Summary
배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.
Abstract
대동맥은 신체에서 가장 큰 동맥 이다. 대동맥 벽 내 피 세포의 내부 계층, 탄성 lamellae 그리고 부드러운 근육 세포 (SMCs)의 중간 층 및 외부 층의 섬유 아 세포와 세포 외 매트릭스의 구성 됩니다. 성인 대동맥에 병 적인 모델 (예: 동맥 경화 증)의 광범위 한 연구와 달리 훨씬 덜 배아 및 perinatal 대동맥에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리가 초점을 SMCs는 morphogenesis의 분석 및 배아와 perinatal 대동맥 SMCs 정상적인 개발 및 질병의 병 인에 대 한 프로토콜을 제공. 특히, 포함 하는 4 개의 프로토콜은: 나) 배아 운명 매핑 vivo에서 및 클론 분석; ii) explant 배아 대동맥 문화; iii) SMC 별개로 perinatal 대동맥; 그리고 iv) 임신 (비 임신) 쥐에 피하 삼 투 미니 펌프 배치. 따라서, 이러한 접근 origin(s), 운명, 그리고 대동맥 vivo에서 SMCs의 클론 아키텍처의 조사를 촉진 한다. 약리학 대리인에 지속적인 노출에 의해 배아 대동맥 morphogenesis에서 utero에서 변조에 대 한 수 있습니다. 또한, 고립 된 대동맥 조직 explants 또는 대동맥 SMCs muscularization, 확산, 마이그레이션 등 기본적인 프로세스 동안 특정 유전자 목표의 역할에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 될 수 있습니다. 격리 된 SMCs explanted 대동맥에 이러한 가설 생성 실험 다음 약리 및 유전 접근을 통해 생체 내에 컨텍스트에서 평가 수 있습니다.
Introduction
세포에 영양분과 산소를 제공 하는 다세포 생물 기능의 순환 시스템에 있으며 하지 외부 환경 접촉이 세포에서 폐기물 및 이산화탄소 제거 하. 척추 동물, 심장, 혈관의 시리즈를 통해 혈액을 펌프 기본 순환 시스템에 의하여 이루어져 있다. 동맥과 정 맥, 같은 큰 혈관의 벽 3 계층 구성: 나) intima, 또는 내부 층의 내 피 세포; 2) 미디어, 또는 원주 교류의 중간 층 길쭉한 SMCs 부드러운 근육 세포 및 탄성 lamellae; 그리고 iii) adventitia, 또는 결합 조직과 섬유 아 세포의 바깥 레이어. 혈관 생물학에서 연구의 대부분 신생 통해 새로운 내 피 세포 늘어선 관의 형성을 조사 하 고, 내 피 세포에 초점. 비교에서는, SMCs 상대적으로 작은 관심을 받을. 그러나, SMCs는 정상적인 동맥 벽의 건축에서 및 혈관 병 리에 중요 한 세포 유형입니다.
대동맥에서 심장의 좌 심 실 심장 출력을 받는 본문에 큰 구경 동맥입니다. 그것은 아 테 롬, 동맥, 및 해 부를 포함 하 여 다양 한 인간 질병에 의해 시달리 다. 성인 유기 체, 대동맥 및 그 주요 분 지는 심각 하 게 공부 하지 혈관 질환의 모델. 예를 들어, 인코딩 apolipoprotein E, 또는 저밀도 지 단백질 수용 체 유전자에 대 한 null이 쥐를 먹이 하는 고 지방 규정식 아 테 롬, 개발 하 고 최근 운명 매핑 연구 나타냅니다 기존의 SMCs에 여러 세포 유형을 일으키는 동맥 경 화성 플 라크1. 대동맥 동맥 류, 병 적인 변경 SMC apoptosis와 세포 외 매트릭스2,3개조를 포함.
실질적으로 더 적은 배아 및 perinatal 기간 동안 SMC morphogenesis 및 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리는 배아 및 perinatal 대동맥 SMCs에 vivo에서, 고립 된 세포와 조직 explants에서 공부에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 프로토콜의 첫 번째 섹션 구분 운명 매핑 및 미 발달 쥐에 클론 분석. 특정 셀의 표시 및 그들의 자손4,,56; Cre recombinase 셀 전용 모터의 제어 아래 표현 용이 그러나, 휴대 전용 라벨의 일시적인 제어에 쥐에 배아 개발 하는 동안 전하실 수 있습니다. 이러한 맥락에서 SMCs (e.g.,Myh11 또는 Acta2)와 Cre 기자 활성 발기인에서 조건부 있다 표현 하는 배아 우리 tamoxifen 또는 그 활성 대사 산물 4-오-tamoxifen 임신 댐에서 주입 방법 제공 태아 나 산 후 자손에 레이블이 지정 된 셀을 분석을 위한. 또한, 운명 매핑 연구, 어느 주로 단일 기자 fluorophore1,7Cre 기자 활용, 달리 클론 분석은 실질적으로 향상 된 멀티 컬러 Cre 기자.
프로토콜의 두 번째 및 세 번째 섹션 분리 하 고 배양 배아 대동맥 explants 및 신생아에서 대동맥 SMCs 각각에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 접근 허용 신호 경로, 특히 대동맥 explants 또는, SMCs의 조작에 대 한 분석을 위한 약리학 대리인의 직접 효과. 따라서, 관심의 조직에 있는 특정 한 유전자의 역할 쥐에서 전통적인 유전자 조작을 통해 보다 훨씬 더 빠른 방식에서 상영 될 수 있습니다. 또한, 고립 된 SMC 연구 세포 이동의 분석을 촉진 하 고 기술적으로 접착 제한 에 비보.
마지막으로, 네 번째 프로토콜 섹션 구분 (또는 비 임신) 임신한 쥐에 약리 에이전트와 함께 로드 피하 삼 투 미니 펌프의 배치. 이 방법은 빠른 대사 때문에 지속적인 주입을 요구 하는 에이전트에 의해 발생 하는 배아 발달에 미치는 영향의 분석을 촉진 한다. 잦은 주사의 대안 많은 에이전트에 대 한 실용적 이며 피해 야 한다, 그것은 임신 댐에서 상당한 불편을 발생할 수 있습니다.
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Protocol
모든 마우스 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 예일 대학에 의해 승인 됩니다.
1. Vivo에서 배아 운명 매핑 및 클론 분석
참고: 우리는 이러한 접근 널리 평가 하 사용 셀과 그들의 클론 아키텍처 개발 및 질병 모델에서의 유래 7 , 8 , 9 , 10.
- 는 크리스챤와 쥐와 쥐 Cre 기자와 사이 짝짓기 설정.
참고:는 있다 SMC 표시; 사용 됩니다. Myh11-CreERT2 또는 Acta2 CreERT2 마우스 11 , 12 주로이 목적을 위해 사용 됩니다. 우리는 광범위 하 게 배아 조직 표시 ROSA26R CreERT2 마우스 13를 이용 했다.- 클론 분석에 대 한 멀티 컬러 Cre 기자 (예를 들어, 색종이 또는 무지개 [Rb] 쥐) 8 , , 14 15를 사용 하 여 운명 매핑의 사용 하는 단색 Cre 기자 (예를 들어, ROSA26R-YFP 마우스 16) 또는 두 배 색깔 Cre 기자 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
참고:이 번 식 체계를 사용 하 여 성인 쥐를 2-6 개월 (일반적으로 30 ~ g)는 크리스챤과 Cre 기자 배아를 생성 합니다.
- 클론 분석에 대 한 멀티 컬러 Cre 기자 (예를 들어, 색종이 또는 무지개 [Rb] 쥐) 8 , , 14 15를 사용 하 여 운명 매핑의 사용 하는 단색 Cre 기자 (예를 들어, ROSA26R-YFP 마우스 16) 또는 두 배 색깔 Cre 기자 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- 금속을 사용 하 여 아침에 질 플러그 프로브 및 배아 일 (E) 0.5로 플러그 감지 당일 정오 고려 검사.
- 플러그 감지 되 면 남성에서 여성을 분리.
- 준비 4-오-tamoxifen 고 tamoxifen 작업 솔루션.
- 4-오-타 목 시 펜에 대 한 100% 에탄올, 소용돌이 2 분의 50 µ L에 5 mg을 녹이 고 옥수수 기름의 450 µ L를 추가 합니다. 얼음, 샘플 냉각 될 때까지 주기 사이 휴식 10 s 사이클에 대 한 출력 레벨 2에서 sonicate. 샘플은 완전히 용 해 후 (보통 ~ 쥡니다의 4-5 주기), sonicated 솔루션의 200 µ L 고 1800 µ L의 최종 작업 솔루션 (4-오-tamoxifen, 1 mg/mL) 옥수수 기름에 용 해.
- 그것 해산 때까지 tamoxifen에 대 한 100% 에탄올과 소용돌이에 50 mg/mL로 희석. 최종 작업 솔루션 (tamoxifen, 10 mg/mL)을 그것 완전히 용 해 되도록 45 ° C에서 저를 옥수수 기름에 희석.
- 초기 배아 유도 주입 4-오-tamoxifen intraperitoneally 임신 댐.
- 4-오-tamoxifen 주사 (임신 마우스, 또는 대략 5 mg/kg 체중 당 최대 ~ 150 µ g)를 사용 하 여 E5.5 및 이후 그들은 항복 가능한 댐, 배아, 그리고 새끼.
- 0.5-1.5 m g (또는 17-50 mg/kg) 댐에서 태아와 임신에 대 한 복용량에서 사용 tamoxifen ~ E9 이후. 30g 바늘을 사용 하 여 모든 주사.
참고: 0.22 μ m 필터를 통해 여과 주입 전에 모든 혼합물을 소독을 일반적으로 사용 된다.
- 클론 분석을 위한 사용 4-오-tamoxifen (예를 들어, 5 mg/kg) 또는 (예를 들어, 50 mg/kg) 여러 셀을 표시 하려면 tamoxifen의 고용량의 복 주사.
- 개별 셀, 같은 (즉, 대동맥)의 조직에서 거의 모든 배아 (아래와 같이이 섹션의 끝에) 분석 없음 표시 하는 셀 또는 셀만 4 오 타 목 시 펜 이나 tamoxifen 복용 아래로 적정 하 단일 색상; 이것은 임계값 복용량.
- 중앙 늦게 임신 기간에 셀을 표시 하 고 추적 그들의 운명 또는 출생 후 마우스에서 clonality를 주입 호르몬 임신 댐의 복 강에 수반 1:2 (황 체 호르몬: tamoxifen) tamoxifen을 복용량 비율.
참고: 타 목 시 펜 복용은 17-50 mg/kg 및 황 체 호르몬 투여는 8.5-25 mg/kg (즉, tamoxifen 복용량의 절반). 황 체 호르몬 주사는 1 ~ 2 일에 의해 노동 지연 될 수 있습니다. - Euthanize 댐 댐 솜 또는 거 즈를 포함 하는 소켓에 배치 됩니다 오픈 놓기 방법을 사용 하 여 원하는 나이의 태아와 임신 undiluted isoflurane와 젖 었. 흉 강 매를 유도 하 여, 중요 한 장기를 제거 하 여 또는 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 죽음을 확인 하십시오.
- 정화 70% 에탄올과 복 부. 가 위를 사용 하 여 자르면 복 부와 자 궁 밖으로 해 부. 자 궁에서 태아를 제거 하 고 신중 하 게 태 반 및 노른자위 sac 집게를 사용 하 여에서 배아를 분리.
- E15 이상 배아를 자 궁 경관 탈 구 또는 잘린 수술가 위 또는 날카로운 칼 날을 수행 하 여 안락사.
참고: 배아 E15 보다 빠르게 죽는 어머니의 안락사 또는 어머니에서 배아의 제거 다음. - 얼음 처럼 차가운 PBS에 배아를 놓고 있다 고 Cre 기자에 대 한 유전자 형을가 위를 사용 하 여 꼬리의 작은 조각을 잘라.
- PBS에 세 번 배아 2 h. 워시 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 배아를 수정 하 고 15 mL 튜브에, 그들은 싱크대까지 기다리고 이틀까지 걸릴 수 있습니다는 PBS에서 30% 자당에 태아를 품 어.
- 채우기 플라스틱 동결 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 최대 레벨의 2/3를 주조한 다. 형, 상 온 (RT) 거품을 최소화 하기 위해 10 분 동안 10 월 품에 완전히 빠져들에 각 배아를 세로로 배치.
- 조직 블록을 드라이 아이스, 70% 에탄올 목욕 동결에 똑바로 고정 하는 장소. -80에서 블록 저장 ° c.
- 는 Cryostat 온도-22 ° C를 설정 하 고 전체 대동맥, 10-20 µ m 두께 통해 가로 섹션을 생성 하는 블록을 잘라. -80에서 그들을 저장 하기 전에 30 분 동안 RT에서 슬라이드 건조 ° c.
- 녹여 fluorophores의 표백 피하기 위해 빛에서 보호 하는 RT에 슬라이드. 워시와 PBS Tween20 슬라이드 0.1%.
- 클론 분석, 핵 (DAPI, 5 mg/mL)에 대 한 슬라이드를 얼룩 및 직접 레인 보우 Cre 기자에 다른 fluorophores 이미지 (하늘색: 433-nm 여기 최대, 475 nm 방출 최대; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Fluorophores 직 립 형광 현미경으로 감지에 대 한 다음 필터 사용: DAPI (여기 맥스/대역폭 350/50 nm, 방출 최대/대역폭 460/50 nm), 리안 (여기 436/20 nm, 방출 480/40 nm), 텍사스 레드 (여기 560 / 40 nm, 방출 630/75 nm) 및 mOrange (여기 577/10 nm, 방출 630/50 nm)에서 mCherry를 별도의 사용자 지정 필터.
- MTmG Cre 기자와 운명 매핑, GFP를 감지 (484 nm, 510 nm), 직접 이미징 하거나 immunostaining를 사용 하 여. (여기 470/40 nm, 방출 525/50 nm) GFP 필터를 사용 하는 직 립 형광 현미경으로 이미징.
- Immunostaining에 대 한 섹션 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체를 품 어 0.1% 트라이 톤 X-100 PBS에 세척 하 고 다음 1 h. 안티 CD31 사용에 대 한 2 차 항 체로 품 어 (최종 농도 0.0016 mg/mL), 안티-GFP (0.006 mg/mL)와 Cy3-직접 활용된 안티-SMA (최종 희석 1: 500) 주 항 체 및 사용 보조 antibodie직접 fluorophores (최종 희석 1: 500) (테이블의 자료를 참조)를 활용 하는 s.
- 클론 분석, 핵 (DAPI, 5 mg/mL)에 대 한 슬라이드를 얼룩 및 직접 레인 보우 Cre 기자에 다른 fluorophores 이미지 (하늘색: 433-nm 여기 최대, 475 nm 방출 최대; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- 직 립 형광 현미경으로 슬라이드 이미지 (확대: X-20 X 4) 또는 confocal 현미경 (10 X-63 X). 높은 확대에 대 한 사용 하 여 오일 목표 x confocal 영상 63 1.4-0.6의 숫자 조리개와 1024 x 1024 픽셀의 프레임 크기.
2. 배아 대동맥 문화 explant
참고:이 접근은 이전 integrin beta3 explanted는의 협에서의 역할을 평가 하는 데 사용 됩니다 Eln (-/-) 배아 대동맥 9 , 18.
- 위의 단계 1.8에 의하여 초과 isoflurane 흡입에 의해 E15.5에 초과 임신 댐 안락사.
- 수확 및 위에 1.9-1.10, 단계에 따라 배아를 안락사.
- 태아 supinely 놓고 해 부 보드 확장된 사지를 고정 합니다. 해 부 stereoscope와 시각화 및 위 가슴에 흉 골을 통해 복 부 로부터 수직 절 개를 잘라가 위를 사용 하 여 있습니다. Thymus, 멀리 해 부 기관지, 폐, 식도, 간, 그리고 대 장.
- 부드럽게 ventrally 집게를 사용 하 여 심장 내과 흉부 및 복 부 구멍의 지 측면에서 대동맥 해 부를 위를 사용 하 여. 대동맥을 출시, 근 위 루트와 원심 복 부 위치에서 잘라.
- 셀 문화 후드에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS에 대동맥을 놓습니다. 24-잘 접시에 대동맥을 전송 하 고 0.5 %DMEM 문화 FBS 37에서 최대 24 h에 대 한 ° C.
참고: 문화 매체는 차단 항 체 (0.02 mg/mL 9 예를 들어, 안티 integrin αvβ3 항 체, 참조 테이블의 재료) 또는 약리 에이전트와 함께 보완 될 수 있습니다. - 대동맥 PBS로 두번 세척 하 고 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 수정
- 세척 3 회 PBS 및 대동맥 30 %1.5 mL 튜브에 PBS에 자당. 대동맥 싱크 후 만들고 냉동된 조직 블록, 컷된 섹션, immunostain, 위에 1.13-1.15, 단계에서 설명한 대로.
3. Perinatal 대동맥에서 SMC 격리
참고:이 방법은 현재 사용 되 고 Eln (-/-)와 wildtype perinatal 쥐에서 분리 대동맥 SMCs의 생물학 비교.
- 는 murine pup 출생 후 하루 (P)에 0.5, 자 궁 경관 탈 구 또는 수술가 위로 잘린 또는 1.10, 단계에서 설명한 대로 날카로운 칼 날 위에 Euthanize.
- 는 2.3 단계를 수행 하 고, 흉부와 복 부를 연 후 23 G 바늘 왼쪽된 심 실 펑크. PBS는 중력에 의해 좌 심 실으로 흐르고 그렇게 PBS 포함 된 무 균 주사기 바늘 연결을 사용 하 여 플라스틱 튜브 높은 위치에서 수직으로 개최. 간 blanches 때까지 좌 심 실에 살 균 PBS의 주입을 허용 합니다.
- 집게를 사용 하 여 대동맥의 외부에 adventitial 조직을 제거 하 여 2.4 단계에서 설명한 대로 대동맥 해 부.
- DMEM의 단일 솔루션에 대동맥을 소화 (500 µ L) 보충 225 U/mL 콜라, 2.25 U/mL elastase, 및 1 x 37 ° C. 수동으로 쉐이크에서 45 분에 대 한 항생제 antimycotic 튜브 5-10 분 마다
- 멸 균 셀 문화 후드, titurate 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 200 µ L 피 펫으로 아래로 pipetting으로 소화 조직. 단일 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 전송 DMEM의 2 개 mL를 추가 하 고 25에서 5 분 동안 920 x g에서 원심 ° c.
- 폐기는 상쾌한. SMC 문화 매체 (DMEM 10% FBS 1 µ g/mL rhFGF, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL 페니실린/스와 2.5 µ g/mL 암포 B 보완 포함) 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 35 m m 문화 접시에 전송.
참고: 초기 격리 시 ~ 400000 셀에서에서 얻을 수 있습니다 단일 P0.5 wildtype 대동맥; ~ 이러한 세포의 300000은 SMCs. - 37 ° C에서 세포를 배양 하 고 신선한 SMC 문화 매체 3 일 마다 변경 합니다. 트립 신으로 표준 기술을 사용 하 여, 셀 때 confluent 통로. 실험, 구절 3-7에서에서 셀 사용.
4. 피하 임신 (또는 비 임신)에 삼 투 미니 펌프 배치 마우스
참고:이 접근은 이전 약리 에이전트 (예: integrin β3 및 β5 억제제를 지속적으로 제공 하는 데 사용 됩니다 cilengitide) 배아 utero에서 9. 펌프 E13.5에서 임신 댐에 삽입 하 고 출산 때까지 유지 되었다.
- Anesthetize 유도 및 유지 보수에 대 한 1-3% 산소 (1 L/min의 유량)에 2-5 %isoflurane 쥐. 발가락-핀치 반사를 사용 하 여 마 취의 수준을 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 에이전트를 조정 합니다. 무 통을 위한 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg) 관리.
- 는 클리퍼 스와 함께 허리를 면도. 무 균 커튼, 장갑, 그리고 악기를 사용 하 고 수술 하는 동안 난방 외과 접시에 쥐 유지.
- 경향이 위치에 각 마우스를 배치 하 고 뒷면 betadine 이소프로필 알콜 다음 스크럽. Rostral 허리에서 꼬리의 기초에 대략 3-5 cm 가로 피부 절 개를 0.5-1.0 c m 기본 근육 부상 없이 길이 메스를 사용 하 여.
- Hemostat 턱을 개폐 하 여 펌프 주입에 대 한 rostrally 피하 주머니 만들고 절 개 한 hemostat 삽입.
- 채우기 선택, 제조자에 의하여의 에이전트와 함께 삼 투 미니 펌프 ' s 지침 (재료의 표 참조). 주머니에 가득된 펌프를 삽입 하 고 클립 또는 6-0 비 흡수 봉합 절 개를 닫습니다. 총 수술 시간은 10 분 미만 인지 확인
- 는 post-operatively, 그들 sternal recumbency에서 복구 될 때까지 15 분 마다 마우스를 모니터링 합니다. 48 h에 대 한 모든 6-12 h 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)를 관리 합니다. 쥐 완전히 전신 마 취에서 회복 때 그들을 매일 모니터링 합니다. 클립을 제거 하거나 봉합 수술 후 7-10 일.
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Representative Results
대표 클론 분석에서 SMCs의 Eln (세포 외 기질 단백질 엘라 스 틴을 인코딩 하는 유전자)에 돌연변이 체 배아에에서, Eln(+), Acta2-크리스챤T2 쥐 Eln(+) 쥐도 들고 성관계 했다는 멀티 컬러 ROSA26R(Rb/Rb) 기자. 1 단계에서 설명한 대로 플러그 했다 확인 하 고 임신 댐 했다 E12.5에 단일 tamoxifen 주입 (1.5 mg)으로 유도 한 그들은 E18.5에 희생 했다. 배아는 수확, 고정, 고정 및 genotyped 했다. 하강 대동맥 cryosections 가로 절단 했다. Eln(+), Acta2-있다T2에서 섹션 ROSA26R(Rb / +) 배아 나타냅니다 초과 내부 레이어 SMCs는 Eln에 축적-null 쥐 (E15.5 후 시작 하는) 여러 색상 (에 의해 표시 된다 그림 1) 따라서 셀에 존재 하는 여러 개의 알파-부드러운 근육 걸 (SMA)+ 에서 파생 하는 고 ~ E12.5. E12.5 대동맥에서 SMA+ 셀 tunica 매체에 제한 됩니다.
Eln(-/-) 배아 aortas explants, 남성과 여성에 대 한 생성 하 Eln(+) 마우스 성관계 했다. 플러그 했다 확인 하 고 임신 Eln(+) 댐 2 단계에 설명 된 방법을 사용 하 여, E15.5에 희생 했다. Aortas는 Eln(-/-) 배아 로부터 격리 되었고 0 또는 항 체 또는 IgG1 컨트롤 차단 안티 integrin β3 존재 18 h에 대 한 교양. Aortas 다음, 고정 했다와 cryosectioned, 그리고 cryosections은 SMA (SMC 표식)에 대 한 스테인드 CD31 (내 피 성장 세포 마커), 그리고 핵 (DAPI) (그림 2). 결과 경작의 18 h 안에 E15.5/Eln(-/-) 대동맥 된다 hypermuscular 입증 및 stenotic. 이 과정은 안티 integrin β3 차단 항 체에 의해 감쇠 됩니다.
SMCs는 P0.5에서 wildtype 쥐의 대동맥에서 분리 했다. 3 단계에서 설명한 대로 SMCs 효소 소화에 의해 해 부 신생아 대동맥 으로부터 격리 되었고 경작 했다. 셀 했다 passaged 그리고 CD31, 그리고 핵 (DAPI) (그림 3) 통로 3 셀 (즉, SMA, 평활 근 myosin 무거운 체인 (SMMHC), 또는 transgelin (SM22α 라고도 함)), SMC 표식에 대 한 스테인드 했다. 경작된 한 세포의 대부분 SMC 마커만 하지 CD31 익스프레스.
평가 하기 위해 hypermuscularization 및 Eln(-/-) 대동맥에 vivo에서, 우리는 지속적으로 협 integrin β3의 약리 저해 수 감소 여부 생긴 억제제 cilengitide 그것의 짧은 반감기 때문에 플라즈마. Eln(+ / −) 남성 및 여성 성관계 했다, 그리고, 4 단계에서 설명한 대로 삼 투 미니 펌프 cilengitide 로드 E13.5에서 임신 댐에서 이식 했다. P0.5에 강아지 했다 안락사와 genotyped, 그리고 그들의 aortas 분석 했다. Cilengitide 치료는 크게 wildtype 대동맥9를 변경 하지 않고 대동맥 협 착 증 및 Eln(-/-) 마우스 (그림 4)에 hypermuscularization 약화. 따라서, 안티 integrin β3 엘라 스 틴 aortopathy를 치료 하는 잠재적으로 유망한 비 침 투 적인 접근 이다.
그림 1 . 여러 기존 SMCs에서 파생 하는 Eln(-/-) 대동맥에서 초과 SMCs. 또한 다 색 Cre 기자를 들고 하는 Eln(-/-), Acta2-크리스챤T2 배아 임신 댐 ROSA26R(Rb / +) E12.5에 tamoxifen (1.5 m g)의 단일 복 주사로 유도 했다. 댐에서 E18.5, 희생 했다 그리고 DAPI 및 Rb 색상의 직접 형광 얼룩과 태아의 하강 aortas의 가로 섹션 분석 했다 리안 (Cer), mCherry (mCh), 및 mOrange (mOr). 초과 SMCs Eln의 내부 측면에 축적-E15.518후 null 대동맥. 초과 안 층 SMCs polyclonality을 나타내는 여러 색상 (별표)의 셀에 포함 됩니다. 루, 대동맥 루멘입니다. 스케일 바, 10 µ m. Reprinted Misra 외., 20169에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 안티 αvβ3 Integrin 봉쇄 약하게 Hypermuscularization 및 Eln(-/-) 대동맥 Explant의 협. E15.5, 임신 댐 했다 안락사 그리고 Eln(-/-) 배아의 aortas 수확 했다. 격리 된 aortas 중 즉시 고정 또는 isotype 제어 IgG1 또는 고정 이전 18 h integrin αvβ3 차단 항 체의 존재 양식. 고정된 aortas CD31, SMA, 및 핵 (DAPI) 얼룩이 있었다. 루, 대동맥 루멘입니다. 스케일 바, 100 µ m. Reprinted Misra 외., 20169에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 절연 및 신생아 쥐 익스프레스 부드러운 근육 표식에서 대동맥 SMCs 교양. SMCs는 P0.5 새끼에서 고립 됐다 고 경작 했다. 세 번째 통로에서 셀 고정 되었고 CD31 위한 스테인드 (EC 표식), 핵 (DAPI), 그리고 SMC 마커 (SMA, SM22α, 또는 SMMHC, 표시 된 대로). 이 분석 ~ 90%는 경작된 한 세포의 익스프레스 SMC 마커, 아무도 CD31 표현 하 관찰 했다 나타냅니다. 눈금 막대, 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Vivo에서 Cilengitide의 지속적인 주입 약하게 Eln(-/-) 대동맥 Hypermuscularization와 협. 남성과 여성의 Eln(+) 마우스 교차 했다. Integrin β3 억제제 cilengitide 또는 차량 (PBS)는 E13.5에서 시작 삼 투 미니 펌프를 사용 하 여 임신 댐에서 지속적으로 주입 됩니다. 가로 섹션 P0.5에서 SMA (빨간색), CD31 (흰색), 그리고 핵 (DAPI, 블루)에 대 한 스테인드 했다. 루, 대동맥 루멘입니다. 스케일 바, 100 µ m입니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Murine 대동맥과 동맥 경화 증의 모델 등의 성인 병 적인 조건에 그것의 주요 분 지의 광범위 한 조사와 달리 덜는 morphogenesis와 배아와 perinatal 대동맥의 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리 배아 perinatal 대동맥, 특히 SMCs에 집중 하 고 제공 하는 프로토콜을 vivo에서, 조직 explant 통해 대동맥 공부와 SMC 격리 접근. 이러한 무료 방법 제공 배아 perinatal 대동맥 공부를 다양 한 방법으로 조사 합니다.
클론 분석은 개별 셀의 동작을 조사할 수 있도록 하는 매우 강력한 방법입니다. 최근 폐 맥 관 구조10전문된 SMCs를 식별 하는 데이 방법을 사용 했습니다. 그것은, 멀티 컬러 Cre 기자를 들고는 개별 마우스에는 같은 색의 세포 수 이상의 재조합 이벤트에서 파생 되는 기회를 인식 하는 중요 한. 따라서, 멀티 컬러 기자와 클론 분석 수많은 쥐의 평가 필요로합니다. 중앙 늦게 임신 기간에 tamoxifen 중앙 늦게 임신 기간에 셀을 표시 하 고 postnatally, 그들을 추적 하는 실험에 대 한 출산 방해할 수 있기 때문에 호르몬과 타 목 시 펜 한다 주입 수반. 마찬가지로 태아에 프로토콜, 운명 매핑 및 성인 마우스에 세포의 클론 분석 성인에 tamoxifen의 복 주입으로 맡아 될 수 있다.
SMCs의 클론 분석 및 운명 매핑 평활 근에서 향상 된 활동 transgenes Cre recombinase 발기인의 통제의 식이 들고 마우스를 사용 합니다. 여기, 우리는 조건부 transgenes Myh11 있다T2 또는 T2Acta2 크리스챤을 운반 하는 마우스를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. Myh11은 SMCs19;의 가장 구체적인 마커 그러나, 그것은 Eln(-/-) 대동맥9downregulated입니다. Acta2은 SMCs, Eln의 그들을 포함 하 여 표시 됩니다-그것은 또한 다른 세포 유형 표현 때문에 null 대동맥, 하지만 그것으로 특정 하지 않습니다. 만약 이러한 조건부 transgenes 했다 "새" (즉, tamoxifen의 부재에서 재결합을 유발), 실험 하지 셀 표시의 타이밍을 나타내는 것으로 문제가 될 수 있습니다. 이러한 transgenes 시키는 쥐 들고는 lacZ 기반 Cre 기자와 Myh11 있다T2 또는 Acta2 있다T2 차량 처리 ( 다음 베타-galactosidase 활동을 평가 하 여 분석 즉,, tamoxifen 유도의 부재에)11,12. 이 분석을 바탕으로, 이러한 transgenes 새 하지 여겨졌다입니다.
Hypermuscularization는 인 간에 있는 여러 혈관 병 리 특징. 예를 들어, supravalvular 대동맥 협 착 증 (SVAS)는 ELN 유전자의 1 개의 대립 유전자의 기능의 손실에서 초과 SMCs SVAS 결과로 인해 대형 및 중소 동맥의 방해에 의해 특징은 치명적인 선 천 적 조건 윌리엄스-보 이렌 증후군20,,2122,23,24의 일환으로 고립 된 엔터티 또는, 더 일반적으로, 발생 합니다. Eln(-/-) 돌연변이 마우스 phenocopy SVAS18,,2122의 대동맥 표현 형의 여러 측면. Eln(-/-) 배아에서 대동맥 explants 빠르게 explants wildtype 배아에서 특허9,18유지 하는 반면 문화, 동안 차단 될. 대동맥 explant 접근 용이 협 엘라 스 틴 aortopathy9에서 감소 하는 에이전트에 대 한 심사. 그러나,이 방법은 받지 않는다 계정에 있는 대동맥에 따라 본문에 기계적 또는 물리적 힘. 따라서, vivo에서 Eln 돌연변이 마우스 모델 대동맥 explant 심사에 긍정적인 안타를 평가 한다.
SMC 격리 프로토콜 perinatal murine 대동맥에서 SMCs를 신속 하 고 강력한 방법입니다. 유사한 접근은 성인 쥐에서 SMCs를 분리 하 추정 수 있습니다. 그것의 비교적 큰 크기 때문에 성인 대동맥 경도 열 수 고 adventitia 및 내 피 세포 멀리 해 부. 주 나 성인 대동맥에서 고립 된 세포의 순도 평가 하려면 그것은 SMC 마커 (예를 들어, SMMHC, smoothelin, SM22α, 및 SMA)의 표현 (예를 들어, 내 피 세포 마커 식의 부족에 대 한 확인 하는 것이 중요 CD31 고 혈관 내 피 cadherin)입니다. 대체 절연 방식은 cytometry 붙일 격리를 사용 하는 잠재력에서 해 부 대동맥 SMCs를 표시. 마우스는 형광 Cre 기자와 Myh11 있다T2, Acta2 있다T2또는 Tgln-Cre 붙일 SMCs11,,1225, 라벨을 사용할 수 있습니다. 26,27. 또는, 운전 (즉, GFP, mCherry, 또는 RFP) fluorophore의 식을 SMA 모터와 기존 유전자 변형 마우스 사용된28,,2930일 수 있다.
이식된 삼 투 미니 펌프는 실험실 동물 약리학 대리인의 지속적인 납품을 제공 하는 데 사용 됩니다. 우리 미니 펌프 임신 기간9의 나머지 기간 동안 태아를 개발 하기 위해 에이전트를 제공 하는 E13.5에서 임신 쥐에 이식 했습니다. 배아에 도달, 이러한 에이전트 혈액 태 반 장벽을 통과 하 수 있어야 합니다. 일반적으로 미니 펌프는 매우 양호 하 고, 감염의 낮은 속도, 주어진 일상적인 항생제는 권장 하지 않습니다. 상처 dehiscence가입니다. 그러나, 4 mm 보다 큰 dehiscence 감지 되 면 마우스 다시 마 취 고 상처 청소 하 고 다시 외과 봉합 사 마감.
이 작품 개발 과정 뿐만 아니라 질병 동안이 과정에서 섭 후는 배아 perinatal 대동맥 벽의 정상적인 형성을 연구 하는 데 사용할 수 방식의 armamentarium에 설명 합니다. 또한, 이러한 프로토콜은 유지 보수 및 성인 대동맥의 질병 연구에 적용할 수 있습니다. 부드러운 근육 코팅 비 혈관 등의 구조, 위장 또는 폐 기도 뿐만 아니라 다른 혈관 접근을 추정 될 수 있습니다. 마지막으로, 유사한 기술은 이러한 세포 유형 및 SMCs 사이 상호 작용 뿐만 아니라 내 피 세포 또는 섬유 아 세포, SMCs, 넘어 세포 유형 공부에 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 딘 리 대동맥 SMC 격리에 대 한 그의 실험실의 프로토콜을 공유. 미국 심장 협회는 건강의 국가 학회 (R21NS088854, R01HL125815, 및 D.M.G R01HL133016)에 의해 제공 된 지원 자금 (D.M.G.에 특정 14GRNT19990019), 예일 대학 (브라운-기술혁신 화목 오전 및 시작 D.M.G.에 기금)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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