Summary
Protocollen voor het bestuderen van de embryonale en perinatale lymfkliertest aorta met behulp van in vivo klonale analyse en lot toewijzing, aorta explantaten en geïsoleerde gladde spier cellen zijn gedetailleerd hier. Deze uiteenlopende benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta in normale ontwikkeling en de pathogenese in ziekte.
Abstract
De aorta is de grootste slagader in het lichaam. De aorta muur bestaat uit een binnenlaag van endotheliale cellen, een middenlaag van wisselende elastische lamellen en zachte spiercellen (SMCs) en een buitenlaag van fibroblasten en extracellulaire matrix. In tegenstelling tot de wijdverbreide studie van pathologische modellen (bijvoorbeeld atherosclerose) in de volwassen aorta, is veel minder bekend over de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij richten ons op SMCs en protocollen voor de analyse van de voedselproductie en pathogenese van embryonale en perinatale aorta SMCs in normale ontwikkeling en ziekte. In het bijzonder de vier protocollen opgenomen zijn: ik) in vivo embryonale lot mapping en klonen analyse; II) explant embryonale aorta cultuur; III) SMC isolatie van de perinatale aorta; en iv) plaatsing van de subcutane osmotische mini pomp bij zwangere (of niet-drachtige) muizen. Dus, deze benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de origin(s), lot en klonen architectuur van SMCs in de aorta in vivo. Zij maken voor het moduleren van embryonale aorta morfogenese in utero door voortdurende blootstelling aan een farmacologische agenten. Bovendien, geïsoleerde aorta weefsel explants of aorta SMCs inzichten te krijgen in de rol van de specifiek gen doelen tijdens fundamentele processen zoals muscularization, proliferatie en migratie kunnen worden gebruikt. Deze hypothese genererende experimenten op geïsoleerde SMCs en het transplanteren aorta kunnen vervolgens worden beoordeeld in het kader in vivo via farmacologische en genetische benaderingen.
Introduction
De bloedsomloop systems van meercellige organismen functie voor voedingsstoffen en zuurstof naar de cellen die zijn niet in contact met de externe omgeving en het verwijderen van afvalstoffen en koolstofdioxide van deze cellen. In gewervelde dieren bestaat de primaire bloedsomloop uit het hart, welke pompen bloed door middel van een reeks van bloedvaten. De muren van de grote bloedvaten zoals slagaders en aders, bestaan uit drie lagen: ik) de intima, of binnenlaag van endotheliale cellen; II) de media, of de middelste laag van wisselende omtrek langwerpige zachte spiercellen SMCs en elastische lamellen; en iii) de adventitia, of de buitenlaag van bindweefsel en fibroblasten. De overgrote meerderheid van de studies in vasculaire biologie focus op endotheliale cellen, onderzoek naar de vorming van nieuwe endothelial cel omzoomde buizen door middel van angiogenese. In vergelijking krijgen SMCs relatief weinig aandacht. SMCs zijn echter een kritische celtype in de bouw van de normale arteriële muur en vasculaire pathologieën.
De aorta is de grootste kaliber slagader in het lichaam, het ontvangen van de cardiale output van het linkerventrikel van het hart. Het wordt geteisterd door uiteenlopende ziekten bij de mens, met inbegrip van atherosclerose en aneurysma dissectie. In volwassen organismen, worden de aorta en zijn grote takken intens bestudeerd in modellen van vasculaire ziekte. Bijvoorbeeld, hoog vet dieet gevoed muizen die zijn leeg voor de codering van de low-density lipoprotein receptor of apolipoproteïne E, gene ontwikkelen van atherosclerose, en recente lot toewijzing studies blijkt dat bestaande SMCs aanleiding geven tot meerdere celtypen in de atherosclerotische plaque1. In de aorta aneurysma omvatten pathologische veranderingen SMC apoptosis en extracellulaire matrix remodelleren van2,3.
Aanzienlijk minder is gekend over SMC genuitdrukking en pathogenese tijdens de embryonale en perinatale periode. Wij bieden hier protocollen voor studeren embryonale en perinatale aorta SMCs in vivo, in weefsel explantaten en geïsoleerde cellen. Bijvoorbeeld, bakent het eerste deel van het protocol lot mapping en klonen analyse in embryonale muizen. CRE recombinase uitgedrukt onder de controle van de promotor van een cel-specifieke vergemakkelijkt de markering van de specifieke cellen en hun nageslacht4,5,6; temporele controle van cel-specifieke etikettering kan echter uitdagende zijn tijdens de embryonale ontwikkeling in muizen. In dit verband bieden met embryo's uiting geven aan de voorwaardelijke CreER onder actief in SMCs (e.g.,Myh11 of Acta2) en een Cre-verslaggever, de promotor wij de methoden voor het injecteren van tamoxifen of zijn actieve metaboliet 4-OH-tamoxifen in zwangere dammen en voor het analyseren van de gelabelde cellen in embryo's of postnatale nakomelingen. Bovendien, in tegenstelling tot lot toewijzing studies, waarvoor voornamelijk gebruik maken van Cre verslaggevers met een enkele verslaggever fluorophore1,7, klonen analyse is aanzienlijk verbeterd met Multi-Color Cre verslaggevers.
De tweede en derde van protocol beschreven methoden om te isoleren en kweken van embryonale aorta explantaten en aorta SMCs van pasgeborenen, respectievelijk. Deze benaderingen toestaan voor het manipuleren van signaalroutes, specifiek in de aorta explantaten of SMCs, en voor het analyseren van de directe effecten van farmacologische agenten. Zo kan de rol van specifieke genen in het weefsel van belang worden vertoond in een veel snellere manier dan door middel van traditionele genetische manipulaties in muizen. Bovendien, de geïsoleerde SMC studies vergemakkelijken de analyse van cel migratie en adhesie, die technisch beperkt in vivo.
Tot slot, de vierde protocol sectie bakent de plaatsing van een subcutane osmotische mini pomp geladen met farmacologische agenten in zwanger (of niet-drachtige) muizen. Deze methode vereenvoudigt de analyse van het effect op de ontwikkeling van het embryo veroorzaakt door agentia die continue infusie vanwege snelle stofwisseling vereisen. Het alternatief voor frequente injecties is niet praktisch voor veel agenten en moet worden voorkomen, aangezien het groot ongemak in de zwangere dam veroorzaken kan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle protocollen van de muis zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Yale University.
1. In Vivo embryonale lot Mapping en klonen analyse
Opmerking: We hebben deze benaderingen wijd gebruikt om te evalueren van de oorsprong van cellen en hun klonen architectuur in ontwikkeling en ziekte modellen 7 , 8 , 9 , 10.
- instellen paring tussen muizen met een CreER en muizen met een verslaggever van de Cre.
Opmerking: Een CreER wordt gebruikt voor SMC markering; Myh11-CreERT2 of Acta2-CreERT2 muizen 11 , 12 wordt meestal gebruikt voor dit doel. ROSA26R-CreERT2 muizen 13 hebben we gebruikt voor het in grote lijnen het markeren van embryonale weefsels.- Voor de analyse van het klonen, gebruik een multi-color Cre verslaggever (bijvoorbeeld Confetti of Rainbow [Rb] muizen) 8 , 14 , 15 en gebruiken voor het omzetten van de Lot, een eenkleurige Cre verslaggever (bijvoorbeeld ROSA26R-YFP muizen 16) of de dubbel-kleur Cre verslaggever ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Opmerking: Deze regeling fok gebruikt volwassen muizen die zijn 2-6 maanden oud (over het algemeen ~ 30 g) en zal het genereren van embryo's met een CreER en een verslaggever Cre.
- Voor de analyse van het klonen, gebruik een multi-color Cre verslaggever (bijvoorbeeld Confetti of Rainbow [Rb] muizen) 8 , 14 , 15 en gebruiken voor het omzetten van de Lot, een eenkleurige Cre verslaggever (bijvoorbeeld ROSA26R-YFP muizen 16) of de dubbel-kleur Cre verslaggever ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Für die vaginale stekkers in de ochtend met behulp van een metalen sonde en 's middags op de dag van plug detectie als embryonale dag (E) 0,5 overwegen.
- Scheiden van het vrouwtje van de man, wanneer een stekker wordt gedetecteerd.
- Voorbereiden 4-OH-tamoxifen en tamoxifen werkende oplossingen.
- Voor 4-OH-tamoxifen, los 5 mg in 50 µL van 100% ethanol, vortex gedurende 2 minuten en voeg toe 450 µL van maïsolie. Op het ijs, bewerk ultrasone trillingen ten uitvoer niveau 2 voor 10 s cycli met rust tussen cycli totdat monster afkoelt. Nadat het monster volledig is opgelost (meestal ~ 4-5 cycli van ultrasoonapparaat), nemen 200 µL van sonicated oplossing en los op in 1800 µL van maïsolie om definitieve werkoplossing (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
- Voor tamoxifen, Verdun tot 50 mg/mL in 100% ethanol en vortex totdat het is opgelost. Verdund in maïsolie te maken van de definitieve werkoplossing (tamoxifen, 10 mg/mL) toe en roer bij 45 ° C om ervoor te zorgen dat het volledig is opgelost.
- Voor vroege embryonale inductie, injecteren 4-OH-tamoxifen intraperitoneally een zwangere dam.
- 4-OH-tamoxifen injecties (tot ~ 150 µg per zwangere muis, of ongeveer 5 mg/kg lichaamsgewicht) gebruikt E5.5 en vervolgens als zij levensvatbaar dam, embryo's en pups opleveren.
- Gebruik tamoxifen bij doses van 0,5 - 1,5 mg (of 17-50 mg/kg) voor dammen zwangere met embryo's op ~ E9 en daarna. Gebruik een naald 30G voor alle injecties.
Opmerking: Filtratie door een 0,22 µm filter wordt meestal gebruikt om alle mengsels vóór injectie te steriliseren.
- Voor de analyse van het klonen, gebruik intraperitoneaal injecties van hoge doses van 4-OH-tamoxifen (b.v., 5 mg/kg) of tamoxifen (b.v., 50 mg/kg) naar aanleiding van meerdere cellen.
- Afzonderlijke cellen markeren, Titreer beneden de 4-OH-tamoxifen of tamoxifen dosis zodanig dat in het weefsel van belang (dat wil zeggen, de aorta), hebben bijna alle embryo's geanalyseerd (zoals hieronder beschreven aan het einde van deze sectie) ofwel geen cellen met het label of de alleen cellen van een enkele kleur; Dit is de drempel dosis.
- Om te markeren van cellen in de midden-eind zwangerschapsduur periode en op te sporen hun lot of tentiemechanismen in de postnatale muis, injecteren progesteron in de intraperitoneaal holte van de zwangere dam gelijktijdig met tamoxifen in een 1:2 (progesteron: tamoxifen) dosis verhouding.
Opmerking: Tamoxifen doses zijn 17-50 mg/kg en progesteron doses zijn 8,5-25 mg/kg (dat wil zeggen, de helft van de tamoxifen doses). De progesteron-injectie kan arbeid door ~ 1-2 dagen vertragen. - Euthanaseren de dam zwanger van embryo's van een gewenste leeftijd met een daling van de open methode, waar de dam wordt gebracht in een recipiënt met katoen of gaas doorweekt met onverdunde Isofluraan. Bevestigen van dood door het openen van de borstholte om te induceren pneumothorax, door het verwijderen van de vitale organen en/of door het uitvoeren van cervicale dislocatie.
- Reinigt de buik met 70% ethanol. Gebruik schaar aan de buik opengesneden en ontleden uit de baarmoeder. De embryo's verwijderen van de baarmoeder en zorgvuldig het scheiden van de embryo's van de placenta en de dooierzak met pincet.
- De embryo's op E15 of ouder door het uitvoeren van de cervicale dislocatie of onthoofding met chirurgische schaar of een scherp mes euthanaseren.
Opmerking: Embryo's jonger dan E15 snel sterven na euthanasie van de moeder en/of de verwijdering van de embryo's van moeder. - Plaats van de embryo's in ijskoude PBS en knip een klein stukje van de staart met behulp van schaar naar genotype voor de verslaggever CreER en Cre.
- Bevestigen de embryo's in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C voor 2 h. Wash de embryo's die drie keer in PBS en vervolgens uit te broeden de embryo's 30 gewichtspercenten sacharose in PBS in 15 mL buizen, te wachten totdat ze zinken, die tot twee dagen kan duren.
- Vulling kunststof bevriezing mallen tot 2/3 van maximumgehalte met optimale snijden temperatuur (OCT) samengestelde. Plaats elk embryo verticaal in de mal, volledig ondergedompeld in oktober Incubate gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om te minimaliseren van bubbels.
- Plaats bevriezing weefsel blokken rechtop in een droog ijs, 70% ethanol bad te bevriezen. Opslaan van de blokken op -80 ° C.
- De cryostaat temperatuur instellen tot-22 ° C en blokken voor het genereren van transversale secties door de gehele aorta, 10-20 µm dik gesneden. Droog de dia's op RT gedurende 30 minuten vóór ze op te slaan op -80 ° C.
- Ontdooi de dia's op RT, beschermd tegen licht te vermijden het bleken van fluorophores. Wassen van de dia's met PBS-Tween20 0,1%.
- Voor de analyse van het klonen, vlek van de dia's voor kernen (DAPI, 5 mg/mL) en direct beeld andere fluorophores in de regenboog Cre-verslaggever (Cerulean: 433-nm excitatie max, 475-nm uitstoot max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Gebruik de volgende filters voor het opsporen van fluorophores met een rechtop fluorescente microscoop: DAPI (excitatie max/bandbreedte 350/50 nm, emissie max/bandbreedte 460/50 nm), Cerulean (excitatie 436/20 nm, emissie 480/40 nm), texas rood (excitatie 560 / 40 nm, emissie 630/75 nm) en aangepaste filter te scheiden van mCherry van mOrange (excitatie 577/10 nm, emissie 630/50 nm).
- Voor de toewijzing van de lot met de mTmG Cre verslaggever, detecteren GFP (484 nm, 510 nm), door rechtstreeks imaging of door middel van immunokleuring. Gebruik een GFP-filter (excitatie 470/40 nm, emissie 525/50 nm) voor beeldbewerking met een rechtop fluorescente microscoop.
- Voor immunokleuring, incubeer secties met primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C, wassen met 0,1% Triton X-100 in PBS en vervolgens uit te broeden met secundaire antilichamen voor 1 h. Gebruik anti-CD31 (eindconcentratie 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) en Cy3-direct geconjugeerd anti-SMA (1:500 in de uiteindelijke verdunning) primaire antilichamen en gebruik secundaire antibodies rechtstreeks geconjugeerd met fluorophores (1:500 in de uiteindelijke verdunning) (Zie de Tabel van de materialen).
- Voor de analyse van het klonen, vlek van de dia's voor kernen (DAPI, 5 mg/mL) en direct beeld andere fluorophores in de regenboog Cre-verslaggever (Cerulean: 433-nm excitatie max, 475-nm uitstoot max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Afbeelding van dia's met een rechtop fluorescente microscoop (vergroting: 4 X - 20 X) of confocal microscoop (10 X-63 X). Voor hoge vergroting, gebruikt u een confocal imaging 63 x olie doelstelling met een numerieke diafragma voor 1.4-0.6 en een framegrootte van 1024 x 1024 pixels.
2. Explant embryonale Aorta cultuur
Opmerking: deze benadering werd eerder gebruikt om te evalueren van de rol van integrine beta3 in stenose van de transplanteren Eln (- / -) embryonale aorta 9 , 18.
- een getimede-zwangere dam bij E15.5 door overtollige Isofluraan inademing, per stap 1.8, boven euthanaseren.
- Oogst en de embryo's, per stappen 1.9-1.10, boven euthanaseren.
- Plaats van het embryo blindelings en pin van de uitgebreide ledematen aan de dissectie van bestuur. Visualiseren met een dissectie stereoscoop en gebruik van schaar te snijden een verticale insnijding uit de buik door het borstbeen naar het bovenste thorax. Ontleden weg de thymus, luchtpijp, longen, slokdarm, darm en lever.
- Het hart ventrally met pincet Trek zachtjes en gebruiken van schaar te ontleden de aorta uit de buurt van de dorsale aspect van de borst- en buikholte Holten. Om los van de aorta, snijd het op de proximale wortel en de distale abdominale posities.
- Plaatst de aorta in ijskoude steriel PBS in een cel cultuur kap. De aorta overbrengen in een 24-well-plate en cultuur het in DMEM met 0,5% FBS gedurende maximaal 24 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Het kweekmedium kunnen worden aangevuld met een blokkerende antilichamen (bijvoorbeeld anti-integrine αvβ3 antilichaam aan 0,02 mg/mL 9; Zie de Tabel van materialen) of een farmacologische agent. - Wassen van de aorta tweemaal met PBS en vervolgens repareren met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten
- Wassen driemaal met PBS en overdracht de aorta naar een 1.5-mL tube met 30% sacharose in PBS. Nadat de aorta zinkt, maken bevroren weefsel blokken, gesneden secties en immunokleuring, zoals hierboven beschreven in stappen 1.13-1.15,.
3. SMC isolatie van de perinatale Aorta
Opmerking: deze aanpak wordt momenteel gebruikt om te vergelijken van de biologie van de aorta SMCs geïsoleerd van Eln (- / -) en wildtype perinatale muizen.
- Een RattenUitrustingen pup op postnatale dag (P) 0,5, cervicale dislocatie of door onthoofding met chirurgische schaar of een scherp mes, zoals beschreven in stap 1.10, boven euthanaseren.
- Stap 2.3 uitvoeren en vervolgens, na het openen van de borstkas en de buik, punctie linkerventrikel met 23G naald. Gebruik plastic buizen de naald verbinden met steriel PBS-bevattende spuit gehouden verticaal op een verhoogde positie zodat PBS mondt uit in het linkerventrikel door de zwaartekracht. Toestaan infusie van steriele PBS in linkerventrikel totdat de lever blanches.
- Gebruik van pincet te verwijderen adventitial weefsel aan de buitenkant van de aorta en het ontleden van de aorta, zoals beschreven in stap 2.4.
- Verteren de aorta in één enkele oplossing van DMEM (500 µL) aangevuld met 225 U/mL collagenase, 2,25 U/mL elastase en 1 x antibiotica-antimycotic gedurende 45 minuten bij 37 ° C. handmatig schudden de buis elke 5-10 min.
- In de steriele cel cultuur kap, titurate het verteerd weefsel door pipetteren op en neer met een 200-µL pipet voor het genereren van een eencellige schorsing. Spoel de eencellige suspensie voor een tube van 15 mL, voeg toe 2 mL DMEM en centrifugeer bij 920 x g gedurende 5 min op 25 ° C.
- Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 3 mL SMC kweekmedium (DMEM met 10% FBS aangevuld met 1 µg/mL rhFGF, rhEGF van 10 µg/mL, 100 U/mL penicilline/streptomycine en 2,5 µg Mo/mL amfotericine B). Overbrengen naar een cultuur van 35-mm plaat.
Opmerking: Op de eerste isolatie, ~ 400.000 cellen worden verkregen van een enkele P0.5 wildtype aorta; ~ 300.000 van deze cellen zijn SMCs. - Cultuur de cellen bij 37 ° C en omzetten in verse SMC kweekmedium om de 3 dagen. Het gebruik van standaardtechnieken met trypsine, passage de cellen bij confluent. Gebruik voor experimenten, cellen van passages 3-7.
4. Subcutane osmotische mini pomp plaatsing in zwanger (of niet-zwanger) muizen
Opmerking: deze benadering was vroeger continu leveren een farmacologische agent (bijvoorbeeld integrine β3 en β5-remmer cilengitide) embryo's in de baarmoeder 9. De pomp werd ingevoegd in de zwangere dam bij E13.5 en behield tot aan de bevalling.
- Anesthetize de muizen met 2-5% Isofluraan in zuurstof (debiet van 1 L/min) voor inductie en 1-3% voor onderhoud. Gebruiken de teen-snuifje reflex om te controleren van het niveau van de anesthesie en de verdoving agent naar wens aanpassen. Beheren van subcutane buprenorfine (0.05 - 0.1 mg/kg) voor analgesie. De onderrug scheren
- met tondeuse. Gebruik van steriele gordijnen, handschoenen en instrumenten en het onderhoud van de muizen op een chirurgische verwarmingsplaat tijdens chirurgie.
- Plaatst u elke muis in liggend en de rug Schrob met betadine gevolgd door isopropyl alcohol. Ongeveer 3-5 cm rostraal van de basis van de staart in de onderrug, maken met een scalpel een horizontale huid incisie 0.5 - 1.0 cm in lengte zonder de onderliggende spier verwonden.
- Een hemostat invoegen in de incisie en maken een subcutane zak rostrally voor de innesteling van de pomp door het openen en sluiten van hemostat kaken.
- Vul een osmotische mini pomp met de agent van keuze, volgens de fabrikant ' s richtsnoeren (Zie de Tabel van de materialen). Plaats van de gevulde pomp in de zak en sluit de incisie met clips of niet-absorbeerbare draadjes van de 6-0. Zorgen dat de totale tijd die chirurgische minder dan 10 min. is De muizen elke 15 min volgen
- post-operatively, totdat zij hebben hersteld van sternale ligcomfort. Beheren van subcutane buprenorfine (0.05 - 0.1 mg/kg) elke 6-12 h gedurende 48 uur. Wanneer de muizen hebben volledig hersteld van de narcose, controleren hen dagelijks. De clips verwijderen of hechtingen 7-10 dagen na chirurgie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een representatieve klonale analyse van SMCs in embryo's mutant voor Eln (het gen codering van de extracellulaire matrix proteïne elastine), Eln(+/-), Acta2-CreERT2 muizen werden gedekt door Eln(+/-) muizen ook dragen de Multi kleur ROSA26R(Rb/Rb) verslaggever. Zoals beschreven in stap 1, stekkers werden gecontroleerd, zwangere dammen waren geïnduceerde met een enkele tamoxifen injectie (1,5 mg) bij E12.5 en zij werden geofferd op E18.5. Embryo's werden gekapt, vaste bevroren en gegenotypeerde. Dwarse aflopende aorta cryosecties werden gesneden. Secties van Eln(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) embryo's aangeven dat de overtollige binnenlaag SMCs die zich in de Eln ophopen-null muizen (vanaf na E15.5) zijn gekenmerkt door meerdere kleuren ( Figuur 1) en vandaar ontlenen meerdere alpha-gladde spier actine (SMA)+ cellen die aanwezig zijn bij ~ E12.5. In de aorta E12.5 zijn SMA+ cellen beperkt tot de tunica media.
Voor het genereren van Eln(- / -) embryonale aortas voor explantaten, mannelijke en vrouwelijke Eln(+/-) muizen werden gekruist. Met behulp van methoden die zijn beschreven in stap 2 stekkers werden gecontroleerd en zwangere Eln(+/-) dammen werden geofferd op E15.5. De aortas waren geïsoleerd van Eln(- / -) embryo's en gekweekte voor 0 of 18 h in aanwezigheid van een anti-integrine-β3 blokkeren antilichaam of een IgG1-besturingselement. Aortas werden vervolgens vastgesteld, bevroren, en cryosectioned, en cryosecties werden gekleurd voor SMA (SMC marker), CD31 (endothelial cel marker), en kernen (DAPI) (Figuur 2). De resultaten tonen aan dat binnen 18 h van het kweken, de aorta E15.5/Eln(- / -) hypermuscular wordt en stenotic. Dit proces is verzwakt door een anti-integrine β3 blokkerende antilichamen.
SMCs werden geïsoleerd van de aorta van wildtype muizen op P0.5. Zoals beschreven in stap 3, SMCs werden geïsoleerd van de ontleed neonatale aorta door enzym spijsvertering en werden gekweekt. Cellen waren gepasseerd, en passage 3 cellen waren bevlekt voor SMC markeringen (dat wil zeggen, SMA, gladde spieren myosin zware ketting (SMMHC) of transgelin (ook bekend als SM22α)), CD31 en kernen (DAPI) (Figuur 3). De meeste van de gekweekte cellen express SMC markeringen maar niet CD31.
Om te evalueren of farmacologische remming van integrine-β3 hypermuscularization en stenose van de Eln(- / -) aorta in vivo, wij voortdurend kan verzachten de Inhibitor van de omwenteling-cilengitide toegediend vanwege haar korte halfwaardetijd in plasma. Eln(+/ −) mannetjes en vrouwtjes werden gekruist, en, zoals beschreven in stap 4, osmotische minipompen-geladen met cilengitide werden geïmplanteerd in zwangere dammen op E13.5. Op P0.5, pups waren euthanized en gegenotypeerde, en hun aortas werden geanalyseerd. Cilengitide behandeling aanzienlijk verzwakt aorta stenose en hypermuscularization bij Eln(- / -) muizen (Figuur 4) zonder dat de aorta wildtype9. Anti-integrine-β3 is dus een potentieel veelbelovende noninvasive aanpak voor de behandeling van elastine aortopathy.
Figuur 1 . Overtollige SMCs in de Aorta Eln(- / -) ontlenen aan meerdere bestaande SMCs. Dammen zwanger van Eln(- / -), Acta2-CreERT2 embryo's ook met de multicolor Cre-verslaggever ROSA26R(Rb / +) waren geïnduceerde met een enkele intraperitoneale injectie van tamoxifen (1,5 mg) op E12.5. Dammen werden geofferd op E18.5, en transverse secties van de aflopende aortas, van de embryo's werden geanalyseerd, met vlekken voor DAPI en de directe fluorescentie van Rb kleuren, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) en mOrange (mOr). Overtollige SMCs ophopen in de innerlijke aspect van het Eln-null aorta na E15.518. De overtollige inner-laag SMCs voorzien van cellen van meerdere kleuren (sterretjes), die polyclonality aangeeft. Lu, aorta lumen. Schaal bar, 10 µm. herdrukt uit Misra et al., 2016-9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Anti-αvβ3 integrine blokkade verzwakt Hypermuscularization en stenose van de aorta Explant van Eln(- / -) . E15.5, zwangere dammen waren euthanized en de aortas van Eln(- / -) embryo's zijn geoogst. Geïsoleerde aortas waren ofwel onmiddellijk bevestigd of gekweekt in het bijzijn van een besturingselement voor een isotype IgG1 of een integrine αvβ3 blokkerende antilichamen tegen 18u voorafgaand aan de fixatie. Vaste aortas werden gekleurd voor CD31, SMA en kernen (DAPI). Lu, aorta lumen. Schaal bar, 100 µm. herdrukt uit Misra et al., 2016-9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Geïsoleerd en gekweekt aorta SMCs van neonatale muizen uitdrukkelijke glad spierweefsel Markers. SMCs waren geïsoleerd uit P0.5 pups en werden gekweekt. Cellen uit de derde passage waren vastgesteld en gekleurd voor CD31 (EG-markering), kernen (DAPI), en een SMC marker (SMA, SM22α, of SMMHC, zoals aangegeven). Deze analyse geeft aan dat ~ 90% van de gekweekte cellen SMC markeringen uitspreken, en niemand wil CD31 werden waargenomen. Schaal bar, 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Continue infusie van Cilengitide In Vivo verzwakt Eln(- / -) aorta Hypermuscularization en stenose. Mannelijke en vrouwelijke Eln(+/-) muizen werden gekruist. Het integrine β3 remmer cilengitide of voertuig (PBS) was continu toegediend in zwangere dammen met osmotische mini-pompen basisgewicht van E13.5. Transversale secties op P0.5 werden gekleurd voor SMA (rood), CD31 (wit) en kernen (DAPI, blauw). Lu, aorta lumen. Schaal bar, 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In tegenstelling tot het uitgebreide onderzoek van de lymfkliertest aorta en zijn grote takken in volwassen pathologische condities, zoals de modellen van atherosclerose, is minder bekend met betrekking tot de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij concentreren op de embryonale/perinatale aorta, specifiek het SMCs, en protocollen om te bestuderen van de aorta door middel van in vivo, weefsel explant, verstrekken en SMC isolatie benaderingen. Deze gratis methoden bieden de onderzoeker met uiteenlopende benaderingen ter studie van de embryonale/perinatale aorta.
Klonen analyse is een zeer krachtige benadering waarmee een te onderzoeken van het gedrag van afzonderlijke cellen. Onlangs hebben we deze aanpak gebruikt om te helpen identificeren van gespecialiseerde SMCs in de pulmonaire therapieën10. Het is van cruciaal belang te erkennen dat, in een afzonderlijke muis een multi-color Cre verslaggever uitvoering, is er een kans dat cellen van dezelfde kleur aan meer dan één recombinatie gebeurtenis ontlenen kon. Klonen analyse met een verslaggever Multi-Color vereist dus, de evaluatie van talrijke muizen. Omdat tamoxifen in de midden-eind zwangerschapsduur periode kan interfereren met de bevalling, voor experimenten die cellen markeren in de midden-eind zwangerschapsduur periode en sporen hen postnatale stadium manifesteren, moeten progesteron en tamoxifen gelijktijdig worden geïnjecteerd. Gelijkaardig aan protocollen in het embryo, lot mapping en klonen analyse van cellen in de volwassen muis kunnen worden ondernomen met het intraperitoneaal injecteren van tamoxifen in de volwassene.
Klonen analyse en lot toewijzingen voor SMCs worden muizen transgenen met de uitdrukking van Cre recombinase onder de controle van initiatiefnemers uitvoering met verbeterde activiteit in de gladde spieren gebruikt. Hier beschrijven we protocollen met behulp van muizen uitvoering van voorwaardelijke transgenen Myh11-CreERT2 of Acta2-CreERT2. Myh11 is de meest specifieke marker van SMCs19; het is echter werden in de Eln(- / -) aorta9. Acta2 wordt uitgedrukt in SMCs, waaronder die van het Eln-null aorta, maar het is niet zo specifiek omdat het wordt ook uitgedrukt in andere celtypes. Als deze voorwaardelijke transgenen "lekke" (dat wil zeggen, induceren recombinatie bij het ontbreken van tamoxifen), het problematisch zou kunnen zijn aangezien de experimenten zou de timing van cel markering niet af te bakenen. De leakiness van deze transgenen was geanalyseerd door de beoordeling van de beta-galactosidase-activiteit in muizen dragen een lacZ gebaseerde Cre verslaggever en Myh11-CreERT2 of Acta2-CreERT2 na behandeling van het voertuig ( dat wil zeggen, bij gebrek aan tamoxifen inductie)11,12. Op basis van deze analyse, deze transgenen werden als niet beschouwd lekkende.
Hypermuscularization kenmerkt meerdere vasculaire aandoeningen bij de mens. Bijvoorbeeld, is supravalvular aorta stenose (SVAS) een verwoestende aangeboren aandoening die wordt gekenmerkt door de verstopping van de slagaders van de grote en kleine en middelgrote als gevolg van overtollige SMCs. SVAS resultaten uit het verlies van functie van één allel van een gen ELN en treedt op als een geïsoleerde entiteit of, meer algemeen, als onderdeel van Williams-Beuren syndroom20,21,22,23,24. ELN(- / -) mutant muizen phenocopy vele aspecten van de aorta fenotype van SVAS18,21,22. Aorta explantaten van Eln(- / -) embryo's worden snel geroteerd tijdens cultuur, overwegende dat explantaten van wildtype embryo's patent9,18 blijven. De aanpak van de aorta explant vergemakkelijkt screening voor agenten die stenose in elastine aortopathy9te verzachten. Echter, deze aanpak doet niet rekening houden met de mechanische of fysieke krachten die de aorta is onderworpen aan terwijl in het lichaam. Dus moeten positieve hits in de aorta explant screening worden beoordeeld met de in vivo Eln mutant Muismodellen.
Het SMC isolatie-protocol is een snelle en robuuste werkwijze te halen SMCs van de perinatale lymfkliertest aorta. Een soortgelijke aanpak kan worden geëxtrapoleerd SMCs isoleren van volwassen muizen. Gezien de relatief grote omvang, de volwassen aorta lengterichting kan worden geopend en de adventitia en de endotheliale cellen ontleed weg. Om te beoordelen van de zuiverheid van de cellen van de perinatale of volwassen aorta geïsoleerd, is het belangrijk om te controleren voor de expressie van SMC markers (bijv, SMMHC, smoothelin, SM22α en SMA) en het gebrek aan expressie van endothelial cel markers (b.v., CD31 en vasculaire endothelial cadherine). Een potentieel alternatieve isolatie benadering is het gebruik van stroom cytometry te isoleren fluorescently label SMCs van de ontleed aorta. Muizen dragen van een fluorescerende Cre-verslaggever en Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2of Tgln-Cre kunnen worden gebruikt om fluorescently label SMCs11,12,25, 26,27. U kunt ook kunnen bestaande transgene muizen met de promotor van de SMA rijden de uitdrukking van een fluorophore (dat wil zeggen, GFP, mCherry of RFP) gebruikte28,29,30.
Geïmplanteerde osmotische mini-pompen worden gebruikt om de continue levering van farmacologische agenten aan proefdieren. Wij hebben mini-pompen in zwangere muizen op E13.5 agenten leveren aan de ontwikkeling van de embryo's gedurende de rest van de zwangerschapsduur periode9ingeplant. Om te bereiken de embryo's, moeten ingebrachte kunnen passeren de bloed-en placenta. In het algemeen, mini-pompen worden zeer goed verdragen en, gezien de lage koers van de infectie, routinematig antibiotica worden niet aanbevolen. Wond dehiscentie is zeldzaam; Als echter een groter is dan 4 mm dehiscentie wordt gedetecteerd, de muis moet opnieuw narcose en de wond gereinigd en weer met een chirurgische hechtdraad gesloten.
Dit werk beschrijft een arsenaal van benaderingen die kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de normale vorming van de embryonale en perinatale aorta muur tijdens ontwikkeling, alsmede na verstoringen in dit proces tijdens ziekte. Daarnaast kunnen deze protocollen worden toegepast om te studeren, het onderhoud en de ziekte van de volwassen aorta. Benaderingen kunnen worden geëxtrapoleerd naar de andere bloedvaten, alsmede aan de gladde spieren beklede niet-vasculaire structuren, zoals het maag-darmkanaal of de luchtwegen van de longen. Ten slotte, soortgelijke technieken kunnen worden gebruikt om te studeren celtypes buiten SMCs, zoals endotheliale cellen of fibroblasten, evenals de interactie tussen deze cellen typen en SMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We dank Dean Li voor het delen van zijn laboratorium protocol voor aorta SMC isolatie. Financiering van de steun werd geboden door de National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 en R01HL133016 naar D.M.G), de American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 naar D.M.G.), en Yale University (Brown-Coxe Fellowship aan A.M. en opstarten fondsen aan D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
