso corporeo) 5,5 e successivamente come cedono diga praticabile, gli embrioni e cuccioli.
- Uso di tamoxifen alle dosi di 0,5 - 1,5 mg (o 17-50 mg/kg) per dighe incinte con embrioni a ~ E9 e da allora in poi. Utilizzare un ago 30g per tutte le iniezioni.
Nota: Filtrazione attraverso un filtro di 0,22 µm è in genere utilizzato per sterilizzare tutte le miscele prima dell'iniezione.
- Per analisi clonale, utilizzare le iniezioni intraperitoneali di alte dosi di 4-OH-tamoxifen (ad es., 5 mg/kg) o il tamoxifene (ad es., 50 mg/kg) per contrassegnare più celle.
- Per contrassegnare le singole celle, titolo giù la dose di 4-OH-tamoxifene o tamoxifene in tale che nel tessuto di interesse (cioè, l'aorta), quasi tutti gli embrioni analizzati (come descritto di seguito alla fine di questa sezione) o non hanno cellule identificate o solo le celle di un unico colore; Questa è la dose soglia.
- Per contrassegnare le cellule nel periodo metà-fine gestazionale e per tracciare il loro destino o clonality nel topo postnatale, iniettare del progesterone nella cavità intraperitoneale della diga incinta in concomitanza con il tamoxifene in 1:2 (progesterone: tamoxifene) rapporto dose.
Nota: Le dosi di tamoxifene sono 17-50 mg/kg e dosi di progesterone sono 8,5-25 mg/kg (cioè, la metà delle dosi tamoxifen). L'iniezione di progesterone può ritardare la manodopera di ~ 1-2 giorni. - Euthanize la diga incinta con embrioni di un'età desiderata utilizzando un metodo di goccia aperta, dove la diga viene collocata in un recipiente con cotone o garza imbevuta con isoflurano non diluito. Confermare la morte aprendo la cavità toracica per indurre il pneumotorace, rimuovendo gli organi vitali, e/o eseguendo la dislocazione cervicale.
- Purificare l'addome con etanolo al 70%. Usare le forbici per tagliare aperto l'addome e sezionare l'utero. Rimuovere gli embrioni dall'utero e attentamente separare gli embrioni dalla placenta e il sacco vitellino utilizzando forcipe.
- Euthanize gli embrioni a E15 o età superiore eseguendo o dislocazione cervicale o decapitazione con forbici o una lama affilata.
Nota: Gli embrioni più giovani di E15 morire rapidamente dopo l'eutanasia della madre e/o la rimozione degli embrioni da madre. - Posizionare gli embrioni in PBS ghiacciata e tagliare un piccolo pezzo di coda usando forbici al genotipo del reporter CreER e Cre.
- Difficoltà gli embrioni in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 2 h. lavare gli embrioni tre volte in PBS e poi incubare gli embrioni in saccarosio 30% in PBS nei tubi 15 mL, in attesa fino a quando non si affondano, che può richiedere fino a due giorni. Stampi in plastica
- riempimento congelamento fino a 2/3 di massimo livello con composto di temperatura di taglio ottimale (OCT). Posizionare ogni embrione verticalmente nello stampo, interamente immerso in ott. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (TA) per ridurre al minimo le bolle.
- Posto congelamento blocchi di tessuto in posizione verticale in un ghiaccio secco, bagno di etanolo 70% di congelare. Memorizzare i blocchi a -80 ° C.
- Impostare la temperatura di criostato a-22 ° C e tagliare i blocchi per generare sezioni trasversali attraverso l'intera aorta, dello spessore di 10-20 µm. Asciugare i vetrini a RT per 30 min prima della loro memorizzazione a -80 ° C.
- Scongelare i vetrini a temperatura ambiente, al riparo dalla luce per evitare lo sbiancamento di fluorofori. Lavare i vetrini con PBS-Tween20 0,1%.
- Per analisi clonale, colorare i vetrini per nuclei (DAPI, 5mg/mL) e immagine direttamente altri fluorofori al reporter di Rainbow Cre (Celestopoli: 433-nm eccitazione max, 475-nm emissione max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Uso i seguenti filtri per la rilevazione di fluorofori con un microscopio fluorescente dritto: DAPI (eccitazione max/larghezza di banda 350/50 nm, emissione max/bandwith 460/50 nm), Cerulean (eccitazione 436/20 nm, emissione 480/40 nm), texas rosso (eccitazione 560 / 40 nm, emissione 630/75 nm) e filtro personalizzato per separare mCherry da mOrange (eccitazione 577/10 nm, emissione 630/50 nm).
- Per il mapping del destino con il reporter di Cre mTmG, rilevare GFP (484 nm, 510 nm), da imaging direttamente o tramite immunostaining. Imaging con un microscopio fluorescente dritto per utilizzare un filtro GFP (eccitazione 470/40 nm, emissione 525/50 nm).
- Per immunostaining, incubare sezioni con gli anticorpi primari durante la notte a 4 ° C, lavare con 0,1% Triton X-100 in PBS e poi incubare con anticorpi secondari per 1 h. uso anti-CD31 (concentrazione finale 0,0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) e Cy3-anticorpi primari direttamente coniugati anti-SMA (diluizione finale 1: 500) e uso secondario Nefrologiadirettamente coniugati a fluorofori (diluizione finale 1: 500) (Vedi la Tabella materiali) s.
- Per analisi clonale, colorare i vetrini per nuclei (DAPI, 5mg/mL) e immagine direttamente altri fluorofori al reporter di Rainbow Cre (Celestopoli: 433-nm eccitazione max, 475-nm emissione max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Immagine vetrini con un microscopio fluorescente dritto (ingrandimento: 4x - 20x) o microscopio confocale (10. X-63 X). Per elevati ingrandimenti, utilizzare un confocale imaging 63 x obiettivo olio con un'apertura numerica di 1.4-0,6 e una dimensione di frame di 1.024 x 1.024 pixel.
2. Explant embrionali Aorta cultura
Nota: questo approccio utilizzato in precedenza per valutare il ruolo di integrina beta3 nella stenosi del explanted Eln (- / -) dell'aorta embrionale 9 , 18.
- eutanasia una diga temporizzato-incinta a E15.5 per inalazione isoflurane in eccesso, secondo passo 1.8, sopra.
- Raccolto ed eutanasia gli embrioni, secondo passi 1.9-1.10, sopra.
- Posizionare l'embrione supinamente e pin gli arti estesi alla scheda di dissezione. Visualizzare con uno stereoscopio di dissezione e usare le forbici per tagliare un'incisione verticale dall'addome attraverso lo sterno a livello del torace superiore. Via sezionare il timo, trachea, polmoni, esofago, fegato e intestino.
- Delicatamente tirare cuore ventralmente utilizzando forcipe e usare le forbici per dissezione dell'aorta dalla funzione dorsale della cavità toracica e addominale. Per rilasciare l'aorta, tagliarlo alla radice prossimale e distale posizioni addominale.
- Posto l'aorta in PBS sterile ghiacciata in una cappa di cultura cellulare. Trasferire l'aorta di una piastra a 24 pozzetti e cultura in DMEM con 0,5% FBS per fino a 24 ore a 37 ° C.
Nota: Il terreno di coltura può essere completato con un anticorpo blocco (ad esempio, anti-integrina αvβ3 anticorpo a 0,02 mg/mL 9; si veda la Tabella materiali) o un agente farmacologico. - Lavare l'aorta due volte con PBS e quindi risolvere il problema con paraformaldeide al 4% per 20 min.
- Lavare tre volte con PBS e trasferimento dell'aorta in un tubo da 1,5 mL con 30% di saccarosio in PBS. Dopo l'aorta affonda, rendere blocchetti congelati del tessuto, sezioni tagliate e immunostain, come descritto nei passaggi 1.13-1.15, sopra.
3. Isolamento di SMC dall'Aorta perinatale
Nota: questo approccio è attualmente utilizzato per confrontare la biologia di SMCs aortico isolate da topi perinatali Eln (- / -) e wildtype.
- Euthanize un murino pup al giorno postnatale (P) 0,5, dislocazione cervicale o per decapitazione con forbici o una lama affilata, come descritto al punto 1.10, sopra.
- Eseguire il passaggio 2.3 e poi, dopo l'apertura del torace e dell'addome, ventricolo sinistro puntura con ago 23G. Tubazione di plastica di uso per collegare l'ago alla siringa contenente PBS sterile tenuto verticalmente in una posizione elevata in modo che PBS fluisce nel ventricolo sinistro per gravità. Consentire l'infusione di PBS sterile nel ventricolo di sinistra fino a quando il fegato blanches.
- Utilizzare pinze per rimuovere il tessuto adventitial all'esterno dell'aorta e sezionare l'aorta, come descritto al punto 2.4.
- Digerire l'aorta in un'unica soluzione di DMEM (500 µ l) completati con 225 collagenosi U/mL, 2,25 elastasi U/mL e 1 x antibiotico antimicotico per 45 min a traballare 37 ° C. manualmente il tubo ogni 5-10 min
- Nella cappa sterile cella cultura, titurate il tessuto digerito pipettando su e giù con una pipetta 200-µ l per generare una sospensione unicellulare. Trasferire la sospensione unicellulare a un tubo di 15 mL, aggiungere 2 mL di DMEM e centrifugare a 920 x g per 5 min a 25 ° C.
- Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura SMC (DMEM contenente 10% FBS completati con rhFGF di 1 µ g/mL, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 2,5 µ g/mL anfotericina B). Trasferimento a una piastra di coltura di 35 mm.
Nota: Al momento di isolamento iniziale, ~ 400.000 cellule sono ottenute da un singolo p 0.5 wildtype aorta; ~ 300.000 di queste cellule sono SMCs. - Cultura le cellule a 37 ° C e cambiare al terreno di coltura fresco SMC ogni 3 giorni. Utilizzando le tecniche standard con tripsina, passaggio le cellule quando confluenti. Per esperimenti, utilizzare celle da passaggi 3-7.
4. Sottocutaneo osmotico mini pompa posizionamento in gravidanza (o Non-incinta) topi
Nota: questo approccio è stato precedentemente utilizzato per trasportare continuamente l'agente farmacologico (ad es., integrina β3 β5 inibitore e Cilengitide) a embrioni nell'utero 9. La pompa è stata inserita nella diga incinta alle E13.5 e mantenuta fino al parto.
- Anestetizzare i topi con isoflurano 2-5% in ossigeno (portata di 1 L/min) per induzione e 1-3% per la manutenzione. Utilizzare il riflesso di punta-pizzico per monitorare il livello di anestesia e regolare l'agente anestetico, se necessario. Amministrare la buprenorfina sottocutanea (0,05 - 0,1 mg/kg) per analgesia.
- Radere la parte bassa della schiena con i clippers. Utilizzare teli sterili, guanti e strumenti e mantenere i topi su una piastra di riscaldamento chirurgico durante la chirurgia.
- Posizionare ogni mouse in posizione prona e strofinare sul retro con betadine seguita da alcool isopropilico. Circa 3-5 cm rostral alla base della coda nella parte bassa della schiena, utilizzare un bisturi per rendere un'incisione orizzontale della pelle 0,5 - 1,0 cm di lunghezza senza danneggiare il muscolo sottostante.
- Inserire un emostato nell'incisione e creare una tasca sottocutanea rostralmente per l'impianto pompa aprendo e chiudendo le mascelle emostato.
- Riempire un mini-pompa osmotica con l'agente di scelta, secondo il produttore ' linee guida s (Vedi la Tabella materiali). Inserire la pompa riempita nella tasca e chiudere l'incisione con graffette o punti di sutura non riassorbibile 6-0. Assicurarsi che il tempo chirurgico totale sia inferiore a 10 min.
- Monitoraggio postoperatorio, i topi ogni 15 minuti fino a quando hanno recuperato da decubito sternale. Amministrare la buprenorfina sottocutanea (0,05 - 0,1 mg/kg) ogni 6-12 h per 48 h. Quando i topi hanno pienamente recuperato dall'anestesia generale, è possibile monitorarli tutti i giorni. Rimuovere le clip o suture post-chirurgia 7-10 giorni.
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Representative Results
In una rappresentativa analisi clonale di SMCs nel mutante di embrioni per Eln (il gene che codifica per l'elastina di proteine della matrice extracellulare), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 topi erano abbinati ad Eln(+ /-) topi anche portando il multi-colore ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Come descritto nel passaggio 1, spine sono state controllate, incinte dighe sono state indotte con un'iniezione singola tamoxifen (1,5 mg) a 12.5 e sono stati sacrificati alle E18.5. Embrioni sono stati raccolti, fisso, congelati e genotipizzati. Trasversale discendente cryosections aortica sono stati tagliati. Sezioni da Eln(+ /-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) embrioni indicano che lo strato interno in eccesso SMCs che si accumulano nel Eln-topi (a partire dopo E15.5) sono contrassegnati da più colori ( Figura 1) e da qui derivano da più l'actina alfa-liscia del muscolo (SMA)+ cellule presenti a ~ 12.5. Nell'aorta 12.5, SMA+ cellule sono limitate alla tunica media.
Per generare aorte embrionali Eln(- / -) per espianti, maschio e femmina sono stati accoppiati Eln(+ /-) topi. Utilizzando i metodi descritti nel passaggio 2, spine sono state controllate e incinta Eln(+ /-) dighe sono stati sacrificati a E15.5. Le aorte sono state isolate da embrioni Eln(- / -) e coltivate per 0 o 18 h in presenza di un anti-integrina β3 bloccando l'anticorpo o un controllo di IgG1. Aorte sono stati quindi corretti, congelati, e cryosectioned e cryosections sono state macchiate per SMA (marcatore SMC), CD31 (marcatore delle cellule endoteliali) e nuclei (DAPI) (Figura 2). I risultati dimostrano che all'interno di 18 h di coltura, l'aorta E15.5/Eln(- / -) diventa hypermuscular e stenotic. Questo processo è attenuato da un anticorpo di anti-integrina β3 blocco.
Paesi del Mediterraneo meridionale sono stati isolati dall'aorta di topi selvatici a p 0.5. Come descritto nel passaggio 3, Paesi del Mediterraneo meridionale sono stati isolati dall'aorta dissecata neonatale tramite digestione degli enzimi e sono stati coltivati. Le cellule sono state attraversate, e cellule del passaggio 3 sono state macchiate per marcatori SMC (cioè, SMA, muscolo liscio catena pesante della miosina (SMMHC) o transgelin (noto anche come SM22α)), CD31 e nuclei (DAPI) (Figura 3). La maggior parte delle cellule coltivate esprimono marcatori SMC ma non CD31.
Per valutare se l'inibizione farmacologica della integrina β3 può attenuare hypermuscularization e stenosi del Eln(- / -) dell'aorta in vivo, abbiamo continuamente infuso il cilengitide inibitore a causa della sua breve emivita nel plasma. Eln(+ / −) maschi e femmine sono state accoppiate, e, come descritto nel passaggio 4, mini-pompe osmotiche caricate con cilengitide sono state impiantate in incinta dams presso E13.5. Al p 0.5, i cuccioli sono stati eutanasizzati e genotipizzati e loro aorte sono stati analizzati. Cilengitide trattamento attenua significativamente la stenosi aortica e hypermuscularization nei topi Eln(- / -) (Figura 4) senza alterare il wildtype aorta9. Così, anti-integrina β3 è un approccio potenzialmente promettente non invasivo per trattare aortopathy di elastina.
Figura 1 . SMCs in eccesso nell'Aorta Eln(- / -) derivano da più pre-esistenti SMCs. Dighe incinte con embrioni Eln(- / -), Acta2-CreERT2 anche portando il multicolor reporter Cre ROSA26R(Rb / +) sono state indotte con una singola iniezione intraperitoneale di tamoxifene (1,5 mg) a 12.5. Dighe sono stati sacrificati a E18.5, e sezioni trasversali delle aorte discendente degli embrioni sono stati analizzati, con colorazione per DAPI e la fluorescenza diretta dei colori di Rb, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) e mOrange (mOr). SMCs in eccesso si accumulano sulla faccia interna del Eln-null aorta dopo E15.518. Paesi del Mediterraneo meridionale in eccesso strato interno includere celle di più colori (asterischi), che indica polyclonality. Lu, lumen aortico. Barra della scala, 10 µm. ristampato da Misra et al., 20169. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Blocco di integrina αvβ3 anti attenua Hypermuscularization e stenosi dell'espianto aortica Eln(- / -) . A E15.5, incinte dighe sono stati eutanasizzati ed aorte di embrioni Eln(- / -) sono stati raccolti. Aorte isolati sono stati risolti immediatamente o coltivate in presenza di un controllo di isotipo IgG1 o un integrina αvβ3 anticorpo blocco per 18 h prima della fissazione. Fissi aorte sono state macchiate per CD31, SMA e nuclei (DAPI). Lu, lumen aortico. Barra di scala, 100 µm. ristampato da Misra et al., 20169. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Isolato e coltivato SMCs aortico da topi neonatali espressa del muscolo liscio marcatori. Paesi del Mediterraneo meridionale sono stati isolati da p 0.5 cuccioli e sono stati coltivati. Cellule dal terzo passaggio erano fissi e macchiate per CD31 (segno CE), i nuclei (DAPI) e un indicatore SMC (SMA, SM22α o SMMHC, come indicato). Questa analisi indica che ~ 90% delle cellule coltivate esprimono marcatori SMC e nessuno sono stati osservati per esprimere CD31. Barra della scala, 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Infusione continua di Cilengitide In Vivo attenua Eln(- / -) Hypermuscularization aortica e stenosi. Maschio e femmina Eln(+ /-) topi sono stati attraversati. L'integrina β3 inibitore cilengitide o veicolo (PBS) è stato infuso continuamente in dighe incinte utilizzando minipompe osmotiche a partire da E13.5. Sezioni trasversali alle p 0.5 sono state macchiate per SMA (rosso), CD31 (bianco) e nuclei (DAPI, blu). Lu, lumen aortico. Barra della scala, 100 µm.
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Discussion
In contrasto con le vaste indagini di murino aorta ed i relativi rami principali in adulte condizioni patologiche, quali modelli di aterosclerosi, di meno è conosciuto per quanto riguarda la morfogenesi e la patogenesi dell'aorta embrionale e perinatale. Qui, ci concentriamo sull'aorta embrionale/perinatale, in particolare i paesi del Mediterraneo meridionale e fornire protocolli per studiare l'aorta attraverso in vivo, espianto di tessuto, e isolamento di SMC si avvicina. Questi approcci gratuiti forniscono l'investigatore con diversi approcci per lo studio dell'aorta embrionale/perinatale.
Analisi clonale è un approccio molto potente che permette di studiare il comportamento delle singole celle. Recentemente abbiamo usato questo approccio per aiutare a identificare SMCs specializzati nel vasculature polmonare10. È fondamentale riconoscere che, in un singoli mouse che trasportano un reporter di Cre multi-colore, c'è una possibilità che cellule dello stesso colore potrebbero derivare da più di un evento di ricombinazione. Così, l'analisi clonale con un reporter di multi-colore richiede la valutazione di numerosi topi. Tamoxifene nel periodo metà-fine gestazionale può interferire con il parto, per esperimenti che segnano le cellule nel periodo metà-fine gestazionale e li traccia dopo la nascita, il progesterone e tamoxifene deve essere iniettati in concomitanza. Simili ai protocolli nell'embrione, destino Mappatura e analisi clonale delle cellule nel topo adulto può essere intrapresa con l'iniezione intraperitoneale di tamoxifen nell'adulto.
Mappatura di analisi e destino clonale di SMCs utilizza topi portatori di transgeni con l'espressione della ricombinasi Cre sotto il controllo di promotori con attività migliorata nel muscolo liscio. Qui, descriviamo protocolli utilizzando topi portatori di transgeni condizionale Myh11-CreERT2 o Acta2-CreERT2. Myh11 è il marker più specifico di SMCs19; Tuttavia, è downregulated l' aorta Eln(- / -) 9. Acta2 è espresso in paesi del Mediterraneo meridionale, compresi quelli di Eln-aorta null, ma non è più specifico perché essa si esprime anche in altri tipi cellulari. Se questi transgeni condizionale erano "colanti" (cioè, indurre la ricombinazione in assenza del tamoxifene), potrebbe essere problematico, come gli esperimenti non vorrei delineare la tempistica della marcatura delle cellule. La permeabilità di questi transgeni è stato analizzato dalla valutazione dell'attività della beta-galattosidasi in topi che portano un basati su lacZ Cre reporter e Myh11-CreERT2 o Acta2-CreERT2 dopo trattamento del veicolo ( cioè, in assenza di induzione di tamoxifen)11,12. Sulla base di questa analisi questi transgeni sono stati considerati non colante.
Hypermuscularization caratterizza patologie vascolari multiple in esseri umani. Per esempio, stenosi aortica supravalvular (SVAS) è una condizione congenita devastante che è caratterizzata dall'ostruzione delle grandi e medie arterie dovuto l'eccesso SMCs. SVAS risultati dalla perdita della funzione di un allele del gene di ELN e si presenta come entità isolata o, più comunemente, come parte di Williams-Beuren sindrome20,21,22,23,24. ELN(- / -) fenocopia topi mutanti molti aspetti del fenotipo aortico di SVAS18,21,22. Aortiche espianti di embrioni Eln(- / -) sono occluse rapidamente durante la coltura, mentre espianti di wildtype embrioni rimangono brevetto9,18. L'approccio di espianto aortica facilita la selezione per agenti che attenuano la stenosi in elastina aortopathy9. Tuttavia, questo approccio non prendere in considerazione le forze meccaniche o fisiche che l'aorta è soggetto a mentre nel corpo. Così, positivo hits nello screening di espianto aortica dovrebbero essere valutati con modelli di topo mutante Eln in vivo .
Il protocollo di isolamento SMC è un metodo veloce e robusto per ottenere SMCs dall'aorta murino perinatale. Un approccio simile possa essere estrapolato per isolare SMCs da topi adulti. A causa delle sue dimensioni relativamente grandi, l'aorta adulto possa essere aperti longitudinalmente e il adventitia e cellule endoteliali sezionati distanza. Per valutare la purezza delle cellule isolato dall'aorta perinatale o adulto, è importante controllare l'espressione di marcatori SMC (ad es., SMMHC, smoothelin, SM22α e SMA) e la mancanza di espressione di marcatori delle cellule endoteliali (ad es., CD31 e caderina vascolare endoteliale). Un potenziale isolamento alternativo approccio consiste nell'utilizzare la citometria a flusso per isolare fluorescente etichettati SMCs dall'aorta dissecata. Topi portatori di un fluorescente Cre reporter e Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2o Tgln-Cre possono essere utilizzati per etichettare fluorescente SMCs11,12,25, 26,27. In alternativa, i topi transgenici esistenti con il promotore di SMA guida l'espressione di un fluoroforo (cioè, GFP, mCherry o RFP) possono essere usato28,29,30.
Mini-pompe osmotiche impiantate sono utilizzate per fornire la fornitura continua di agenti farmacologici agli animali da laboratorio. Abbiamo impiantato mini-pompe nei topi incinta a E13.5 di consegnare gli agenti per lo sviluppo di embrioni durante il resto del periodo gestazionale9. Per raggiungere gli embrioni, tali agenti devono essere in grado di passare la barriera sangue-placentare. In generale, mini-pompe sono molto ben tollerate e, dato il basso tasso di infezione, gli antibiotici di routine non sono raccomandati. Deiscenza della ferita è rara; Tuttavia, se viene rilevata una deiscenza supera a 4 mm, il mouse dovrebbe essere ri-anestetizzato e la ferita pulita e richiusa con una sutura chirurgica.
Questo lavoro descrive un armamentario di approcci che possono essere utilizzati per studiare la formazione normale della parete aortica embrionale e perinatale durante lo sviluppo, così come dopo perturbazioni in questo processo durante la malattia. Inoltre, questi protocolli possono essere applicati per studiare la manutenzione e la malattia dell'aorta adulto. Gli approcci possono essere estrapolati per altri vasi sanguigni, così come alle strutture non vascolari rivestite con muscolo liscio, come il tratto gastrointestinale o delle vie aeree del polmone. Infine, tecniche simili consente di studiare i tipi di cellule di là del Mediterraneo, quali cellule endoteliali o fibroblasti, come pure l'interazione tra questi tipi di cellule e paesi del Mediterraneo meridionale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Dean Li per la condivisione di protocollo del suo laboratorio per aortica SMC isolamento. Sostegno finanziario è stato fornito dal National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 a D.M.G), l'American Heart Association (sovvenzione dai 14GRNT19990019 a D.M.G) e Yale University (Brown-Coxe Fellowship di A.M. e avvio fondi per D.M.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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