Summary
Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.
Abstract
A aorta é a maior artéria do corpo. A parede da aorta é composta por uma camada externa de fibroblastos e a matriz extracelular, uma camada média de alternância de lamelas elásticas e células musculares lisas (SMCs) e uma camada interna de células endoteliais. Em contraste com o estudo generalizado dos modelos patológicos (por exemplo, aterosclerose) na aorta adulto, muito menos é sabido sobre a aorta embrionária e perinatal. Aqui, focalizamos SMCs e fornecer protocolos para a análise da morfogênese e patogênese da SMCs aórtica embrionários e perinatais em desenvolvimento normal e a doença. Especificamente, os quatro protocolos incluídos são: eu) na vivo embrionário destino mapeamento e análise clonal; II) cultura de aorta embrionárias explante; III) isolamento de SMC da aorta perinatal; e iv) colocação de bomba mini osmótica subcutânea em ratos grávidas (ou não-grávidas). Assim, essas abordagens facilitam a investigação da origem, destino e arquitetura clonal de SMCs no aorta em vivo. Eles permitem modulação aorta embrionárias morfogênese no útero por exposição contínua a agentes farmacológicos. Além disso, tecidos aórtico isolado explants ou SMCs aórtica podem ser usadas para obter insights sobre o papel dos alvos do gene específico durante processos fundamentais, tais como muscularization, proliferação e migração. Estas experiências de geração de hipótese SMCs isolados e a aorta explantada então podem ser avaliadas no contexto na vivo através de abordagens farmacológicas e genéticas.
Introduction
Os sistemas circulatórios de função de organismos multicelulares para fornecer nutrientes e oxigênio para as células que são não em contato com o ambiente externo e para remover resíduos de produtos e de dióxido de carbono dessas células. Nos vertebrados, o sistema circulatório principal consiste no coração, que bombeia sangue através de uma série de vasos sanguíneos. As paredes dos vasos sanguíneos grandes, tais como as artérias e veias, consistem em três camadas: eu) a íntima, ou camada interna de células endoteliais; II) a mídia, ou camada média de alternância circunferencialmente alongadas células musculares lisas SMCs e lamelas elásticas; e iii) a adventícia, ou camada externa de tecido conjuntivo e fibroblastos. A grande maioria dos estudos em foco de biologia vascular em células endoteliais, investigando a formação de novos tubos de endoteliais célula-alinhado a angiogênese. Em comparação, a SMCs recebem relativamente pouca atenção. No entanto, SMCs são um tipo de célula fundamental na construção da parede arterial normal e em patologias vasculares.
A aorta é a artéria de maior calibre do corpo, recebendo o débito cardíaco do ventrículo esquerdo do coração. Ele está aflito por diversas doenças humanas, incluindo a arteriosclerose, aneurisma e dissecação. Em organismos adultos, a aorta e seus ramos principais são intensamente estudados modelos de doença vascular. Por exemplo, alta dieta gorda alimentou ratos que são nulos para o gene que codifica o receptor da lipoproteína de baixa densidade ou apolipoproteína E, desenvolver aterosclerose, e estudos de mapeamento de destino recentes indicam que SMCs pré-existentes dão origem a vários tipos de células no placa aterosclerótica1. Em aneurismas da aorta, as alterações patológicas incluem SMC apoptose e remodelação de2,3da matriz extracelular.
Substancialmente menos é conhecido sobre a morfogênese SMC e patogênese durante os períodos embrionários e perinatais. Aqui, nós fornecemos protocolos para o estudo embrionário e perinatal da aorta SMCs na vivo, em explantes de tecidos e de células isoladas. Por exemplo, a primeira seção do protocolo delineia destino mapeamento e análise clonal em camundongos embrionários. CRE recombinase expressado sob o controle de um promotor específico células facilita a marcação de células específicas e sua progênie4,5,6; no entanto, controle temporal de células específicas de rotulagem pode ser desafiador durante o desenvolvimento embrionário em camundongos. Neste contexto, com embriões expressando a CreER condicional sob um promotor ativo em SMCs (e.g.,Myh11 ou Acta2) e uma repórter de Cre, nós fornecemos métodos de injeção de tamoxifen ou seu metabólito ativo 4-OH-tamoxifeno em barragens de grávida e para analisar as pilhas etiquetadas em embriões ou prole pós-natal. Além disso, em contraste com os estudos de mapeamento de destino, que predominantemente utilizam Cre repórteres com um único repórter fluoróforo1,7, análise clonal é substancialmente reforçada com repórteres de multi cores Cre.
As segunda e terceiros seções do protocolo descrevem métodos para isolamento e cultivo embrionários explantes da aorta e da aorta SMCs de neonatos, respectivamente. Essas abordagens permitem a manipulação das vias de sinalização, especificamente em explantes aórtica ou SMCs e para analisar os efeitos diretos dos agentes farmacológicos. Assim, o papel de genes específicos no tecido de interesse pode ser projectado de forma muito mais rápida do que através de manipulações genéticas tradicionais em camundongos. Além disso, os estudos isolados de SMC facilitam a análise de migração celular e a adesão, que são tecnicamente limitado em vivo.
Finalmente, a quarta seção do protocolo delineia a colocação de uma bomba mini osmótica subcutânea carregada com agentes farmacológicos em camundongos grávidos (ou não-grávidas). Esse método facilita a análise dos efeitos sobre o desenvolvimento embrionário, causado por agentes que requerem infusão contínua por causa do metabolismo rápido. A alternativa de injeções frequentes não é prática para muitos agentes e deve ser evitada, como pode causar desconforto significativo na barragem grávida.
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Protocol
todos os protocolos do mouse são aprovados pelo Comité de uso na Universidade de Yale e institucional Cuidado Animal.
1. Clonal análise e mapeamento de destino embrionário In Vivo
Nota: nós usamos essas abordagens amplamente para avaliar as origens das células e sua arquitetura clonal em modelos de desenvolvimento e doença 7 , 8 , 9 , 10.
- Configurar acasalamento entre ratos com um CreER e ratos com um repórter Cre.
Nota: Um CreER é usado para SMC marcação; Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2 ratos 11 , 12 é comumente usado para essa finalidade. Usamos para marcação amplamente tecidos embrionários de ratos ROSA26R-CreERT2 13.- Para análise clonal, usar um multi cor Cre repórter (por exemplo, confetes ou ratos de arco-íris [Rb]) 8 , 14 , 15 e para o mapeamento de destino, use um repórter de Cre de cor única (por exemplo, ROSA26R-YFP ratos 16) ou o repórter de Cre duplo-cor ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Nota: Este regime de reprodução usa ratos adultos que são 2-6 meses de idade (geralmente ~ 30 g) e irão gerar embriões com um CreER e um repórter Cre.
- Para análise clonal, usar um multi cor Cre repórter (por exemplo, confetes ou ratos de arco-íris [Rb]) 8 , 14 , 15 e para o mapeamento de destino, use um repórter de Cre de cor única (por exemplo, ROSA26R-YFP ratos 16) ou o repórter de Cre duplo-cor ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Verifique se vaginal plugues de manhã usando um metal sondar e consideram o meio-dia no dia da detecção do plug como dia embrionário (E) 0.5.
- Separar a fêmea do macho, quando é detectado um plug.
- Prepare 4-OH-tamoxifeno e soluções de trabalho tamoxifeno.
- Para 4-OH-tamoxifeno, dissolver 5 mg em 50 µ l de etanol 100%, vórtice por 2 min e adicione 450 µ l de óleo de milho. No gelo, proceda à sonicação no nível de saída 2 durante 10 ciclos de s com descanso entre ciclos até amostra esfria para baixo. Depois de amostra é completamente dissolvida (normalmente ~ 4-5 ciclos de sonication), tomar 200 µ l de solução lisada e dissolver em 1.800 µ l de óleo de milho para fazer a solução final de trabalho (4-OH-tamoxifeno, 1 mg/mL).
- Para tamoxifeno, diluir a 50 mg/mL em etanol 100% e vórtice até que esteja dissolvido. Diluído em óleo de milho para fazer a solução final de trabalho (tamoxifeno, 10 mg/mL) e agitar a 45 ° C, para garantir que ele é completamente dissolvido.
- Para indução embrionária precoce, injetar 4-OH-tamoxifeno intraperitonealmente uma barragem grávida.
- Usar injeções 4-OH-tamoxifeno (até ~ 150 µ g por grávida do mouse, ou cerca de 5 mg/kg de peso corporal) em 5.5 e posteriormente como rendem barragem viável, embriões e filhotes.
- Uso de tamoxifeno em doses de 0,5 - 1,5 mg (ou 17-50 mg/kg) para barragens grávidas com embriões em ~ E9 e daí em diante. Use uma agulha 30G para injeções todos.
Nota: A filtração através de um filtro de 0,22 µm é normalmente usada para esterilizar todas as misturas antes da injeção.
- Para análise clonal, usar injeções intraperitoneal de altas doses de 4-OH-tamoxifeno (por exemplo, 5 mg/kg) ou tamoxifeno (por exemplo, 50 mg/kg) para marcar células múltiplas.
- Para marcar células individuais, titula-se a dose de 4-OH-tamoxifeno ou tamoxifeno tal que no tecido de interesse (ou seja, a aorta), quase todos os embriões analisados (conforme descrito abaixo no final desta seção) tem ou não células rotuladas ou apenas células de uma única cor; Esta é a dose limiar.
- Para marcar células no período gestacional meados-final e de traçar seu destino ou clonality no mouse pós-natal, injetar progesterona na cavidade intraperitoneal da barragem grávida concomitantemente com tamoxifeno em um 1:2 (progesterona: tamoxifeno) relação dose.
Nota: Doses de tamoxifeno são 17-50 mg/kg, e doses de progesterona são 8.5-25 mg/kg (ou seja, metade das doses tamoxifeno). A injeção de progesterona pode atrasar o trabalho por ~ 1-2 dias. - Euthanize a barragem grávida com embriões de uma idade desejada, usando um método de soltar aberto, onde a represa é colocada num recipiente contendo algodão ou gaze embebida com isoflurano não diluído. Confirmar a morte, abrindo a cavidade torácica para induzir o pneumotórax, removendo os órgãos vitais, e/ou realizando deslocamento cervical.
- Limpar o abdômen com etanol a 70%. Use a tesoura para abrir o abdômen e dissecar para fora do útero. Retire os embriões do útero e cuidadosamente separar os embriões a placenta e o saco vitelino usando fórceps.
- Eutanásia os embriões no E15 ou mais velhos, realizando deslocamento cervical ou decapitação com tesoura cirúrgica ou uma lâmina afiada.
Nota: Embriões mais jovens que E15 morrem rapidamente após eutanásia da mãe e/ou a remoção dos embriões de mãe. - Coloque os embriões em PBS gelado e corte um pequeno pedaço da cauda com uma tesoura de genótipo para o repórter CreER e Cre.
- Consertar os embriões em 4% paraformaldeído a 4 ° C por 2 h. lavagem os embriões três vezes em PBS e então incubar os embriões em 30% de sacarose em PBS em tubos de 15 mL, esperando até que afundam, que pode demorar até dois dias.
- Preenchimento plástico congelando moldes até 2/3 do nível máximo com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Coloque cada embrião verticalmente no molde, inteiramente submergido em outubro incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT) para minimizar bolhas.
- Lugar congelar blocos de tecido na posição vertical em um gelo seco, banho de etanol 70% para congelar. Armazenar os blocos a -80 ° C.
- Definir a temperatura do criostato a-22 ° C e cortar blocos para gerar seções transversais através da aorta inteira, 10-20 µm de espessura. Secar as lâminas no RT por 30 min antes de armazená-los no -80 ° C.
- Descongelar os slides no RT, protegido da luz, para evitar o branqueamento de fluorophores. Lave os slides com PBS-Tween20 0,1%.
- Para análise clonal, mancham os slides para núcleos (DAPI, 5 mg/mL) e imagem diretamente outros fluorophores no reporter de arco-íris Cre (Cerulean: 433-nm de excitação máxima, 475-nm de emissão máximo; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Uso o seguinte filtros para detectar fluorophores com um microscópio fluorescente vertical: DAPI (excitação máximo largura de banda/350/50 nm, emissão/largura de banda de max 460/50 nm), Cerulean (excitação 436/20 nm, emissão 480/40 nm), texas vermelho (excitação 560 / 40 nm, emissão 630/75 nm) e um filtro personalizado para separar mOrange (excitação 577/10 nm, emissão 630/50 nm) mCherry.
- Para o mapeamento de destino com o repórter de Cre mTmG, detectar GFP (484 nm, 510 nm), por imagem diretamente ou usando immunostaining. Para a imagem latente com um microscópio fluorescente na posição vertical, use um filtro GFP (excitação 470/40 nm, nm de emissão 525/50).
- De imunocoloração, incubar seções com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, lavar com 0,1% Triton X-100 em PBS e então incubar com anticorpos secundários para 1 h. uso anti-CD31 (concentração final 0,0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) e Cy3-anticorpos primários diretamente conjugado anti-SMA (diluição final de 1: 500) e uso secundário antibodiedirectamente conjugada com fluorophores (diluição final de 1: 500) (consulte a Tabela de materiais) de s.
- Para análise clonal, mancham os slides para núcleos (DAPI, 5 mg/mL) e imagem diretamente outros fluorophores no reporter de arco-íris Cre (Cerulean: 433-nm de excitação máxima, 475-nm de emissão máximo; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Imagem de slides com um microscópio fluorescente vertical (ampliação: 4x - 20 X) ou microscópio confocal (10 X X-63). Para alta ampliação, use um 63 da imagem latente confocal x objetivo de óleo com uma abertura numérica de 1,4-0,6 e um tamanho de quadro de 1.024 x 1.024 pixels.
2. Explantes Embryonic Aorta cultura
Nota: esta abordagem foi usada anteriormente para avaliar o papel da integrina beta3 em estenose do explantados Eln (- / -) aorta embrionárias 9 , 18.
- eutanásia em uma barragem cronometrado-grávida em E15.5 por inalação de isoflurano em excesso, conforme passo 1.8, acima.
- Colheita e eutanásia os embriões, conforme etapas 1.9-1.10, acima.
- Posição do embrião passivamente e fixar os membros estendidos ao Conselho de dissecação. Visualizar com um estereoscópio de dissecação e use uma tesoura para cortar uma incisão vertical do abdômen através do osso esterno no tórax superior. Embora dissecar o timo, traqueia, pulmões, esôfago, fígado e intestino.
- Gentilmente puxe o coração ventralmente usando fórceps e usar tesouras para dissecar a aorta longe a face dorsal das cavidades torácicas e abdominais. Para liberar a aorta, corta a raiz proximal e as distais posições abdominais.
- Coloque a aorta em PBS estéril gelada em uma capa de cultura de células. Transferir a aorta para uma placa de 24 e a cultura em DMEM com 0,5% FBS para até 24 h a 37 ° C.
Nota: O meio de cultura pode ser complementado com um anticorpo de bloqueio (por exemplo, anti-integrina αvβ3 anticorpo em 0,02 mg/mL 9; Veja a Tabela de materiais) ou um agente farmacológico. - Lave a aorta duas vezes com PBS e então corrigi-lo com paraformaldeído 4% por 20 min.
- Lavar três vezes com PBS e transferência da aorta com um tubo de 1,5 mL com 30% de sacarose em PBS. Depois a aorta coletores, fazer blocos congelados do tecido, corte de seções e delgados, como descrito nos passos 1.13-1,15, acima.
3. Isolamento de SMC da Aorta Perinatal
Nota: esta abordagem está sendo usada para comparar a biologia da SMCs na aorta isolada de ratos perinatais Eln (- / -) e sua.
- Euthanize murino um filhote no dia pós-natal (P) 0,5, por deslocamento cervical ou por decapitação com tesoura cirúrgica ou uma lâmina afiada, como descrito na etapa 1.10, acima.
- Executar etapa 2.3 e então, depois de abrir o tórax e abdômen, punção do ventrículo esquerdo com agulha 23G. Tubos plásticos de uso para conectar a agulha para seringa estéril contendo PBS mantido verticalmente em uma posição elevada para que PBS flui para o ventrículo esquerdo por gravidade. Permita a infusão de PBS estéril em ventrículo esquerdo até o fígado blanches.
- Usar fórceps para remover o tecido adventícia do lado de fora da aorta e dissecar a aorta, conforme descrito na etapa 2.4.
- Digerir a aorta em uma única solução de DMEM (500 µ l) suplementado com 225 U/mL colagenase, 2.25 elastase U/mL e 1 x antibiótico antimicótico por 45 min a 37 ° C. manualmente agitar o tubo cada 5-10 min.
- Do bairro de cultura celular estéril, titurate o tecido digerido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 200 µ l para gerar uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão de célula única para um tubo de 15 mL, adicionar 2 mL de DMEM e centrifugar a 920 x g durante 5 min à 25 ° C.
- Desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 3 mL de meio de cultura SMC (DMEM contendo 10% FBS suplementado com rhFGF de 1 µ g/mL, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL penicilina/estreptomicina e anfotericina B de 2,5 µ g/mL). Transferir para uma placa de cultura de 35 mm.
Nota: Após o isolamento inicial, ~ 400.000 células são obtidas de uma único P0.5 sua aorta; ~ 300.000 dessas células são SMCs. - Cultura as células a 37 ° C e mudar de meio de cultura fresco SMC a cada 3 dias. Usando as técnicas padrão com tripsina, passagem das células quando confluentes. Para experiências, usar células de passagens 3-7.
4. Ratos de colocação de mini bomba osmótica em grávidas (ou Non-grávida) subcutâneos
Nota: esta abordagem foi usada anteriormente para fornecer continuamente um agente farmacológico (por exemplo, integrina β3 e β5 inibidor cilengitide) de embriões no útero 9. A bomba foi inserida na barragem grávida no E13.5 e mantida até o parto.
- Anestesiar os ratos com 2-5% de isoflurano em oxigênio (taxa de fluxo de 1 L/min) para indução e 1-3% para manutenção. Use o reflexo de dedo-pinch para monitorar o nível de anestesia e ajuste o agente anestésico, conforme necessário. Administrar a buprenorfina subcutânea (0,05 - 0,1 mg/kg) para analgesia.
- Raspar a parte inferior das costas com clippers. Use cortinas estéril, luvas e instrumentos e manter os ratos em uma placa de aquecimento cirúrgico durante a cirurgia.
- Coloque cada rato na posição prona e esfregar as costas com betadine, seguido de álcool isopropílico. Aproximadamente 3-5 cm rostral à base da cauda na parte inferior das costas, usar um bisturi para fazer uma incisão horizontal na pele 0,5 - 1,0 cm de comprimento, sem ferir o músculo subjacente.
- Inserir a incisão com uma pinça hemostática e criar uma bolsa subcutânea rostral para implantação de bomba abrindo e fechando as mandíbulas hemostato.
- Preencher uma bomba osmótica mini com o agente de escolha, conforme o fabricante ' as diretrizes de s (consulte a Tabela de materiais). Introduza a bomba preenchida no bolso e fechar a incisão com grampos ou suturas não absorvíveis de 6-0. Certifique-se de que o tempo cirúrgico total é menos de 10 min.
- Post-operatively, monitorar os ratos cada 15 min até que eles se recuperaram de prostração esternal. Administre subcutânea buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg) a cada 6-12 h por 48 h. Quando os ratos têm recuperado da anestesia geral, monitorá-los diariamente. Remover os grampos ou suturas pós-operatório de 7-10 dias.
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Representative Results
Em uma análise clonal representativa da SMCs em mutante de embriões para o Eln (o gene que codifica a elastina de proteínas da matriz extracelular), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 ratos foram acoplados a Eln(+ /-) ratos também carregando o multi cor ROSA26R(Rb/Rb) repórter. Conforme descrito na etapa 1, plugues foram verificadas, grávidas barragens foram induzidas com uma injeção única tamoxifeno (1,5 mg) em E12.5, e foram sacrificados em E18.5. Os embriões foram colhidos, fixo, congelado e genótipo. Transverso, descendente da aorta cryosections foram cortado. Seções do Eln(+ /-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) embriões indicam que a camada interna em excesso SMCs que se acumulam no Eln-ratos nulos (começando depois E15.5) são marcados por várias cores ( A Figura 1) e daí derivam vários actina de músculo liso-alfa (SMA)+ células que estão presentes no ~ E12.5. Na aorta, E12.5 SMA+ células estão limitadas a túnica média.
Para gerar o Eln(- / -) aorta embrionária de explantes, macho e fêmea Eln(+ /-) ratos foram acasalados. Usando os métodos descritos na etapa 2, plugues foram verificadas e grávida Eln(+ /-) barragens foram sacrificados em E15.5. A aorta foram isolada a partir de embriões Eln(- / -) e cultivadas para 0 ou 18 h, na presença de um anti-integrina β3 bloqueando anticorpo ou um controle de IgG1. Aorta então eram fixas, congeladas, e cryosectioned e cryosections foram corados por SMA (marcador da SMC), CD31 (marcador de células endoteliais) e núcleos (DAPI) (Figura 2). Os resultados demonstram que até 18 horas de cultivo, a aorta E15.5/Eln(- / -) torna-se hypermuscular e estenóticas. Esse processo é atenuado por um anticorpo de bloqueio anti-integrina β3.
SMCs foram isoladas a partir da aorta de ratos sua no P0.5. Conforme descrito na etapa 3, SMCs foram isoladas a partir da aorta dissecada neonatal por digestão enzimática e foram cultivadas. As células foram passadas, e as células de passagem 3 foram coradas por marcadores SMC (i.e., SMA, músculo liso cadeia pesada de miosina (SMMHC) ou transgelin (também conhecido como SM22α)), CD31 e núcleos (DAPI) (Figura 3). A maioria de culturas de células expressa marcadores SMC mas não CD31.
Para avaliar se a inibição farmacológica da integrina β3 pode atenuar hypermuscularization e estenose do Eln(- / -) aorta na vivo, nós continuamente infundido o inibidor cilengitide por causa de sua meia-vida curta no plasma. Eln(+ / −) machos e fêmeas foram acasaladas, e, conforme descrito na etapa 4, minibombas osmóticos carregadas com cilengitide foram implantadas em barragens grávidas no E13.5. No P0.5, filhotes foram sacrificados e de genótipo e sua aorta foram analisada. Cilengitide tratamento atenua significativamente a estenose aórtica e hypermuscularization em ratos Eln(- / -) (Figura 4) sem alterar a sua aorta9. Assim, o anti-integrina β3 é uma abordagem não-invasiva potencialmente promissor para tratar a aortopathy de elastina.
Figura 1 . SMCs excesso na Aorta Eln(- / -) derivam de múltiplos SMCs pré-existentes. Barragens grávidas com embriões Eln(- / -), Acta2-CreERT2 também carregando o repórter Cre multicolor ROSA26R(Rb / +) foram induzidas com uma única injeção intraperitoneal de tamoxifeno (1,5 mg) em E12.5. Barragens foram sacrificadas em E18.5, e secções transversais da aorta descendente dos embriões foram analisadas, com coloração para DAPI e a fluorescência direta de cores Rb, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) e mOrange (mOr). SMCs em excesso se acumulam na face interna do Eln-aorta nula após E15.518. As SMCs excesso de camada interna incluem células de várias cores (asteriscos), indicando o polyclonality. Lu, lúmen aórtico. Barra de escala, 10 µm. reproduzido de Misra et al, 20169. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Bloqueio de integrina αvβ3 anti atenua Hypermuscularization e estenose do Eln(- / -) explante da aorta. Em E15.5, grávidas barragens foram sacrificadas e foram colhida a aorta de embriões Eln(- / -) . Aortas isoladas foram fixados imediatamente ou cultivados na presença de um controle de isotipo IgG1 ou um integrina αvβ3 bloqueio anticorpo para 18 h antes da fixação. Fixo da aorta foram corada para CD31, SMA e núcleos (DAPI). Lu, lúmen aórtico. Barra de escala, 100 µm. reproduzido de Misra et al, 20169. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Isoladas e cultivadas SMCs da aorta de ratos Neonatal expresso músculo liso marcadores. SMCs foram isoladas a partir de filhotes P0.5 e foram cultivadas. Células da terceira passagem eram fixas e manchadas para CD31 (marcador da CE), núcleo (DAPI) e um marcador SMC (SMA, SM22α ou SMMHC, conforme indicado). Esta análise indica que ~ 90% das culturas de células expressam marcadores SMC, e nenhum foram observados para expressar CD31. Escala da barra, 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Infusão contínua de Cilengitide In Vivo atenua Eln(- / -) Hypermuscularization aórtica e estenose. Masculino e feminino Eln(+ /-) ratos foram cruzados. A integrina β3 inibidor cilengitide ou veículo (PBS) foi infundido continuamente em barragens grávidas usando minibombas osmóticos, começando em E13.5. Secções transversais em P0.5 foram coradas por SMA (vermelho), CD31 (branco) e núcleos (DAPI, azul). Lu, lúmen aórtico. Barra de escala, 100 µm.
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Discussion
Em contraste com as extensas investigações de murino aorta e seus ramos principais em adultos condições patológicas, tais como modelos de aterosclerose, menos é conhecido sobre a morfogênese e a patogênese da aorta embrionária e perinatal. Aqui, nós centrar-se na aorta embrionárias/perinatal, especificamente as SMCs e fornecer protocolos para estudar a aorta através na vivo, explante de tecido, e isolamento de SMC se aproxima. Essas abordagens complementares fornecem o investigador com diversas abordagens para estudar a aorta embrionárias/perinatal.
Análise clonal é uma abordagem muito poderosa que permite investigar o comportamento de células individuais. Recentemente nós usamos esta abordagem para ajudar a identificar SMCs especializados na vasculatura pulmonar10. É fundamental reconhecer que, em um rato individual carregando um repórter de Cre multi cor, há uma chance de que as células da mesma cor podem derivar de mais de um evento de recombinação. Assim, análise clonal com um repórter multi cor exige a avaliação de inúmeros ratos. Porque tamoxifeno no período gestacional meados-final pode interferir no parto, para experimentos que marcar células no período gestacional meados-final e localizá-los pós-natal, progesterona e tamoxifeno devem ser injetados concomitantemente. Semelhante aos protocolos no embrião, mapeamento de destino e análise clonal de células no rato adulto podem ser realizadas com a injeção intraperitoneal de tamoxifeno no adulto.
Mapeamento de análise e destino clonal de SMCs usa carregando transgenes com a expressão da Cre recombinase sob o controle dos promotores com maior atividade na musculatura lisa de ratos. Aqui, descrevemos protocolos utilizando ratos carregando condicional transgenes Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2. Myh11 é o marcador mais específico de SMCs19; no entanto, é ativador do aorta Eln(- / -) 9. Acta2 é expresso em SMCs, incluindo as do Eln-aorta nula, mas não é tão específico porque ela também é expressa em outros tipos de células. Se esses transgenes condicionais foram "furados" (ou seja, induzir recombinação na ausência de tamoxifeno), pode ser problemática, como os experimentos não iria delinear o timing da marcação de célula. O leakiness desses transgenes foi analisada, avaliando a atividade de beta-galactosidase em camundongos carregando um baseado em lacZ Cre repórter e Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2 após o tratamento do veículo ( ou seja,, na ausência de indução de tamoxifeno)11,12. Com base nesta análise, esses transgenes considerados não gotejantes.
Hypermuscularization caracteriza várias patologias vasculares em seres humanos. Por exemplo, estenose aórtica supravalvular (SVAS) é uma condição congênita devastador que se caracteriza pela obstrução das artérias de grandes e médio porte devido a excesso SMCs. SVAS resultados da perda de função de um alelo do gene do ELN e ocorre como uma entidade isolada ou, mais comumente, como parte de Williams-Beuren síndrome20,21,22,23,24. Fenocópia de ratos mutantes ELN(- / -) muitos aspectos do fenótipo da aorta de SVAS18,21,22. Aórtica explantes de embriões Eln(- / -) rapidamente tornar-se obstruído durante a cultura, que continuam de explantes de embriões de sua patente9,18. A abordagem da aorta explante facilita a triagem para agentes que atenuar estenose em elastina aortopathy9. No entanto, esta abordagem não leva em conta as forças mecânicas ou físicas que a aorta está sujeito enquanto no corpo. Assim, hits positivos na triagem de explante da aorta devem ser avaliadas com modelos de rato mutante do Eln em vivo .
O protocolo de isolamento de SMC é um método rápido e robusto para obter SMCs partir da aorta murino perinatal. Uma abordagem semelhante pode ser extrapolada para isolar SMCs de ratos adultos. Por causa de seu tamanho relativamente grande, a aorta adulta pode ser aberta no sentido longitudinal e a adventícia e células endoteliais dissecados fora. Para avaliar a pureza das células isoladas de aorta perinatal ou adulta, é importante verificar a expressão de marcadores SMC (por exemplo, SMMHC, smoothelin, SM22α e SMA) e a falta de expressão de marcadores de células endoteliais (por exemplo, CD31 e caderina vascular endotelial). Um potencial abordagem alternativa isolamento é a utilização de citometria de fluxo para isolar fluorescente etiquetado SMCs partir da aorta dissecada. Ratos, carregando uma fluorescente Cre repórter e Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2ou Tgln-Cre podem ser usados para rotular fluorescente SMCs11,12,25, 26,,27. Como alternativa, ratos transgénicos existentes com o promotor de SMA, dirigindo a expressão de um fluoróforo (i.e., GFP, mCherry ou RFP) podem ser usado de28,29,30.
Implantado osmóticos minibombas são usadas para fornecer a entrega contínua de agentes farmacológicos para animais de laboratório. Podemos ter implantado em ratos grávidos no E13.5 para entregar agentes para o desenvolvimento de embriões durante o resto do período gestacional9minibombas. Para alcançar os embriões, tais agentes devem ser capazes de passar a barreira sangue-placentária. Em geral, minibombas são muito bem toleradas e, dada a baixa taxa de infecção, antibióticos de rotina não são recomendados. Deiscência de ferida é rara; no entanto, se for detectada uma deiscência superior a 4 mm, o rato deve ser re-anestesiado e a ferida limpa e fechada novamente com uma sutura cirúrgica.
Este trabalho descreve um arsenal de abordagens que podem ser usados para estudar a formação normal da parede da aorta embrionária e perinatal durante o desenvolvimento, bem como após perturbações neste processo durante a doença. Além disso, estes protocolos podem ser aplicados para estudar a doença da aorta adulta e manutenção. Abordagens podem ser extrapoladas para outros vasos sanguíneos, bem como estruturas avasculares músculo liso-revestido, tais como o trato gastrintestinal ou nas vias aéreas pulmonares. Finalmente, técnicas semelhantes podem ser usadas para estudar os tipos de células, além da SMCs, como células endoteliais ou fibroblastos, bem como a interação entre estes tipos de células e SMCs.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dean Li para a partilha de protocolo do seu laboratório para isolamento de SMC da aorta. Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 para D.M.G), a American Heart Association (14GRNT19990019 brasileira de D.M.G.) e Universidade de Yale (Brown-Coxe Fellowship para A.M. e inicialização fundos para D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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