Summary
פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.
Abstract
אבי העורקים הוא העורק הגדול ביותר בגוף. הקיר אבי העורקים מורכב של השכבה הפנימית של תאי אנדותל, שכבה אמצעית לסירוגין lamellae אלסטית ותאי שריר חלק (SMCs), השכבה החיצונית של fibroblasts, מטריצה חוץ-תאית. בניגוד המחקר הנרחב של מודלים פתולוגי (למשל, טרשת עורקים) באבי העורקים למבוגרים, הרבה פחות ידוע על הלידה של אבי העורקים. כאן, אנו מתמקדים SMCs ולספק פרוטוקולים עבור הניתוח של מורפוגנזה ו בפתוגנזה של הלידה של אבי העורקים SMCs להתפתחות התקינה, המחלה. באופן ספציפי, הפרוטוקולים ארבע כללה הן: אני) ויוו גורל עובריים מיפוי וניתוח המשובטים; ii) explant העורקים עובריים תרבות; iii) SMC בידוד מן העורקים הלידה; ו- iv) תת עורית משאבת מיני osmotic השמה בעכברים בהריון (או שאינה בהריון). לפיכך, גישות אלה לקדם את החקירה של origin(s), גורל, אדריכלות המשובטים של SMCs אבי העורקים vivo בתוך. הם מאפשרים להתכוונן העורקים עובריים מורפוגנזה בתוך הרחם על ידי חשיפה מתמשכת סוכנים תרופתי. בנוסף, מבודד רקמות אבי העורקים explants או SMCs של אבי העורקים יכול לשמש כדי לקבל תובנות לגבי התפקיד של גנים ספציפיים מטרות במהלך תהליכי יסוד כגון muscularization, הפצה, העברה. ניסויים אלה השערת מניבות SMCs מבודדים, העורקים explanted יכול להידרש ואז בהקשר ויוו דרך גישות תרופתי גנטי.
Introduction
מערכת הדם של אורגניזמים רב תאיים פונקציה כדי לספק חומרים מזינים וחמצן לתאים כי הם לא בקשר עם הסביבה החיצונית כדי להסיר תאים אלה הפסולת, פחמן דו-חמצני. החוליות, מורכבת מערכת הדם העיקריים הלב, אשר שואב דם דרך סדרה של כלי הדם. דפנות כלי דם גדולים, כגון העורקים והוורידים, מורכבת משלוש שכבות: אני) אינטימה או השכבה הפנימית של תאי אנדותל; ii מדיה), או שכבה אמצעית לסירוגין circumferentially מוארך תאי שריר חלק SMCs ואת lamellae אלסטית; ו- iii) adventitia, או השכבה החיצונית של רקמות החיבור ואת fibroblasts. הרוב המכריע של לימודי ביולוגיה וסקולרית מתמקדים תאי אנדותל, חוקר היווצרות חדשים אנדותל מצופה תא צינורות דרך אנגיוגנזה. לשם השוואה, SMCs מקבלים תשומת לב מועטה יחסית. עם זאת, SMCs הם סוג תא קריטי בניית הקיר עורקי נורמלי, פתולוגיות כלי הדם.
אבי העורקים הוא העורק בקוטר הגדול ביותר בגוף, מקבל את תפוקת הלב של החדר השמאלי של הלב. זה הוא נגועים על ידי מחלות אנושיות מגוונות, כולל טרשת עורקים, מפרצת לנתיחה. אורגניזמים למבוגרים, אבי העורקים ואת סניפיה הגדולים נלמדים באופן אינטנסיבי במודלים של מחלת כלי דם. למשל, בשומן האכיל עכברים שאינם null עבור הגן קידוד של קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה או אפוליפופרוטאין E, לפתח טרשת עורקים, מחקרים אחרונים של מיפוי גורל מציינים כי קיימים SMCs להצמיח סוגי תאים מרובים ב- פלאק טרשת עורקים1. מפרצת אבי העורקים, שינויים פתולוגיים לכלול SMC ואפופטוזיס ו מטריצה חוץ-תאית שיפוץ2,3.
באופן משמעותי פחות ידוע לגבי SMC מורפוגנזה ו פתוגנזה בתקופות של הלידה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים עבור הלומדים הלידה של אבי העורקים SMCs ויוו, explants רקמות, תאים בודדים. למשל, החלק הראשון של הפרוטוקול משרטט גורל מיפוי וניתוח המשובטים בעכברים עובריים. Recombinase Cre הביע תחת השליטה של תאים ספציפיים מקדם מכירות מאפשר הסימון של תאים ספציפיים, שלהם רומא4,5,6; עם זאת, שליטה הטמפורלי של תאים ספציפיים תיוג יכול להיות מאתגר במהלך התפתחות עובריים בעכברים. בהקשר זה, עם עוברי לבטא את CreER מותנה תחת מקדם מכירות פעיל של SMCs (e.g.,Myh11 או Acta2), עיתונאי Cre, אנו מספקים שיטות הזרקת טמוקסיפן או שלה המטבוליט הפעיל 4-OH-טמוקסיפן, סכרים בהריון עבור ניתוח התאים שכותרתו עוברי או צאצא כמחנכת. יתר על כן, בניגוד גורל מיפוי מחקרים, אשר predominately לנצל Cre עיתונאים עם1,fluorophore7כתב יחיד, ניתוח המשובטים באופן משמעותי מוגברת עם צבע רב Cre כתבים.
החלקים השני והשלישי של פרוטוקול מתארים שיטות בידוד, culturing עובריים explants של אבי העורקים, אבי העורקים SMCs מ- neonates, בהתאמה. גישות אלה מאפשרות המניפולציה של איתות המסלולים, בפרט explants של אבי העורקים או SMCs, וכן ניתוח ההשפעות הישירות של סוכנים תרופתי. לפיכך, התפקיד של גנים ספציפיים ברקמות עניין יכולים להיות מוקרן בצורה מהירה הרבה יותר מאשר דרך מסורתית שינויים גנטיים בעכברים. בנוסף, המחקרים SMC מבודד להקל על הניתוח של נדידת תאים, הדבקה, אשר מבחינה טכנית מוגבל בתוך vivo.
בסופו של דבר, החלק הרביעי פרוטוקול מתארת את המיקום של משאבת מיני תת עורית osmotic נטען עם סוכנים תרופתי בהריון (או שאינה בהריון) עכברים. שיטה זו מקלה על הניתוח של ההשפעה על התפתחות הנגרמת על ידי סוכנים הדורשים תקינות בגלל חילוף חומרים מהיר. החלופה של זריקות תכופות אינה מעשית עבור סוכנים רבים, יש להימנע, שכן היא עלולה לגרום אי נוחות משמעותי בסכר בהריון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים העכבר אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת ייל.
1-ב Vivo עובריים גורל מיפוי וניתוח המשובטים
הערה: השתמשנו גישות אלה באופן נרחב כדי להעריך את מקורותיה של תאים ואדריכלות המשובטים שלהם מחלות ופיתוח דגמים 7 , 8 , 9 , 10.
- להגדיר את הזיווג בין עכברים עם CreER עכברים עם עיתונאי Cre.
הערה: CreER משמש SMC סימון; Myh11-CreERT2 או Acta2-CreERT2-עכברים- 11 ,- 12 הוא נפוץ למטרה זו. השתמשנו עכברים ROSA26R-CreERT2 13 לסימון בהרחבה רקמות עובריים.- לניתוח המשובטים, להשתמש צבע רב Cre כתב (למשל, קונפטי או קשת [Rb] עכברים) 8 , 14 , 15 ולהשתמש למיפוי הגורל, צבע יחיד Cre כתב (למשל, ROSA26R-YFP עכברים 16) או הכתב Cre כפול-צבע ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
הערה: ערכת גידול זו משתמשת עכברים בוגרים 2-6 חודשים (בדרך כלל ~ 30 גר'), יפיק עוברי ועם CreER של עיתונאי Cre.
- לניתוח המשובטים, להשתמש צבע רב Cre כתב (למשל, קונפטי או קשת [Rb] עכברים) 8 , 14 , 15 ולהשתמש למיפוי הגורל, צבע יחיד Cre כתב (למשל, ROSA26R-YFP עכברים 16) או הכתב Cre כפול-צבע ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- לבדוק אם מהנרתיק פקקים בבוקר באמצעות מתכת בדיקה ולשקול בצהריים ביום הכנס זיהוי כשמש עובריים (E) 0.5.
- להפריד את הנקבה הזכר כאשר פקק מזוהה.
- הכנת 4-OH-טמוקסיפן ופתרונות עבודה טמוקסיפן.
- עבור 4-OH-טמוקסיפן, יתמוסס 5 מ"ג µL 50 100% אתנול, מערבולת למשך 2 דקות ולאחר מכן להוסיף µL 450 של שמן תירס. על קרח, sonicate ברמה פלט 2 מחזורים 10 s עם נח בין מחזורי עד מדגם יירגע. לאחר דגימה היא התפרקה לחלוטין (בדרך כלל ~ 4-5 מחזורי sonication) µL 200 של פתרון sonicated ו להמיס 1,800 µL של שמן תירס כדי להפוך את הפתרון עובד הסופי (4-OH-טמוקסיפן, 1 מ"ג/מ"ל).
- של טמוקסיפן, לדלל עד 50 מ"ג/מ"ל ב 100% אתנול וביו -מערבולת עד זה היא התפרקה. שתדללו בשמן תירס כדי להפוך את הפתרון הסופי עבודה (טמוקסיפן, 10 מ"ג/מ"ל) ומערבבים ב 45 ° C כדי להבטיח כי זה מפורקת לגמרי.
- עבור אינדוקציה עובריים מוקדם, להזריק 4-OH-טמוקסיפן intraperitoneally לתוך סכר בהריון.
- השתמש זריקות 4-OH-טמוקסיפן (עד 150 ~ µg העכבר בהריון, או בערך 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף)-E5.5 ולאחר מכן כפי הם תשואה סכר קיימא, העוברים ואת הגורים.
- טמוקסיפן שימוש במינונים של 0.5 - 1.5 mg (או 17-50 מ"ג/ק"ג) עבור סכרים בהריון עם עוברי-~ E9 לאחר מכן. שימוש במחט 30G לזריקות כל.
הערה: סינון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 משמשת בדרך כלל כדי לעקר כל תערובות לפני ההזרקה.
- לניתוח המשובטים, להשתמש בקרום הבטן זריקות של מינונים גבוהים של 4-OH-טמוקסיפן (למשל, 5 מ"ג/ק"ג) או טמוקסיפן (למשל, 50 מ"ג/ק"ג) לסימון תאים מרובים.
- כדי לסמן תאים בודדים, titrate למטה המינון 4-OH-טמוקסיפן או טמוקסיפן כזה בתוך הרקמה עניין (קרי, אב העורקים), כמעט כל העוברים ניתוח (כפי שמתואר להלן בסוף סעיף זה) יש או אין תאים עם תוויות או רק תאים של צבע אחד; . זו המנה הסף.
- כדי לסמן את התאים בתקופת אמצע-מאוחר הריונית ולהזריק לעקוב אחר גורלם או clonality העכבר כמחנכת, פרוגסטרון לתוך חלל בקרום הבטן של הסכר בהריון/ת עם טמוקסיפן ב- 1:2 (פרוגסטרון: טמוקסיפן) מינון יחס.
הערה: טמוקסיפן במינונים נמוכים 17-50 מ"ג/ק"ג, פרוגסטרון במינונים נמוכים 8.5-25 מ"ג/ק"ג (כלומר, חצי המנות טמוקסיפן). הזרקת פרוגסטרון עלולה לעכב את העבודה על ידי ~ 1-2 ימים. - Euthanize סכר בהריון עם עוברי של עידן הרצוי באמצעות שיטה פתוחה טיפה, היכן ימוקם הסכר ככלי קיבול המכיל כותנה או גזה ספוגה איזופלוריין מדולל. לאשר מוות על-ידי פתיחת בחלל החזה לזירוז חזה אוויר, על ידי הסרת לאיברים החיוניים, ו/או על ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם.
- לטהר הבטן עם 70% אתנול. להשתמש במספריים כדי לפתוח את הבטן ומנתחים את הרחם. הסר את העוברים הרחם ולאחר הפרד בזהירות את העוברים מן השליה שק החלמון באמצעות מלקחיים.
- המתת חסד את העוברים-E15 ומעלה על-ידי ביצוע או נקע בצוואר הרחם או עריפת ראש עם מספריים כירורגיים או סכין חדה.
הערה: עוברי צעיר יותר E15 למות במהירות בעקבות המתת חסד של האם ו/או ההסרה של העוברים מאמא. - למקם את העוברים ב- PBS קר כקרח, לחתוך חתיכה קטנה של הזנב באמצעות מספריים גנוטיפ עבור הכתבת CreER ו- Cre.
- לתקן העוברים ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור 2 ח' לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב- PBS, ואז דגירה העוברים ב 30% סוכרוז ב- PBS ב 15-mL צינורות, המתנה עד הם שוקעים, אשר עשוי להימשך עד יומיים.
- מילוי פלסטיק קפוא תבניות עד 2/3 של רמה מקסימלית עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. מניחים כל העובר אנכית כייר, לגמרי שקועים Incubate אוקטובר 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי למזער את בועות.
- הקפאת רקמת בלוקים זקוף, קרח יבש, 70% אתנול אמבט להקפיא את המקום. לאחסן הבלוקים ב-80 מעלות צלזיוס
- מוגדר הטמפרטורה cryostat-22 ° C, חותכים כדי ליצור מקטעים רוחבי דרך העורקים כולו, 10-20 מיקרומטר עבה. יבש את השקופיות ב RT למשך 30 דקות לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס
- להפשיר את השקופיות ב RT, מוגן מפני אור כדי למנוע את הלבנה של fluorophores. לשטוף את השקופיות עם PBS-Tween20 0.1%.
- לניתוח המשובטים, מכתים את השקופיות עבור גרעינים (דאפי, 5 מ"ג/מ"ל), ישירות תמונה אחרות fluorophores של הכתב Cre הקשת (Cerulean: 433-nm עירור מקסימום, 475-nm פליטה מקסימום; מורנג: 548 nm, 562 ננומטר; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- שימוש הבאות מסננים לגילוי fluorophores עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקופה: דאפי (עירור מקס/רוחב פס 350/50 ננומטר, פליטה מקס/הגבלות 460/50 ננומטר), Cerulean (עירור 436/20 ננומטר, פליטה 480/40 ננומטר), טקסס אדום (עירור 560 / 40 ננומטר, פליטה 630/75 ננומטר), מסנן מותאם אישית כדי להפריד בין mCherry לבין מורנג (עירור 577/10 ננומטר, פליטה 630/50 ננומטר).
- למיפוי גורל עם הכתב Cre ' mTmG ', לזהות GFP (484 nm, 510 ננומטר), על-ידי הדמיה ישירות או באמצעות immunostaining. עבור הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף להשתמש במסנן ה-GFP (עירור 470/40 ננומטר, פליטה 525/50 ננומטר).
- עבור immunostaining, דגירה מקטעים עם נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C, לשטוף עם 0.1% X-100 Triton ב- PBS, ואז דגירה עם נוגדנים משניים עבור ה 1 השתמש אנטי-CD31 (ריכוז סופי 0.0016 מ"ג/מ"ל), אנטי-GFP (0.006 mg/mL), Cy3-נוגדנים ראשי ישירות מצומדת אנטי-SMA (דילול שבערך הסופי), שימוש משני antibodies מצומדת ישירות אל fluorophores (דילול הסופי שבערך) (ראה את הטבלה של חומרים).
- לניתוח המשובטים, מכתים את השקופיות עבור גרעינים (דאפי, 5 מ"ג/מ"ל), ישירות תמונה אחרות fluorophores של הכתב Cre הקשת (Cerulean: 433-nm עירור מקסימום, 475-nm פליטה מקסימום; מורנג: 548 nm, 562 ננומטר; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- תמונות שקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף (הגדלה: 4 X - 20 X) או מיקרוסקופ קונפוקלי (10 X-63 X). בהגדלה, להשתמש 63 הדמיה קונאפוקלית x המטרה שמן עם הפתח המספרי של 1.4-0.6, גודל מסגרת של 1,024 x 1,024 פיקסלים.
2. Explant תרבות העורקים עובריים
הערה: גישה זו שימשה בעבר כדי להעריך את התפקיד של אינטגרין beta3, היצרות של explanted Eln (- / -.) אב העורקים עובריים 9 , 18.
- המתת חסד סכר מתוזמן-בהריון בשעה E15.5 על ידי שאיפת עודף איזופלוריין, לפי שלב 1.8, מעל.
- קציר, המתת חסד את העוברים, לפי שלבים 1.9-1.10, מעל.
- למקם את העובר supinely ולהדק את הגפיים המורחבת ללוח לנתיחה. דמיין את זה יחד סטריאוסקופ לנתיחה, להשתמש במספריים לחתוך חתך אנכי של הבטן דרך עצם החזה לבית החזה העליון. לנתח משם התימוס, קנה הנשימה, הריאות, הוושט, הכבד, המעי.
- בעדינות משוך הלב. ventrally באמצעות מלקחיים, להשתמש במספריים לנתח העורקים מן ההיבט הגבי של חללים בית החזה והבטן. לשחרור העורקים, תחתוך אותו בהשורש הפרוקסימלית ואת העמדות בטן דיסטלי.
- מקום העורקים PBS קר כקרח סטרילי בשכונה התרבות תאים. להעביר את אבי העורקים צלחת 24-ובכן, תרבות זה ב DMEM עם 0.5% FBS עבור עד 24 שעות-37 מעלות צלזיוס.
הערה: המדיום התרבות ניתן להשלים עם נוגדן של חסימה (למשל, אנטי-אינטגרין נוגדן αvβ3 0.02 נקודות מ"ג/מ"ל 9; ראה הטבלה של חומרים) או סוכן תרופתי. - לשטוף את העורקים פעמיים עם PBS ולתקן אותה עם 4% paraformaldehyde עבור 20 דקות לאחר מכן
- שטיפת שלוש פעמים עם PBS, העברה אבי העורקים אל צינור 1.5-mL עם 30% סוכרוז ב- PBS. אחרי אבי העורקים כיורים, להפוך גושי רקמה קפוא, מקטעים חתוכים ו- immunostain, כמתואר בצעדים 1.13-1.15, מעל.
3. התקן SMC בידוד מן העורקים הלידה
הערה: גישה זו נמצא בשימוש כעת כדי להשוות בין הביולוגיה של אבי העורקים SMCs מבודד עכברים הלידה Eln (- / -.), wildtype.
- Euthanize מאתר כלבלב ביום כמחנכת (P) 0.5, נקע בצוואר הרחם או באמצעות עריפת ראש עם מספריים כירורגיים או סכין חדה, כפי שמתואר בשלב 1.10, מעל.
- בצע שלב 2.3, ואז, לאחר פתיחת את החזה והבטן, לנקב השמאלי עם המחט 23 גרם. צינורות פלסטיק לשימוש להתחבר המחט מזרק המכיל PBS סטרילי מוחזק אנכית במיקום מוגבה כך PBS זורם לתוך החדר השמאלי על ידי הכבידה. לאפשר אינפוזיה של PBS סטרילי לתוך החדר השמאלי עד blanches הכבד.
- להשתמש מלקחיים כדי להסיר את הרקמה adventitial בצד החיצוני של אבי העורקים ומנתחים העורקים כפי שמתואר בשלב 2.4.
- לעכל העורקים ב פתרון יחיד של DMEM (500 µL) בתוספת 225 collagenase U/mL, 2.25 elastase U/mL, ואנטיביוטיקה-antimycotic למשך 45 דקות ב- 37 ° ג ידנית טלטול 1 x הצינור מינימלית בכל 5-10
- בשכונה תא סטרילי תרבות, titurate הרקמה מתעכל על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 200-µL כדי ליצור השעיה תא בודד. התליה תא בודד להעביר צינור 15-mL, להוסיף 2 מ של DMEM ו צנטריפוגה-g 920 x עבור 5 דקות-25 מעלות צלזיוס
- למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של SMC תרבות בינוני (DMEM המכיל 10% FBS בתוספת 1 µg/mL rhFGF, rhEGF µg 10/mL, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין ו 2.5 µg/mL המפוטריצין). להעביר את צלחת תרבות 35 מ מ.
הערה: על בידוד הראשונית, תאים ~ 400,000 מתקבלים מן העורקים wildtype P0.5 יחיד; ~ 300,000 של תאים אלה נמצאים SMCs. - התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס ושנה לבינונית תרבות SMC טריים כל 3 ימים. באמצעות טכניקות סטנדרטי עם טריפסין, המעבר את התאים בעת confluent. לניסויים, להשתמש בתאים של פסוקים 3-7-
4. עכברים השמתם משאבת מיני Osmotic בהריון (או Non-בהריון) תת עורית
הערה: גישה זו שימשה בעבר להעביר ברציפות סוכן תרופתי (למשל, אינטגרין β3 וβ5 מעכב cilengitide) העוברים ברחם 9. המשאבה היה מוכנס בתוך הסכר בהריון-E13.5, נשמר עד parturition.
- עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין 2-5% חמצן (קצב הזרימה של 1 ליטר/דקה) אינדוקציה ו 1-3% לצורך תחזוקה. להשתמש את רפלקס הבוהן-קמצוץ כדי לנטר את רמת ההרדמה, והתאם את הסוכן הרדמה כנדרש. לנהל הבופרנורפין תת עורית (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג) על שיכוך כאבים.
- לגלח את הגב התחתון עם מספריים. השתמש תחבושות חיטוי, כפפות, מכשירים ולשמור על העכברים על מגש כירורגי חימום במהלך הניתוח.
- למקם את כל העכבר במיקום נוטה ותשרוט מאחור עם betadine ואחריו איזופרופיל אלכוהול. כ 3-5 ס מ rostral אל בסיס הזנב בגב התחתון, השתמש אזמל לעשות חתך אופקי העור 0.5 - 1.0 ס מ אורך מבלי לפצוע את השריר שמתחת.
- הכנס עוצר דימום לתוך החתך וליצור כיס תת עורית rostrally להשתלה המשאבה על ידי פתיחה וסגירה של הלסתות עוצר דימום-
- למלא משאבת מיני osmotic עם הסוכן של בחירה, לפי היצרן ' s הנחיות (ראה את הטבלה של חומרים). הוסף את המשאבה מילוי לתוך הכיס וסגור את החתך עם קליפים או תפרים נספגים 6-0. ודא כי הזמן כירורגי הכולל פחות מ 10 דקות
- וכאב לאחר הניתוח, לפקח על העכברים כל 15 דקות עד שהם התאוששו מן recumbency בחזה ובצלעות. לנהל הבופרנורפין תת עורית (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג) כל 6-12 h במשך 48 שעות. כאשר העכברים יש החלימו לחלוטין מן ההרדמה הכללית, לנטר אותם מדי יום. הסר את הקליפים או התפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניתוח נציג המשובטים של SMCs ב עוברים מוטציה עבור Eln (הגן קידוד אלסטין חלבון של מטריצה חוץ-תאית), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 עכברים היו הזדווגו to Eln(+ /-) עכברים נושאת גם צבע רב ROSA26R(Rb/Rb) כתב. כפי שמתואר בשלב 1, תקעים שנבדקו, סכרים בהריון היו המושרה עם זריקה בודדת טמוקסיפן (1.5 מ ג)-E12.5, הם הוקרבו ב E18.5. העוברים היו שנקטפו, קבוע, קפואה ו genotyped. רוחבי יורד cryosections אבי העורקים נחתכו קטעים מתוך Eln(+ /-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) עוברי מציינים כי השכבה הפנימית עודף SMCs זה להצטבר Eln-null עכברים (החל לאחר E15.5) מסומנים באמצעות (צבעים מרובים איור 1) ומכאן נובעות שריר אלפא-חלק מרובים אקטין (SMA)+ תאים שנמצאים נוכח ~ E12.5. באבי העורקים E12.5, תאים SMA+ מוגבלות התקשורת tunica.
כדי ליצור aortas עובריים Eln(- / -.) explants, זכר ונקבה היו הזדווגו עכברים Eln(+ /-) . שימוש בשיטות המתוארות בשלב 2, תקעים שנבדקו וסכרים בהריון Eln(+ /-) הוקרבו ב E15.5. Aortas הם בודדו אותנו מהמתרחש עוברי Eln(- / -.) ותרבותית 0 או 18 h בנוכחות β3 anti-אינטגרין חסימת נוגדן או פקד IgG1. Aortas ואז היה קבוע, קפוא, ו cryosectioned, cryosections היו מוכתמים עבור SMA (SMC מרקר), CD31 (תאי אנדותל מרקר), ואת הגרעינים (דאפי) (איור 2). התוצאות להדגים כי בתוך 18 h של culturing, העורקים E15.5/Eln(- / -.) הופך hypermuscular ו- stenotic. תהליך זה הוא הקלוש מאת נוגדן anti-אינטגרין β3 חסימה.
SMCs הם בודדו אותנו מהמתרחש העורקים של עכברים wildtype-P0.5. כפי שמתואר בשלב 3, SMCs הם בודדו אותנו מהמתרחש העורקים neonatal גזור על ידי אנזים עיכול, היו בתרבית. התאים היו passaged, מעבר 3 תאים היו מוכתמים לסמני SMC (קרי, SMA, שריר חלק צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (SMMHC) או transgelin (ידוע גם בשם SM22α)), CD31, גרעינים (דאפי) (איור 3). רוב התאים בתרבית אקספרס SMC סמני אבל לא CD31.
כדי להעריך עיכוב תרופתי של אינטגרין β3 יכול להחליש hypermuscularization, היצרות של ה Eln(- / -.) אב העורקים ויוו, אנחנו ללא הרף חדורים cilengitide מעכב את בגלל זמן מחצית החיים הקצר שלה בפלסמה. Eln(+ −) זכרים ונקבות היו הזדווגו, ו, כפי שמתואר בשלב 4, osmotic מיני-משאבות עמוסה cilengitide היו מושתלים סכרים בהריון-E13.5. ב P0.5, הגורים היו לאללה, genotyped, נותחו aortas שלהם. טיפול Cilengitide נחלש באופן משמעותי באבי העורקים, hypermuscularization בעכברים Eln(- / -.) (איור 4) מבלי לשנות את אבי העורקים wildtype9. לפיכך, β3 אנטי-אינטגרין היא גישה לא פולשנית פוטנציאל מבטיח לטפל אלסטין aortopathy.
איור 1 . עודף SMCs באבי העורקים Eln(- / -.) נובעות SMCs קיימים מספר. סכרים בהריון עם עוברי Eln(- / -.), Acta2-CreERT2 גם נושא הכתב Cre ססגוניות ROSA26R(Rb / +) היו המושרה עם זריקה אחת בקרום הבטן של טמוקסיפן (1.5 מ ג)-E12.5. סכרים, הוקרבו ב E18.5, קטעי רוחבי יורד aortas של העוברים נותחו, עם כתמים דאפי, של קרינה פלואורסצנטית ישירה של צבעים Rb, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) ו מורנג (מור). SMCs עודף מצטבר בהיבט הפנימי של Eln-null העורקים לאחר E15.518. SMCs הפנימית-שכבה עודף כוללים תאים של צבעים מרובים (כוכביות), המציינת את polyclonality. Lu, אבי העורקים לומן. סולם בר, 10 מיקרומטר. Reprinted מ Misra. et al., 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Anti-αvβ3 אינטגרין המצור נחלש Hypermuscularization, היצרות של Explant אבי העורקים Eln(- / -.) . E15.5, סכרים בהריון היו מורדמים, aortas של העוברים Eln(- / -.) נבצרו. Aortas מבודד קבוע באופן מיידי או תרבותי בנוכחות פקד isotype IgG1 או אינטגרין αvβ3 חסימה נוגדן עבור 18 h לפני קיבוע. Aortas קבוע היו מוכתמים CD31, SMA של גרעינים (דאפי). Lu, אבי העורקים לומן. סולם בר, 100 מיקרומטר. Reprinted מ Misra. et al., 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . מבודדים ותרבותית SMCs אבי העורקים של סמנים שריר חלק מפורשת Neonatal עכברים. SMCs הם בודדו אותנו מהמתרחש P0.5 הגורים, היו בתרבית. תאים מן המעבר השלישי היו קבועים, מוכתם CD31 (EC מרקר), גרעינים (דאפי), סמן SMC (SMA, SM22α, או SMMHC, כפי שמצוין). ניתוח זה מציין כי ~ 90% של תאים בתרבית אקספרס SMC סמנים, לא נצפו לבטא CD31. סולם בר, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . תקינות של Cilengitide In Vivo נחלש Eln(- / -.) Hypermuscularization של אבי העורקים, היצרות. זכריים ונקביים Eln(+ /-) עכברים היו שלובות. אינטגרין β3 מעכב cilengitide או רכב (PBS) היה חדורים באופן רציף ב סכרים בהריון באמצעות osmotic מיני-משאבות החל מ- E13.5. סעיפים רוחבי ב P0.5 היו מוכתמים SMA (אדום), CD31 (לבן), גרעינים (דאפי, כחול). Lu, אבי העורקים לומן. סולם בר, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בניגוד חקירה מקיפה של העורקים מאתר ואת סניפיה הגדולים במצבים פתולוגיים למבוגרים, כגון מודלים של טרשת עורקים, פחות ידוע לגבי את מורפוגנזה בפתוגנזה של העורקים של הלידה. כאן, אנו מתמקדים העורקים עובריים/הלידה, במיוחד SMCs, ולספק פרוטוקולים ללמוד העורקים באמצעות ויוו, רקמת explant, ואת הגישות SMC בידוד. גישות אלה ללא תשלום לספק החוקר עם גישות מגוונות ללמוד העורקים עובריים/הלידה.
ניתוח המשובטים היא גישה רב עוצמה המאפשר אחד כדי לחקור את אופן הפעולה של תאים בודדים. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כדי לסייע בזיהוי SMCs מתמחה ב להערכת בריאות10. חיוני להכיר, עכבר בודדות נושא כתב Cre צבע רב, יש סיכוי כי תאים בצבע זהה אפשר להפיק מן האירוע רקומבינציה אחד או יותר. לפיכך, ניתוח המשובטים עם כתבת צבע רב מחייבת את ההערכה של עכברים רבים. כי טמוקסיפן בתקופת אמצע-מאוחר הריונית עלולות להפריע parturition, לניסויים לסמן תאים בתקופת אמצע-בסוף ההיריון, לאתר אותם נוצרו אחרי הלידה, פרוגסטרון וטמוקסיפן צריך להיות מוזרק/ת. בדומה הפרוטוקולים העובר, גורל מיפוי וניתוח המשובטים של תאים בוגרים העכבר ניתן לבצעם עם הזרקה בקרום הבטן של טמוקסיפן אצל אדם בוגר.
מיפוי ניתוח והגורל המשובטים של SMCs משתמש עכברים נושאת transgenes עם הביטוי של Cre recombinase תחת השליטה של היזמים עם פעילות משופרת שריר חלק. כאן, אנו מתארים בפרוטוקולים שימוש בעכברים נושאת מותנה transgenes Myh11-CreERT2 או Acta2-CreERT2. Myh11 הוא סמן הספציפי ביותר של SMCs19; עם זאת, זה downregulated ב Eln(- / -.) אב העורקים9. Acta2 מתבטאת SMCs, כולל אלה של Eln-העורקים null, אבל זה אינו מדויק כי זה מתבטאת גם סוגי תאים אחרים. היו אלה transgenes מותנה "דולף" (קרי, זירוז רקומבינציה בהיעדרו של טמוקסיפן), זה עלול להיות בעייתי, כמו הניסויים לא ניסחו את התזמון של סימון התא. Leakiness של אלה transgenes נותחה על ידי הערכת פעילות ביתא-galactosidase בעכברים נושא של lacZ Cre כתב, או Myh11-CreERT2 או מבוסס Acta2-CreERT2 אחרי הטיפול הרכב ( כלומר, בהיעדרו של טמוקסיפן אינדוקציה)11,12. בהתבסס על ניתוח זה, transgenes אלה נחשבו לא דולפים.
Hypermuscularization מאפיינת מספר פתולוגיות כלי הדם אצל בני אדם. למשל, היצרות של העורקים supravalvular (SVAS) היא מחלה מולדת הרסנית המאופיינת החסימה של עורקים גדולים ובינוניים עקב עודף תוצאות SMCs. SVAS ההפסד של הפונקציה של אלל אחד של הגן ELN מתרחשת ישות מבודדת, או, יותר נפוץ, כחלק וויליאמס-Beuren תסמונת20,21,22,23,24. Phenocopy עכברים מוטנטים Eln(- / -.) היבטים רבים פנוטיפ אבי העורקים של SVAS18,21,22. Explants של אבי העורקים מעוברים Eln(- / -.) במהירות להפוך occluded במהלך תרבות, בעוד explants מעוברים wildtype נשארים פטנטים9,18. הגישה של אבי העורקים explant מקלה על הקרנה של סוכנים להחליש היצרות אלסטין aortopathy9. עם זאת, גישה זו לא לקחת בחשבון את הכוחות מכני או פיזית זה כפוף העורקים בזמן בגוף. לפיכך, וצריך להעריך כניסות חיוביות explant אבי העורקים סינון עם מודלים בעכבר מוטנט Eln ויוו .
פרוטוקול בידוד SMC הוא שיטה מהיר וחזק כדי להשיג SMCs של העורקים מאתר הלידה. בגישה דומה יכול להיות אומדן לבודד SMCs של עכברים בוגרים. בגלל הגודל שלה גדול יחסית, העורקים למבוגרים ניתן לפתוח longitudinally, adventitia ותאי אנדותל גזור משם. כדי להעריך את הטוהר של התאים מבודד מן העורקים הלידה או למבוגרים, חשוב לבדוק הביטוי של סמנים SMC (למשל, SMMHC, smoothelin, SM22α ו- SMA) וחוסר ביטוי של תאי אנדותל סמנים (למשל, CD31, קדהרין אנדותל כלי הדם). אפשרות גישה בידוד חלופית היא להשתמש cytometry זרימה כדי לבודד fluorescently תוויות SMCs של העורקים גזור. עכברים נושאת על הכתב Cre פלורסנט, Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2או Tgln-Cre ניתן לתייג fluorescently SMCs11,12,25, 26,27. לחלופין, קיימת העכברים הטרנסגניים עם האמרגן SMA נהיגה הביטוי fluorophore (קרי, ה-GFP, mCherry או RFP) יכול להיות בשימוש28,29,30.
מושתל osmotic מיני-משאבות משמשים כדי לספק משלוח רציפה של סוכנים תרופתי חיות מעבדה. אנחנו השתיל מיני-משאבות בעכברים בהריון-E13.5 למסור סוכנים בפיתוח עוברי בשאר תקופת הריון9. כדי להגיע את העוברים, סוכנים כזה חייב להיות מסוגל לעבור את מחסום הדם-היפרדות. באופן כללי, מיני-משאבות מתקבלים טוב מאוד, בהתחשב שיעור נמוך של זיהום, אנטיביוטיקה שגרתית אינם מומלצים. הפצע התבקעות נדיר; אולם, אם מזוהה של התבקעות גדול מ- 4 מ מ, העכבר צריך להיות anesthetized מחדש, הפצע נסגר שוב בתפר כירורגי וניקה.
עבודה זו מתארת של armamentarium של גישות שניתן ללמוד היווצרות נורמלי של הקיר אבי העורקים של הלידה במהלך הפיתוח, כמו גם לאחר לפליטת בתהליך זה במהלך המחלה. בנוסף, ניתן להחיל פרוטוקולים אלה כדי ללמוד על תחזוקה, מחלה של העורקים למבוגרים. יכול להיות אומדן גישות אחרות כלי הדם, וכן מצופים שריר חלק מבני-וסקולרית, כגון של מערכת העיכול או את דרכי הנשימה של הריאות. לבסוף, טכניקות דומות ניתן ללמוד סוגי תאים מעבר SMCs, כגון תאי אנדותל או fibroblasts, כמו גם יחסי הגומלין בין סוגי תאים אלה SMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים דין Li על שיתוף הפרוטוקול של המעבדה שלו לבידוד SMC אבי העורקים. תמיכה במימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R21NS088854, R01HL125815, R01HL133016 אל D.M.G), איגוד הלב האמריקני (מענק הסיוע 14GRNT19990019 כדי D.M.G.), ואת אוניברסיטת ייל (מלגת בראון-Coxe כדי לפנות בוקר וההרצה כספים D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R.
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
