Summary
ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。
Abstract
大動脈は体の最大の動脈です。大動脈の壁は、内皮細胞の内側の層、中間層の弾性線維板と平滑筋細胞 (SMCs) 交互になると線維芽細胞と細胞外マトリックスの外側の層で構成されます。病態モデル (例えば、アテローム性動脈硬化) 成人の大動脈での広範な研究とは異なり、はるかに少ない胎生期および周産期の大動脈について知られています。ここでは、我々 は平滑筋細胞に焦点を当てる形態形成の解析や正常な開発および病気の胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞の病因のプロトコルを提供します。具体的には、4 つのプロトコルが含まれている: 私)生体内で胚運命マッピングとクローンの解析;ii) 胚大動脈培養;周産期の大動脈; iii) SMC 分離・ iv) 妊娠 (または非妊娠) マウス皮下浸透圧ミニ ポンプ配置。したがって、これらのアプローチは、origin(s)、運命、そして大動脈の生体内における平滑筋細胞のクローン構造の調査を促進します。薬理学的エージェントへの継続的な暴露によって胚大動脈形態形成子宮内で調節できます。さらに、孤立した大動脈組織外植片または大動脈平滑筋細胞は muscularization、増殖、移動などの基本的なプロセスの間に特定の遺伝子ターゲットの役割に洞察力を得るために使用することができます。孤立した平滑筋細胞と器官培養切片の大動脈にこれらの仮説を生成する実験は、薬理学的および遺伝的アプローチを通じて体内のコンテキストで評価できます。
Introduction
多細胞生物の細胞に栄養素と酸素を提供する関数の循環システム、ない外部環境と接触して、これらの細胞からの老廃物や二酸化炭素を削除します。脊椎動物、主循環システムは、ポンプ血血管のシリーズを通して、心で構成されます。動脈や、静脈などの太い血管の壁から成っている 3 つの層: 私) 内膜や血管内皮細胞の内側の層ii) メディア、または交互に円周方向の中間層細長い平滑筋細胞平滑筋細胞と弾性線維板;および iii) 外膜や結合組織、線維芽細胞の外側の層。血管生物学の研究の大半は血管内皮細胞に焦点を当てる、血管新生を新しい内皮細胞ライニング管の形成を調査します。比較では、平滑筋細胞は、比較的ほとんど注目を します。ただし、平滑筋細胞、血管病理、通常の動脈壁の建設に重要な細胞タイプです。
大動脈は心臓の左心室からの心拍出量を受けて体内最大口径動脈です。それは、多様な人間の病気、動脈硬化、動脈瘤、解離などに悩まされています。大人の有機体の大動脈とその主要な枝に激しく調査血管疾患のモデルで。例えば、供給が低比重リポ蛋白受容体またはアポリポ蛋白 E 遺伝子の null マウス高脂肪食を開発、動脈硬化と運命のマッピングの最近の研究を示す既存の平滑筋細胞がの種類の細胞に上昇を与える、動脈硬化性プラーク1。大動脈瘤の病理学的変化があります SMC アポトーシスと細胞外マトリックス2,3を改造します。
大幅に少ないは胎生期および周産期の期間中に SMC の形態形成と病態について知られています。ここでは、胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞体内の組織移植片の細胞を研究するためプロトコルを提供します。例えば、プロトコルの最初のセクションは、運命とマウス胎仔のクローン解析を区切ります。セル固有のプロモーターの制御下を表明した Cre リコンビナーゼを容易に特定のセルのマーキングとその子孫4,5,6;ただし、セル固有のラベルの時間的制御はマウスの萌芽期の開発中に挑戦することができます。この文脈において胚平滑筋細胞 (e.g.,Myh11またはActa2)、Cre 記者プロモーターの下で条件付きクレエを表現する私たちを提供タモキシフェンまたはその活性代謝物 4-オハイオ州 - にタモキシフェン妊娠中ダムを注入するための方法胚や生後の子孫の標識細胞を分析するため。さらに、運命のマッピングの研究、主に利用する単一記者 fluorophore1,7と Cre 記者と対照をなしてクローン解析大幅にマルチカラー Cre 記者と強化されています。
プロトコルの 2 番目と 3 番目のセクションでは、分離、それぞれ胚大動脈および新生児期から大動脈平滑筋細胞を培養するための方法を説明します。こうした方法により、特に大動脈弁植の平滑筋細胞のシグナル伝達経路の操作と薬理学的エージェントの直接影響を分析します。したがって、マウスの伝統的な遺伝子操作をよりもはるかに速い方法で興味のティッシュの特定の遺伝子の役割を検査します。さらに、孤立した SMC 研究細胞遊走の解析が容易し、付着性は、技術的には、限定の生体内。
最後に、4 番目のプロトコル セクションは、皮下浸透圧ミニ ポンプ搭載されて妊娠中 (または非妊娠) のマウスにおける薬理学的エージェントの配置を区切ります。このメソッドは、急速な代謝のための連続的な注入を必要とするエージェントによる胚の発育に及ぼす影響の分析を促進します。頻繁に注射の代替多くの代理店のための実用的ではない、それは妊娠中のダムにかなりの不快感を引き起こす可能性があります避ける必要があります。
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Protocol
マウスのすべてのプロトコル、動物介護制度とイェール大学で利用委員会によって承認されています
。1 体内 胚運命マッピングとクローン解析
注: 我々 は広く細胞モデルの開発と疾患モデルでクローン アーキテクチャの起源を評価するこれらのアプローチを使用している。 7, 8, 9, 10.
- 、クレエでマウスと Cre 記者とマウスの間で合うを設定します
。 メモ: クレエは SMC マークの使用します。Myh11 CreERT2 または Acta2 CreERT2 マウス 11 , 12 は、この目的のため使用されます。我々 は広く萌芽期ティッシュをマークするため ROSA26R CreERT2 マウス 13 を使用しています。- クローン解析のマルチカラー Cre 記者 (例えば 紙吹雪や虹 [Rb] マウス) 8 , 14 , 15 を使用し、運命のマッピングを使用して、単色 Cre 記者 (例えば、 ROSA26R YFP マウス 16) または二重色 Cre 記者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
注: この育種方式を使用して成体 2-6 ヶ月前 (一般に 〜 30 g)、胚、クレエと Cre 記者が生成されます 。
- クローン解析のマルチカラー Cre 記者 (例えば 紙吹雪や虹 [Rb] マウス) 8 , 14 , 15 を使用し、運命のマッピングを使用して、単色 Cre 記者 (例えば、 ROSA26R YFP マウス 16) または二重色 Cre 記者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- 朝は、金属を使用して膣にプラグ プローブして萌芽期の日 (E) 0.5 としてプラグ検出の日の正午をチェックします 。
- プラグインが検出されたとき男性から女性を区切ります 。
- 準備 4-オハイオ-タモキシフェンとタモキシフェン作業ソリューションを。
- 4-オハイオ-タモキシフェンの 100% エタノール、2 分間渦の 50 μ L に 5 mg を溶解し、コーン油の 450 μ L を追加。氷の上には、サイクル サンプルが冷えるまでの間休憩 10 秒サイクルの出力レベル 2 で超音波を照射します。サンプルは、完全に溶解した後 (通常 〜 超音波照射の 4-5 サイクル) 熱量溶液 200 μ L をとり、最終的な作業ソリューション (4-オハイオ-タモキシフェン 1 mg/mL) にするためコーン油の 1,800 μ L に溶解します 。
- 50 mg/ml 100% エタノールと渦に希釈、タモキシフェンのそれが溶解するまで。完全に溶解して 45 ° C で攪拌し最終的な作業ソリューション (タモキシフェン 10 mg/mL) コーン油で希釈 。
- 初期胚誘導の注入 4 ああタモキシフェン腹腔妊娠中のダム。
- 4 ああタモキシフェン注射 (妊娠中のマウス、または約 5 mg/kg 体重あたりまで 〜 150 μ g) を使用して、E5.5 で、その後彼らは実行可能なダムや胚、子犬をもたらすと 。
- 0.5 - ダムの胚で妊娠中の 1.5 mg (または 17 〜 50 mg/kg) の投与量で使用タモキシフェン 〜 E9 以降。すべての注射の 30 G の針を使用します
。 注: 0.22 μ m のフィルターによるろ過は注入前にすべての混合物を殺菌する通常使用されます。
- クローン解析 4-オハイオ-タモキシフェン (例えば、5 mg/kg) またはタモキシフェン (例えば、50 mg/kg) に複数の細胞の高用量の腹腔内注射を使用します。
- 個々 のセルをマーク、4 ああタモキシフェンまたはタモキシフェン投与量を滴定しなさい、興味 (すなわち 大動脈) の組織で分析 (このセクションの終わりに後述) としてほぼすべての胚があるないラベルのセルまたはセルだけに
- 単一の色。これはしきい値線量です 。
- 中期後期妊娠期間で細胞をマークし、彼らの運命やクローナリティ生後早期のマウスでトレースする注入プロゲステロン腹腔妊娠中のダムの付随して 1:2 (プロゲステロン: タモキシフェン) でタモキシフェンと線量比
。 注: タモキシフェン投与が 17 〜 50 mg/kg とプロゲステロンの用量は 8.5 〜 25 mg/kg (すなわち、タモキシフェン投与の半分)。プロゲステロン注射は、1 〜 2 日で労働を遅らせる可能性があります 。
- 安楽死綿やガーゼを含む容器にダムを配置する場所、オープン ドロップ方法を使用希望年齢の胚で妊娠中のダムは、原液イソフルランを浸した。気胸を誘導するために胸腔を開くことで、重要な臓器を削除することによってまたは頚部転位を実行することによって死を確認します 。
- は、70% エタノールで腹部を浄化します。腹部を切開し、子宮を解剖はさみを使用します。子宮から胚を外し、慎重に胎盤や鉗子を使用して卵黄嚢胚から分離します 。
- 頚部転位または手術用はさみで斬首や鋭い刃を実行して E15 以上の胚を安楽死させる
。 注: E15 より若い胚は急速に母の安楽死および/または母から胚の除去に続いて死ぬ 。
- 氷冷 PBS で胚を置き、クレエと Cre のレポーターの遺伝子型にはさみを使って尾の小さな部分をカットします 。
- PBS で 3 回胚 2 h. 洗浄のための 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドで胚を修正し、30% スクロースを PBS で 2 日間かかることがあります彼らが沈むまで待って 15 mL チューブに胚をインキュベーションしています 。 凍結
- 塗りつぶしプラスチック金型の最適切削温度 (OCT) 化合物の最大レベルの 2/3 まで。室温気泡を最小限に抑える (RT) で 10 分間 10 月加温で完全に水没、金型でそれぞれの胚を垂直方向に配置します 。
- 凍結するティッシュのブロックをドライアイス、凍結する 70% エタノールお風呂で直立した場所。-80 でブロックをストア ° C
- は-22 ° c クライオスタット温度を設定し、全体の大動脈、10-20 μ m の厚さを横断を生成するブロックをカットします。RT-80 でそれらを格納する前に 30 分間のスライドを乾燥 ° C
- は、RT、fluorophores の漂白を避けるために光から保護でスライドを解凍します。0.1% PBS Tween20 とスライドを洗います。
- クローン解析核 (DAPI、5 mg/mL) のスライドを染色し、直接画像虹 Cre 記者の他のフルオロ (セルリアン: 433 nm 励起 max, 475 nm 蛍光最大; mOrange: 548 nm、562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
- 正立型蛍光顕微鏡で蛍光物質を検出するために、次のフィルター使用: DAPI (励起/最大帯域幅 350/50 nm、排出量最大/帯域幅 460/50 nm)、セルリアン (励起 436/20 nm、発光 480/40 nm), テキサスの赤 (励起 560/40 nm、発光 630/75 nm) と mOrange (励起 577/10 nm、発光 630/50 nm) から mCherry を分離するカスタム フィルター 。
- MTmG Cre 記者と運命のマッピング、GFP を検出 (484 nm、510 nm)、直接イメージングまたは免疫染色を用いた。正立型蛍光顕微鏡イメージングのため GFP フィルター (励起 470/40 nm、発光 525/50 nm) を使用します 。
- 免疫染色、4 ° C で一晩一次抗体を持つセクションを孵化させなさい、0.1% で PBS でトリトン X-100 を洗浄し 1 h. 使用反 CD31 の二次抗体とインキュベートし (最終濃度 0.0016 mg/mL)、抗 GFP (0.006 mg/mL) と。Cy3-直接共役アンチ SMA (1: 500 最終希釈倍率の一次抗体と二次 antibodie を使用フルオロ (1: 500 最終希釈) (材料の表 を参照) を直接共役 s.
- クローン解析核 (DAPI、5 mg/mL) のスライドを染色し、直接画像虹 Cre 記者の他のフルオロ (セルリアン: 433 nm 励起 max, 475 nm 蛍光最大; mOrange: 548 nm、562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
- 正立型蛍光顕微鏡でスライドを画像 (倍率: 4 X - 20 X) または共焦点顕微鏡 (10 X-63 X)。高倍率 1.4 0.6 の開口と 1,024 x 1,024 ピクセルのフレーム サイズ油目的 x 共焦点イメージングの 63 を使用します 。
2。胚大動脈文化を外植体
注: このアプローチ、explanted の狭窄に beta3 のインテグリンの役割を評価に使用していた 今回の Eln (-/-) 胚大動脈 9 , 18.
- 上 1.8、ステップごとの過剰イソフルラン吸入による E15.5 でタイミング妊娠中ダムを安楽死させる 。
- 収穫上 1.9-1.10 の手順に従って、胚を安楽死させると 。
- 葉末胚の位置し、解剖ボードに拡張四肢をピンします。郭清堅実で視覚化し、上部胸郭に胸骨を通じて腹部から縦切開をカットするはさみを使用してください。解剖まで胸腺、気管、肺、食道、肝臓、腸管 。
- ゆっくりと引き腹鉗子を用いた心臓、胸部および腹部の空洞の背側面から大動脈の解剖はさみを使っています。大動脈を解放するために近位のルートと遠位腹部位置カットします 。
- は、携帯文化フードで氷冷滅菌 PBS に大動脈を配置します。24 ウェル プレートに大動脈を転送し、DMEM で 0.5% で培養 37 24 h までの FBS ° C
注: 培養培地はブロッキング抗体 (例えば、 0.02 mg/mL 9 時 αvβ3 抗体を抗インテグリン; 参照 テーブルの材料) や薬理学的エージェントと補われることができます 。
- 20 分の 4% パラホルムアルデヒドで固定し、PBS で 2 回大動脈を洗う PBS のショ糖を
- PBS と 30% で 1.5 mL チューブへの転送、大動脈で 3 回洗う。大動脈は流し後、する凍結するティッシュのブロック、カット セクション、および immunostain、1.13 1.15 の手順で上記のよう 。
3。周産期の大動脈から SMC 分離
注: このアプローチは現在周産期マウス Eln (-/-) と野生型マウスから分離した大動脈平滑筋細胞の生物学を比較する使用されている
。- 、マウス子犬生後 (P) で 0.5、頚部転位または手術用はさみで斬首刑のいずれかまたは鋭い刃、1.10 の手順に記載されている上記安楽死 。
- は、2.3 の手順を実行し、胸部・腹部を開くと後、23 G 針で左心室を穿刺します。滅菌 PBS 含む注射器に針を接続するプラスチック製のチューブを使用は、PBS が重力によって左心室に流し込まれるように高い位置で垂直に開催。ブランシュは肝臓までは、左心室に滅菌 PBS の注入を許可します。
- 鉗子を使用して大動脈の外側に外の組織を削除し、ステップ 2.4 で説明されているように、大動脈を解剖します 。
- DMEM の単一のソリューションで大動脈をダイジェスト 225 U/mL コラゲナーゼ、2.25 U/mL エラスターゼ 1 x 37 ° C. 手動で振るの 45 分の抗生物質抗真菌とチューブ 5-10 分毎で補われる (500 μ L)
- 無菌細胞文化フード、titurate、上下単一細胞懸濁液を生成する 200 μ L ピペットでピペッティングによる消化組織。単一細胞懸濁液を 15 mL チューブに転送、DMEM、2 mL を加えるし、5 分 25 で 920 × g で遠心分離機 ° C
- は、上清を捨てます。SMC 培養液 (10 %fbs 添加 1 μ G/ml rhFGF、10 μ G/ml rhEGF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μ g/mL アムホテリシン B を含む DMEM) 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。35 mm 培養プレートに転送します
。 注: 最初の分離時に単一 P0.5 野生型大動脈; から取得されます ~ 400,000 セル~ 300,000、これらの細胞は平滑筋細胞 。
- は 37 ° C で細胞の培養し、新鮮な SMC 培 3 日ごとに変更します。標準的な手法を使用して、トリプシン、合流するときのセルを通路します。実験、3-7 の通路からセルを使用します 。
4。皮下の妊娠 (または非妊娠中) 浸透圧のミニ ポンプ配置マウス
注: このアプローチは以前に使用した (例えば、 インテグリン β3 と β5 阻害剤の薬理学的エージェントを継続的に提供するにはcilengitide) 胚の 子宮内で 9 に。ポンプが E13.5 に妊娠中のダムで挿入され分娩まで維持されます
。- 麻酔と酸素 (1 L/分の流量) 誘導とメンテナンスのための 1-3% の 2-5% イソフルレン マウス。麻酔のレベルを監視するつま先ピンチ反射を使用し、必要に応じて麻酔薬を調整します。鎮痛に対する皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します 。
- は、背中の下部をバリカンで剃る。滅菌ドレープ、手袋、および計測器を使用し、手術中に加熱外科板でマウスを維持します 。
- 腹臥位でそれぞれにマウスを置き、イソプロピル アルコールに続いて betadine で背中をスクラブします。3-5 cm より低い背部の尾の根元に吻側水平皮膚切開 0.5 - 1.0 cm の基になる筋肉を傷つけることがなく長さを作るメスを使用します 。
- 挿入、止血、切開、止血顎の開閉によりポンプ注入の吻方皮下ポケットを作成します 。
- は、メーカーごとの選択のエージェントにミニ浸透圧ポンプを埋める ' s ガイドライン (材料の表 を参照してください)。ポケットにいっぱいポンプを挿入し、クリップまたは 6-0 非吸収性縫合糸で切開を閉じる。総手術時間が 10 分未満であることを確認
- は, 胸骨の横臥から回復が彼らまでマウス 15 分毎を監視します。48 時間毎の 6-12 h 皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します。マウスは、全身麻酔から完全に回復して、毎日それらを監視します。クリップの削除手術 7-10 日後に縫合糸またはします 。
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Representative Results
代表的なクローン性解析で平滑筋細胞のEln (細胞外マトリックス蛋白質エラスチン遺伝子) の変異株の胚運ぶまた Eln(+/-) マウスにEln(+/-)、Acta2 クレエT2マウスを交配、マルチカラー ROSA26R(Rb/Rb)記者。手順 1 で説明したプラグがチェックされ、E12.5 で単一タモキシフェン注入 (1.5 mg) で誘導された妊娠中のダム、彼らが E18.5 で犠牲になった。胚は、収穫、固定、冷凍、および誘因でした。横行大動脈凍結切片を降順がカットされました。Eln(+/-)、Acta2 クレエT2からのセクションROSA26R(Rb/+) 今回の Elnに蓄積する過剰な内側の層の平滑筋細胞胚を示す-null マウス (E15.5 以降) は、複数の色 (によって示される図 1)したがって細胞に存在する複数の α-平滑筋アクチン (SMA)+から派生し、〜 E12.5。E12.5 大動脈内細胞の SMA+は、チュニカ メディアに限定されます。
植、オスとメスのEln(-/-)胚大動脈を生成するには、今回の Eln(+/-)マウスを交配されました。手順 2 で説明した方法を使用すると、プラグがチェックされ、妊娠した今回の Eln(+/-)ダムが E15.5 で犠牲になった。大動脈はEln(-/-)胚から隔離され、0 または抗体や特異的な IgG1 コントロール ブロック抗インテグリン β3 の存在下で 18 時間培養します。大動脈、固定、凍結、および SMA (SMC マーカー) の cryosectioned、および凍結切片を染色 CD31 (血管内皮細胞マーカー) と核 (DAPI) (図 2)。養殖の 18 時間以内E15.5/今回の Eln(-/-)大動脈に hypermuscular になることを示唆し、狭窄。このプロセスは、抗インテグリン β3 ブロッキング抗体によって減衰されます。
SMCs は P0.5 野生型マウスの大動脈から分離されました。手順 3 で説明した、平滑筋細胞が酵素の消化力によって切り裂かれた新生児大動脈から分離された、培養します。セルが継代し、通路 3 細胞染色による SMC マーカー (すなわちSMA、平滑筋ミオシン重鎖 (SMMHC)、または transgelin (また SM22α として知られている))、CD31 と核 (DAPI) (図 3)。培養細胞のほとんどは、SMC マーカーがない CD31 を表現します。
半減期が短いため阻害剤 cilengitide を注入インテグリン β3 の薬理学的抑制を減衰させること hypermuscularization およびEln(-/-)大動脈の生体内で、我々 は継続的に狭窄症かどうかを評価するにはプラズマ。今回の Eln(+/−)男女を交配と、浸透圧ミニ ポンプ cilengitide 搭載手順 4 で説明した、移植された E13.5 に妊娠中のダム。P0.5 メスで子犬を安楽死させ、誘因、その大動脈を行った。Cilengitide 治療は、大動脈弁狭窄症とEln(-/-)マウス (図 4) の hypermuscularization を野生型大動脈9を変更することがなく大幅減衰させます。したがって、抗インテグリン β3、エラスチン aortopathy を治療するために可能性のある有望な非侵襲的アプローチです。
図 1.今回の Eln(-/-)大動脈の過剰な平滑筋細胞に由来する複数の既存の SMCs 。ダムも多色の Cre 記者を運ぶEln(-/-)、Acta2 クレエT2の胚で妊娠中ROSA26R(Rb/+) E12.5 でタモキシフェン (1.5 mg) の腹腔内注射で誘発されました。ダムが E18.5 で犠牲になった、DAPI ・ Rb 色の直接蛍光染色と、胚の下降大動脈の横断を行ったセルリアン (Cer)、mCherry (mCh)、および mOrange (mOr)。今回の Elnの内側の側面に余分な平滑筋細胞蓄積-E15.518後 null の大動脈。余分な層内の平滑筋細胞には、polyclonality を示す複数色 (アスタリスク) のセルが含まれます。Lu、大動脈内腔。スケール バー、10 μ m 転載ミスラら2016年9から。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.反 αvβ3 インテグリン封鎖減衰Eln(-/-)大動脈植の狭窄と Hypermuscularization。E15.5 で妊娠中のダムを安楽死させ、今回の Eln(-/-)胚の大動脈が収穫されました。孤立した大動脈だったか即座に修正されたり、アイソタイプ コントロール IgG1 または固定する前に 18 h のインテグリン αvβ3 遮断抗体の存在下で培養しました。固定の大動脈は、CD31、SMA、核 (DAPI) に染色された.Lu、大動脈内腔。スケール バー、100 μ m 転載ミスラら2016年9から。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.隔離され、新生児マウス エクスプレス平滑筋マーカーから大動脈平滑筋細胞を培養します。SMCs は p0.5 メス子犬から隔離され、培養します。3 番目の通路からの細胞固定、CD31 のステンド グラス (EC マーカー) 核 (DAPI) と (SMA、SM22α、または SMMHC、示されているように) SMC マーカー。この分析は、培養細胞の ~ 90% エクスプレス SMC マーカーなしは CD31 を表現する観察されたことを示します。スケール バー、100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.Cilengitide生体内での持続注入減衰Eln(-/-)の大動脈 Hypermuscularization と狭窄。雌雄マウス(+/-)今回の Elnを越えていた。インテグリン β3 阻害剤 cilengitide や車両 (PBS) 継続的に浸透ミニ ポンプ E13.5 で始まるを使用して妊娠中のダムで注入しました。P0.5 で横断は、SMA (赤)、CD31 (白) 核 (DAPI、青) に染色された.Lu、大動脈内腔。スケール バー、100 μ m。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マウスの大動脈とその主要な枝動脈硬化のモデルなど、大人の病理学の条件の広範な調査とは対照的形態形成と胚および周産期の大動脈の病原性について知られています。ここでは、具体的には平滑筋細胞、胚/周産期大動脈に着目し、体内組織植を介して大動脈を研究するためのプロトコルを提供し、SMC の分離方法します。これらの無料の方法は、胚/周産期の大動脈を研究する様々 なアプローチの調査官を提供します。
クローン解析は、個々 のセルの動作を調査することができます非常に強力な方法です。最近10肺血管に特殊な平滑筋細胞を識別するためにこの方法を使いました。マルチカラー Cre 記者を運ぶ個体のマウス、同じ色のセルが 1 つ以上の再結合イベントから派生するチャンスがあることを認識が重要です。したがって、マルチカラー記者とクローンの解析には、多数のマウスの評価が必要となります。中期後期妊娠期間にタモキシフェンが中期後期妊娠期間で細胞をマーク、後天的、それらをトレース実験のための分娩に干渉するためプロゲステロンとタモキシフェン付随して注入する必要があります。胚のプロトコルと同様に、運命と成体マウスの細胞のクローン解析引き受けることができる大人にタモキシフェンの腹腔内注入。
平滑筋細胞のクローン性解析と運命のマッピングを使用して、マウス平滑筋活性の増強とプロモーターの制御下で Cre リコンビナーゼの発現と遺伝子を運ぶします。ここでは、条件付きの transgenes Myh11 クレエT2またはActa2 クレエT2を運ぶマウスを用いたプロトコルについて述べる.SMCs19; 最も特定のマーカーである Myh11しかし、今回の Eln(-/-)大動脈9ダウンレギュ レートです。Acta2 は今回の Elnのそれらを含む平滑筋細胞で表されます-null の大動脈、それは他の細胞型で表現するときも、具体的ないです。これらの条件付きの遺伝子が「漏れやすい」場合 (すなわちタモキシフェンの不在で組換えを誘導する) 実験はないセル マーキングのタイミングを描くように、問題となることがあります。マウス、lacZ ベース Cre 記者とMyh11 クレエT2または車両の処置 (に続くActa2 クレエT2 β-ガラクトシダーゼ活性を評価することによってこれらの transgenes の水漏れしたためを行ったすなわち、タモキシフェン誘導の不在で)11,12。この分析に基づいて、これらの transgenes 考慮されたない漏れ。
Hypermuscularization 人間の複数の血管病態の特徴です。例えば、大動脈狭窄 (SVAS) は今回の ELNの遺伝子の 1 つの対立遺伝子の機能の損失から余分な SMCs。 SVAS の結果のための大型・中型動脈の閉塞によって特徴付けられる壊滅的な先天性の条件ウィリアムス Beuren シンドローム20,21,22,23,24の一部として一般的には、孤立したエンティティまたは、複数として発生します。今回の Eln(-/-)の変異マウス phenocopy SVAS18,21,22の大動脈の表現型の多くの側面。Eln(-/-)胚から大動脈植は急速に野生型の胚から植まま特許9,18に対し、培養中閉塞になります。大動脈弁植アプローチ エラスチン aortopathy9で狭窄を減衰するエージェントのためのスクリーニングが容易になります。ただし、このアプローチに入れないアカウント大動脈は体中には機械的または物理的な力。したがって、大動脈植スクリーニングで肯定的なヒットは、 Eln のインビボ変異マウス モデルで評価されなければなりません。
SMC の隔離のプロトコルは、周産期のマウス大動脈平滑筋細胞を取得する高速かつ堅牢な方法です。同様のアプローチは、大人のマウスから平滑筋細胞を分離する推定できます。そのサイズが比較的大きいため成人の大動脈は縦方向に開くことができるし、外膜と血管内皮細胞を離れて解剖。周産期または成人大動脈から分離された細胞の純度を評価するには、SMC マーカー (例えばSMMHC、smoothelin、SM22α、および SMA) の式と (例えば、血管内皮細胞マーカーの発現の欠如を確認することが重要です。CD31 と血管内皮細胞のカドヘリン)。フローサイトメトリーを使用して蛍光を分離する分離の代替アプローチは潜在的な解剖大動脈平滑筋細胞のラベル。蛍光 Cre 記者とMyh11 クレエT2、T2Acta2 クレエ、またはTgln Creを運ぶマウスは蛍光 SMCs11,12,25をラベルに使用することができます。 26,27。また、蛍光体 (すなわちGFP、mCherry、または RFP) の式を駆動 SMA プロモーターと既存のトランスジェニック マウスは使用される28,29,30をすることができます。
注入浸透ミニ ポンプは、実験動物への薬理学的エージェントの継続的な配信を提供するために使用されます。9妊娠期間の残りの間に胚の開発にエージェントを提供する E13.5 に妊娠マウスにおけるミニ ポンプを留置したが。このような薬剤は、胚を到達するには、血液胎盤関門を通過できる必要があります。一般に、ミニ ポンプは非常に忍し、感染率が極めて低い、ルーチンの抗生物質は推奨されません。創傷裂開、まれです。裂開 4 mm 以上が検出された場合マウスが再麻酔する必要があり、傷きれいに手術用の縫合糸で再び閉じ。
この作品では、このプロセスの病の中に摂動後だけでなく、開発中に胎生期および周産期の大動脈壁の通常形成を研究するためのアプローチの装備一式をについて説明します。さらに、これらのプロトコルは、メンテナンスと成人の大動脈疾患の研究に適用できます。アプローチは、他の血管だけでなく、消化管や肺気道などの平滑筋コーティングの非血管構造を推定できます。最後に、同様の技術を使用して、セルタイプを超えて平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、これらの細胞の種類と平滑筋細胞の間の相互作用などを研究できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
大動脈の SMC 分離のための彼の実験室のプロトコルを共有を学部長の李を感謝いたします。アメリカ心臓協会、国立衛生研究所 (R21NS088854、R01HL125815、および R01HL133016 D.M.G に) によって提供された資金援助 (D.M.G. に科研費 14GRNT19990019)、イェール大学 (午前にブラウン コックス交わりと起動D.M.G. に資金)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R.
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
