Summary
Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.
Abstract
Die Aorta ist die größte Arterie im Körper. Die aortalen Wand besteht aus einer Innenlage aus Endothelzellen, einer Mittelschicht aus alternierenden elastische Lamellen und glatten Muskelzellen (SMCs) und eine äußere Schicht der Fibroblasten und extrazelluläre Matrix. Im Gegensatz zu der weit verbreiteten Studie von pathologischen Modelle (z.B. Arteriosklerose) in der Erwachsenen Aorta ist über die embryonale und perinatale Aorta weit weniger bekannt. Hier konzentrieren wir uns auf SMCs und Protokolle für die Analyse der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorten SMCs in normale Entwicklung und Krankheit. Insbesondere die vier Protokolle enthalten sind: ich) in Vivo embryonalen Schicksal Kartierung und klonale Analyse; (II) Explant embryonalen Aorta Kultur; (III) SMC isoliert von der perinatalen Aorta; und iv) subkutane osmotische Mini-Pumpe Platzierung in schwanger sind (oder nicht-schwangeren) Mäuse. Diese Ansätze ermöglichen die Untersuchung des Origin(s), des Schicksals und der klonalen Architektur von SMCs in die Aorta in Vivo. Sie ermöglichen für die Modulation embryonalen Aorta Morphogenese im Mutterleib durch die ständige Einwirkung von pharmakologischen Wirkstoffen. Darüber hinaus isolierte Aorta Gewebe explants oder Aorten SMCs Einblicke in die Rolle des spezifischen gen Ziele während grundlegende Prozesse wie Muscularization, Proliferation und Migration eingesetzt werden. Diese Hypothese schaffende Experimente an isolierten SMCs und der explantierten Aorta können dann im Kontext in Vivo durch pharmakologische und genetische Ansätze beurteilt werden.
Introduction
Die Herz-Kreislauf-Systeme der Mehrzeller Funktion, Nährstoffe und Sauerstoff zu den Zellen zu liefern sind, die nicht in Kontakt mit der äußeren Umgebung und Abfallstoffe und Kohlendioxid aus diesen Zellen zu entfernen. Bei Wirbeltieren besteht das primäre Herz-Kreislauf-System des Herzens, welche pumpt durch eine Reihe von Blutgefäßen Blut. Die Wände der großen Blutgefäße wie Arterien und Venen, bestehen aus drei Schichten: ich) die Intima oder innere Schicht von Endothelzellen; (II) die Medien oder mittlere Schicht abwechselnd umlaufend länglichen glatten Muskelzellen SMCs und elastische Lamellen; und Iii) der Adventitia oder äußere Schicht von Bindegewebe und Fibroblasten. Die überwiegende Mehrheit der Studien in der vaskulären Biologie konzentrieren sich auf Endothelzellen, die Bildung von neuen endothelial Zelle gesäumten Röhren durch Angiogenese untersucht. Im Vergleich dazu erhalten SMCs relativ wenig Beachtung. SMCs sind jedoch eine kritische Zelltyp in den Bau der normalen Arterienwand und vaskuläre Erkrankungen.
Die Aorta ist die größte Kaliber Arterie im Körper, das Herzzeitvolumen aus dem linken Ventrikel des Herzens empfangen. Es wird von vielfältigen menschlichen Krankheiten, einschließlich Arteriosklerose, Aneurysma und Dissektion heimgesucht. Im erwachsenen Organismus sind die Aorta und ihre Hauptzweige in Modellen von Gefäßerkrankungen intensiv untersucht. Zum Beispiel fettreiche Diät gefüttert Mäuse, die für die Codierung der Rezeptor Low density Lipoprotein oder Apolipoprotein E, gen null sind entwickeln Atherosklerose und den letzten Schicksal Mapping Studien zeigen, dass bereits vorhandene SMCs mehrere Zelltypen entstehen die atherosklerotischen Plaque1. In Aortenaneurysmen pathologische Veränderungen gehören SMC Apoptose und extrazelluläre Matrix Umbau2,3.
Während der embryonalen und perinatale ist wesentlich weniger über SMC Morphogenese und Pathogenese bekannt. Hier bieten wir Protokolle für ein Studium embryonaler und perinataler Aorten SMCs in Vivo, in Gewebe Explantaten und in isolierten Zellen. Beispielsweise beschreibt der erste Abschnitt des Protokolls Schicksal Kartierung und klonale Analyse embryonaler Mäuse. Cre-Rekombinase ausgedrückt unter der Kontrolle eines Promotors zellspezifische erleichtert die Kennzeichnung bestimmter Zellen und ihre Nachkommen4,5,6; zeitliche Steuerung der Zelle-spezifische Kennzeichnung kann jedoch während der Embryonalentwicklung bei Mäusen schwierig sein. In diesem Zusammenhang bieten mit Embryonen, die mit dem Ausdruck der bedingten CreER unter Förderer aktiv in SMCs (e.g.,Myh11 oder Acta2) und eine Cre-Reporter wir Methoden zur Injektion von Tamoxifen oder seine aktiven Metaboliten 4-OH-Tamoxifen in schwanger Dämme und für die Analyse von markierten Zellen in Embryonen oder postnatale nachkommen. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu Schicksal Mapping Studien, welche überwiegend nutzen Cre-Reporter mit einem einzigen Reporter-Fluorophor1,7, klonale Analyse deutlich mit Multi-Color-Cre-Reporter verstärkt.
Die zweite und dritte des Protokolls Abschnitten Methoden zur Isolierung und Kultivierung embryonalen Aorten-Explantaten und Aorta SMCs von Neugeborenen, beziehungsweise. Diese Ansätze erlauben die Manipulation der Signalwege, speziell in Aorta Explantaten oder SMCs, und für die Analyse der direkten Effekte pharmakologischer Substanzen. So kann die Rolle bestimmter Gene in das Gewebe von Interesse weit schneller Weise als durch traditionelle genetische Manipulationen an Mäusen gezeigt. Darüber hinaus die isolierte SMC Studien erleichtern die Analyse der Zellwanderung und Adhäsion, technisch begrenzt in Vivo.
Der vierte Protokoll Abschnitt beschreibt schließlich die Platzierung einer subkutanen osmotische Mini-Pumpe mit pharmakologischer Substanzen bei schwangeren (oder nicht-schwangeren) Mäusen geladen. Diese Methode erleichtert die Analyse der Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung verursacht durch Agenten, die kontinuierliche Infusion wegen schnellen Stoffwechsel benötigen. Die Alternative, häufige Injektionen ist nicht praktisch für viele Agenten und sollte vermieden werden, da es erhebliche Beschwerden in der Schwangerschaft Damm führen kann.
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Protocol
alle Maus-Protokolle sind durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Yale University genehmigt.
1. In Vivo embryonalen Schicksal Mapping und klonale Analyse
Hinweis: Wir haben diese Ansätze allgemein verwendet, um die Ursprünge der Zellen und ihrer klonalen Architektur in Entwicklung und Krankheit Modelle bewerten 7 , 8 , 9 , 10.
- Paarung zwischen Mäuse mit einem CreER und Mäuse mit einem Cre-Reporter einrichten.
Hinweis: Eine CreER ist für SMC Kennzeichnung verwendet; Myh11-CreERT2 oder Acta2-CreERT2-Mäuse- 11 ,- 12 wird häufig für diesen Zweck verwendet. Für die Kennzeichnung von embryonalen Gewebe im großen und ganzen haben wir ROSA26R-CreERT2 Mäuse 13 eingesetzt.- Zur klonalen Analyse verwenden eine mehrfarbige Cre Reporter (z. B. Konfetti oder Rainbow [Rb] Mäuse) 8 , 14 , 15 und für das Schicksal Mapping, eine einfarbige Cre Reporter (z. B. ROSA26R-YFP Mäuse 16) oder der Doppel-Farbe Cre Reporter ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Hinweis: Diese Zucht-Schema verwendet erwachsener Mäuse, das sind 2-6 Monate alt (in der Regel ca. 30 g) und generiert Embryonen mit einer CreER und Cre Reporter.
- Zur klonalen Analyse verwenden eine mehrfarbige Cre Reporter (z. B. Konfetti oder Rainbow [Rb] Mäuse) 8 , 14 , 15 und für das Schicksal Mapping, eine einfarbige Cre Reporter (z. B. ROSA26R-YFP Mäuse 16) oder der Doppel-Farbe Cre Reporter ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Check für vaginalen Stecker am Morgen mit einem metallischen probe und, mittags am Tag der Stecker Erkennung als embryonale Tag (E) 0,5 prüfen.
- Das Männchen das Weibchen trennen, wenn ein Stecker erkannt wird.
- Vorbereitung 4-OH-Tamoxifen und Tamoxifen funktionierende Lösungen.
- Für 4-OH-Tamoxifen, 5 mg in 50 µL 100 % Ethanol, Wirbel für 2 min auflösen und fügen Sie dann 450 µL Maisöl. Beschallen Sie auf dem Eis am Pegel 2 für 10 s-Zyklen mit Ruhe zwischen den Zyklen bis Probe hat abgekühlt. Nach der Probe vollständig aufgelöst ist (in der Regel ~ 4-5 Zyklen der Beschallung), 200 µL beschallten Lösung nehmen und lösen sich in 1.800 µL Maisöl, letzte funktionierende Lösung (4-OH-Tamoxifen, 1 mg/mL) zu machen.
- Für Tamoxifen, bis 50 mg/mL in 100 % Ethanol und Wirbel zu verdünnen, bis sie aufgelöst ist. Verdünnte in Maiskeimöl, um die letzte funktionierende Lösung (Tamoxifen, 10 mg/mL) und rühren bei 45 ° C um sicherzustellen, dass es vollständig aufgelöst ist.
- Für die frühen embryonalen Induktion 4-OH-Tamoxifen intraperitoneal in eine schwangere dam injizieren.
- Verwenden 4-OH-Tamoxifen Injektionen (bis zu ~ 150 µg pro schwangere Maus oder etwa 5 mg/kg Körpergewicht) bei E5.5 und danach wie sie tragfähige dam, Embryonen und Welpen ergeben.
- Gebrauch Tamoxifen bei Dosen von 0,5 - 1,5 mg (oder 17-50 mg/kg) für Dämme mit Embryonen im schwanger ~ E9 und danach. 30G Nadeln für alle Injektionen verwenden.
Hinweis: Filtration durch einen 0,22 µm-Filter wird normalerweise verwendet, um alle Mischungen vor der Injektion zu sterilisieren.
- Zur klonalen Analyse verwenden intraperitoneale Injektion von hohen Dosen von 4-OH-Tamoxifen (z. B. 5 mg/kg) oder Tamoxifen (z. B. 50 mg/kg), mehrere Zellen zu markieren.
- , Einzelne Zellen zu markieren, unten die 4-OH-Tamoxifen oder Tamoxifen-Dosis titrieren, so dass im Gewebe von Interesse (d. h. der Aorta), fast alle Embryonen analysiert (wie unten am Ende dieses Abschnitts beschrieben) haben entweder keine Zellen beschriftet oder nur einer einzelnen Farbe; Dies ist die Schwellendosis.
- , Markieren Sie Zellen in der Mitte Ende gestational Periode und deren Schicksal oder Infektionsstaus in der postnatalen Maus verfolgen injizieren Progesteron in intraperitoneale Hohlraum des Stausees schwanger begleitend mit Tamoxifen in einer 1:2 (Progesteron: Tamoxifen) Dosis Verhältnis.
Hinweis: Tamoxifen Dosen sind 17-50 mg/kg und Progesteron Dosen sind 8,5-25 mg/kg (d. h. die Hälfte der Tamoxifen-Dosen). Die Progesteron-Injektion kann Arbeit ~ 1-2 Tage verzögern. - Einschläfern getränkt mit unverdünntem Isofluran Stausees schwanger mit Embryonen einer gewünschten Zeit mit einer offenen Drop-Methode, wo der Damm in ein Gefäß mit Baumwolle oder Gaze gesetzt. Tod zu bestätigen, durch die Eröffnung der Brusthöhle Pneumothorax zu induzieren, durch das Entfernen der lebenswichtigen Organe und/oder durch zervikale Dislokation ausführen.
- Reinigen den Bauch mit 70 % Ethanol. Mit einer Schere aufschneiden des Bauches und sezieren, die Gebärmutter. Die Embryonen aus der Gebärmutter zu entfernen und die Embryonen aus der Plazenta und der Dottersack mit Pinzette sorgfältig zu trennen.
- Einschläfern die Embryonen bei E15 oder ältere durch zervikale Dislokation oder Enthauptung mit einer chirurgischen Schere oder einer scharfen Klinge durchführen.
Hinweis: Jünger als E15 Embryonen sterben schnell nach Euthanasie der Mutter und/oder die Entfernung der Embryonen von Mutter. - Die Embryonen in eiskaltem PBS und schneiden Sie ein kleines Stück Schwanz mit einer Schere zu Genotyp für die CreER und Cre Reporter.
- Fixieren den Embryonen in 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 2 h waschen die Embryonen dreimal mit PBS-Puffer und inkubieren Sie die Embryonen in 30 % Saccharose in PBS in 15 mL Tuben, warten, bis sie sinken, was bis zu zwei Tage dauern kann.
- Füllung Kunststoff Einfrieren Formen bis zu 2/3 der Höchstgehalt mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung. Stellen Sie jedem Embryo senkrecht in der Form vollständig untergetaucht im Okt. Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur (RT), Bläschen zu minimieren.
- Ort Einfrieren Gewebe Blöcke aufrecht in einer Trockeneis, 70 % Ethanol Bad zu frieren. Die Blöcke bei-80 ° c
- Kryostaten Temperatur bis-22 ° C einstellen und schneiden Sie Blöcke, um Querschnitte durch die gesamte Aorta, 10-20 µm Dicke erzeugen. Trocknen Sie die Folien bei RT für 30 min vor der Aufbewahrung bei-80 ° c
- Tauen die Folien bei RT, geschützt vor Licht, um zu vermeiden, das Bleichen von Fluorophore. Waschen Sie die Folien mit PBS-Tween20 0,1 %.
- Zur klonalen Analyse, färben die Folien für Kerne (DAPI, 5 mg/mL) und direkt Bild andere Fluorophore in der Rainbow Cre-Reporter (himmelblauen: 433-nm Anregung max, 475 nm Emission max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Verwendung der folgenden Filter zur Erkennung von Fluorophore mit einem aufrechten fluoreszierende Mikroskop: DAPI (Erregung Max/Bandbreite 350/50 nm, Emission Max/Bandbreite 460/50 nm), Himmelblau (Erregung 436/20 nm, Emission 480/40 nm), Texas rot (Erregung 560 / 40 nm, Emission 630/75 nm) und benutzerdefinierte Filter, mCherry von mOrange (Erregung 577/10 nm, Emission 630/50 nm) zu trennen.
- Für Schicksal-Mapping mit dem mTmG Cre Reporter erkennen GFP (484 nm, 510 nm), entweder durch bildgebende direkt oder mithilfe von Immunostaining. Für die Bildgebung mit einem aufrechten fluoreszierende Mikroskop verwenden einen GLP-Filter (Erregung 470/40 nm, Emission 525/50 nm).
- Für Immunostaining, Abschnitte mit primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren, waschen mit 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer und dann mit Sekundärantikörper für 1 h Nutzung Anti-CD31 inkubieren (Endkonzentration 0,0016 mg/mL), Anti-GLP (0,006 mg/mL) und Cy3-direkt konjugierten Anti-SMA (1: 500 Endverdünnung) Primärantikörper und Verwendung sekundärer Antibodies direkt zu Fluorophore (1: 500 Endverdünnung) (siehe Tabelle der Materialien) konjugiert.
- Zur klonalen Analyse, färben die Folien für Kerne (DAPI, 5 mg/mL) und direkt Bild andere Fluorophore in der Rainbow Cre-Reporter (himmelblauen: 433-nm Anregung max, 475 nm Emission max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Image-Folien mit einem aufrechten fluoreszierende Mikroskop (Vergrößerung: 4 X - 20 X) oder confocal Mikroskop (10 X-63 X). Für hohe Vergrößerung verwenden ein confocal imaging 63 x Öl-Ziel mit einer numerischen Apertur von 1,4-0,6 und ein Frame-Größe von 1.024 x 1.024 Pixel.
2. Explant embryonalen Aorta Kultur
Hinweis: dieser Ansatz war früher die Rolle der Integrin beta3 im Stenose der der explantierten bewerten Eln (- / -) embryonalen Aorta 9 , 18.
- einschläfern einen zeitlich-schwanger Damm am E15.5 durch überschüssige Isofluran Inhalation gemäß Schritt 1,8, oben.
- Ernte und die Embryonen nach Schritte 1,9-1.10, oben einschläfern.
- Den Embryo supinely positionieren und fixieren die erweiterten Gliedmaßen die Dissektion gegenüber. Mit einer Dissektion Stereoskop visualisieren Sie und mit einer Schere schneiden Sie einen vertikalen Schnitt aus dem Bauch durch das Brustbein zu den oberen Brustkorb. Sezieren entfernt den Thymus, Luftröhre, Lunge, Speiseröhre, Leber und Darm.
- Sanft ziehen das Herz ventral mit Pinzette und Schere verwenden, um die Aorta von der dorsalen Aspekt der thorakalen und abdominalen Hohlräume zu sezieren. Zum Lösen der Aorta schneiden proximalen und distalen Abdominal-Positionen.
- Legen die Aorta in eiskalten sterile PBS in einer Zelle Kultur Kapuze. Die Aorta auf einer 24-Well-Platte übertragen und Kultur es in DMEM mit 0,5 % FBS für bis zu 24 h bei 37 ° c
Hinweis: Das Kulturmedium kann durch eine blockierende Antikörper (z. B. Anti-Integrin αvβ3 Antikörper bei 0,02 mg/mL 9; vgl. die Tabelle der Materialien) oder eine pharmakologische Mittel ergänzt werden. - Die Aorta zweimal mit PBS waschen und dann fix it mit 4 % Paraformaldehyd für 20 min.
- Waschen dreimal mit PBS und Übertragung der Aorta auf eine 1,5-mL-Tube mit 30 % Saccharose in PBS. Nachdem die Aorta sinkt, stellen gefrorenes Gewebe Blöcke, Zuschnitte und Immunostain, oben beschriebenen Schritten 1.13-1,15.
3. SMC-Isolation aus der perinatalen Aorta
Hinweis: dieser Ansatz dient derzeit zur Biologie der Aorta SMCs von Eln (- / -) und Wildtyp perinatale Mäusen isoliert vergleichen.
- Einschläfern ein Murine pup auf postnatale Tag (P) 0,5, entweder durch zervikale Dislokation oder durch Enthauptung mit einer chirurgischen Schere oder einer scharfen Klinge, wie in Schritt 1.10, beschrieben oben.
- Führen Sie Schritt 2.3 und dann, nach der Eröffnung des Thorax und Abdomen, Punktion linke Herzkammer mit 23G Nadel. Verwendung Kunststoffschlauch Verbindung die Nadel zu sterile Spritze PBS-haltigen senkrecht gehalten an einer erhöhten Position, so dass PBS in die linke Herzkammer durch die Schwerkraft fließt. Infusion von sterilen PBS in linken Ventrikel zu ermöglichen, bis die Leber blanches.
- Zange verwenden, um entfernen adventitial Gewebe auf der Außenseite der Aorta und die Aorta zu sezieren, wie unter Punkt 2.4 beschrieben.
- Die Aorta in einer einzigen Lösung von DMEM zu verdauen (500 µL) ergänzt mit 225 U/mL Kollagenase, 2,25 U/mL Elastase und 1 X Antibiotikum Antimykotikums für 45 min bei 37 ° C. manuell schütteln dem Rohr alle 5-10 min.
- In der sterilen Zelle Kultur Haube, Titurate das verdaute Gewebe durch Pipettieren oben und unten mit einer 200-µL Pipette eine einzellige Aussetzung zu generieren. Single-Zellsuspension auf eine 15-mL-Tube übertragen, fügen Sie 2 mL DMEM und Zentrifugieren bei 920 X g für 5 min bei 25 ° c
- Verwerfen den überstand. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL Kulturmedium SMC (DMEM mit 10 % FBS mit 2,5 µg/mL Amphotericin B, 1 µg/mL RhFGF, 10 µg/mL RhEGF und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin ergänzt). Übertragen auf einen 35-mm-Kultur Teller.
Hinweis: Bei der ersten Isolierung werden ~ 400.000 Zellen aus einem einzigen P0.5 Wildtyp Aorta erreicht; ~ 300.000 dieser Zellen sind SMCs. - Kulturzellen bei 37 ° C und alle 3 Tage frische SMC Kulturmedium ändern. Mit standard-Techniken mit Trypsin, Durchgang der Zellen als konfluierende. Für Experimente, benutzen Zellen aus Passagen 3-7.
4. Subkutane osmotische Mini-Pumpe Platzierung in schwanger (oder nicht-Schwangere) Mäuse
Hinweis: dieser Ansatz wurde früher verwendet, um kontinuierlich einen pharmakologischen Agenten (z. B. Integrin β3 und β5 Hemmer liefern Cilengitide) Embryonen in der Gebärmutter 9. Die Pumpe wurde eingefügt in die schwangere Damm am E13.5 und behielt bis Geburt.
- Betäuben die Mäuse mit 2-5 % Isofluran in Sauerstoff (Durchfluss von 1 L/min) für Induktion und 1-3 % für Wartung. Verwenden des Zehe-Prise Reflexes, um das Niveau der Narkose zu überwachen, und das Anästhetikum nach Bedarf anpassen. Verwalten von subkutanen Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) für Analgesie.
- Rasieren des unteren Rückens mit Klipper. Sterilen Tüchern, Handschuhe und Instrumente verwenden und die Mäuse auf eine chirurgische Heizplatte während der Operation zu erhalten.
- Jede Maus in Bauchlage und schrubben den Rücken mit Betadine gefolgt von Isopropylalkohol. Ca. 3-5 cm rostral an der Schwanzwurzel in den unteren Rücken ein Skalpell verwenden, um eine horizontale Hautinzision 0,5 - 1,0 cm Länge ohne Verletzung der darunter liegenden Muskeln machen.
- Der Schnitt einer Gefäßklemme einfügen und erstellen eine subkutane Tasche Rostral zur Implantation der Pumpe durch öffnen und Schließen der Gefäßklemme Kiefer.
- Füllen eine osmotische Mini-Pumpe mit das Mittel der Wahl, nach der Hersteller ' s-Richtlinien (siehe die Tabelle der Materialien). Legen Sie die gefüllte Pumpe in der Tasche und schließen Sie den Schnitt mit Clips oder 6-0 nicht resorbierbare Nähte. Sicherzustellen, dass die gesamte chirurgische Zeit weniger als 10 min.
- Überwachen postoperativ, die Mäuse alle 15 min, bis sie von sternalen liegen erholt haben. Verwalten Sie subkutane Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) alle 6-12 Std. für 48 h. Wenn die Mäuse Vollnarkose vollständig erholt haben, überwachen sie täglich. Entfernen Sie die Clips oder Nähte 7-10 Tage nach der Operation.
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Representative Results
In einer repräsentativen klonalen Analyse von SMCs Embryonen Mutant für Eln (das Gen Kodierung der extrazellulären Matrix Protein Elastin) Eln(+/-), Acta2-CreERT2 Mäuse waren verbunden mit Eln(+/-) Mäuse auch die Durchführung der Multi-Color ROSA26R(Rb/Rb) Reporter. Wie in Schritt 1 beschrieben, Stecker wurden überprüft, schwanger Dämme wurden mit einer einzigen Tamoxifen-Injektion (1,5 mg) bei E12.5 induziert, und sie wurden bei E18.5 geopfert. Embryonen wurden geerntet, feste, gefrorene und genotypisiert. Absteigende Aorta Cryosections quer geschnitten wurden. Abschnitte von Eln(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) Embryonen zeigen, dass die überschüssige Innenlage SMCs, die im Eln ansammeln-null Mäuse (ab E15.5) zeichnen sich durch mehrere Farben () Abbildung 1) und daher stammen aus mehreren Actin in Alpha-glatte Muskulatur (SMA)+ Zellen, die anwesend sind ~ E12.5. In der Aorta E12.5 sind SMA+ Zellen beschränkt sich auf die Tunica Media.
Um Eln(- / -) embryonale Hauptschlagadern Explantaten, männlich und weiblich zu generieren wurden Eln(+/-) Mäuse gedeckt. Mit Methoden, die in Schritt 2 beschriebenen Stecker wurden überprüft und schwanger Eln(+/-) Dämme am E15.5 geopfert wurden. Die Hauptschlagadern wurden von Eln(- / -) Embryonen isoliert und kultiviert für 0 oder 18 h in Anwesenheit einer Anti-Integrin β3 blockieren Antikörper oder ein IgG1-Steuerelement. Hauptschlagadern wurden dann behoben, gefroren, und Cryosectioned und Cryosections waren voller Flecken für SMA (SMC-Marker), CD31 (Endothelzellen Marker) und Kerne (DAPI) (Abbildung 2). Die Ergebnisse zeigen, dass innerhalb von 18 Stunden der Kultivierung die E15.5/Eln(- / -) Aorta Hypermuscular wird und stenosiert. Dieser Prozess wird von einem Anti-Integrin β3 blockierende Antikörper abgeschwächt.
SMCs wurden isoliert aus der Aorta von Wildtyp-Mäusen im P0.5. Wie in Schritt 3 beschrieben, SMCs waren von der seziert neonatale Aorta durch Enzym Verdauung isoliert und kultiviert. Zellen passagiert wurden, und Passage 3 Zellen waren für SMC-Marker (z.B. SMA, Smooth Muscle Myosin schwere Kette (SMMHC) oder Transgelin (auch bekannt als SM22α)), befleckt, CD31 und Kerne (DAPI) (Abbildung 3). Die meisten der kultivierten Zellen Ausdruck SMC Marker aber nicht CD31.
Um zu beurteilen infundiert ob pharmakologische Hemmung der Integrin β3 Hypermuscularization und Stenose des Eln(- / -) Aorta in Vivo, wir kontinuierlich vermindern kann Hemmer Cilengitide aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit im Plasma. Eln(+ / −) Männchen und Weibchen verpaart wurden, und wie in Schritt 4 beschrieben, osmotische Mini-Pumpen mit Cilengitide geladen waren in schwanger Dämme am E13.5 implantiert. Zu P0.5 Welpen waren euthanasierten und genotypisiert und ihre Hauptschlagadern wurden analysiert. Cilengitide Behandlung dämpft deutlich Aortenstenose und Hypermuscularization Eln(- / -) Mäusen (Abbildung 4) unbeschadet der Wildtyp-Aorta-9. Somit ist Anti-Integrin β3 ein potenziell vielversprechender nicht-invasive Ansatz zur Behandlung von Elastin Aortopathy.
Abbildung 1 . Überschüssige SMCs in der Eln(- / -) Aorta entspringen mehrere bereits vorhandene SMCs. Dämme mit Eln(- / -), Acta2-CreERT2 Embryonen auch die Durchführung der mehrfarbigen Cre-Reporters schwanger ROSA26R(Rb / +) wurden mit einer einzigen intraperitoneale Injektion von Tamoxifen (1,5 mg) bei E12.5 induziert. Dämme wurden geopfert, um E18.5 und Querschnitte der absteigenden Hauptschlagadern der Embryonen wurden analysiert, mit DAPI und die direkte Fluoreszenz des Rb Farben beflecken Cerulean (Cer), mCherry (mCh) und mOrange (mOr). Überschüssige SMCs reichern sich in der innere Aspekt der Eln-null Aorta nach E15.518. Die überschüssige Inner-Layer SMCs gehört auch Zellen aus mehreren Farben (Sternchen), Polyclonality. Lu, Aorten-Lumen. Maßstabsleiste, 10 µm. Abdruck von Misra Et Al., 20169. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Anti-αvβ3 Integrin Blockade dämpft, Hypermuscularization und Stenose der Eln(- / -) Aorta Explant. E15.5 schwanger Dämme wurden eingeschläfert und die Hauptschlagadern des Eln(- / -) Embryonen wurden geerntet. Isolierte Hauptschlagadern wurden sofort behoben oder in Anwesenheit eines Isotype-Steuerelements IgG1 oder einem Integrin αvβ3 blockierende Antikörper für 18 h vor der Fixierung kultiviert. Feste Hauptschlagadern wurden für CD31, SMA und Kerne (DAPI) gefärbt. Lu, Aorten-Lumen. Maßstabsleiste, 100 µm. Abdruck von Misra Et Al., 20169. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Isoliert und kultiviert Aorten SMCs von neugeborenen Mäusen ausdrückliche Glattmuskel Markern. SMCs waren von P0.5 Welpen isoliert und kultiviert. Zellen von den dritten Durchgang wurden behoben und gebeizt für CD31 (EG-Marker), Kerne (DAPI) und ein SMC-Marker (SMA, SM22α oder SMMHC, wie angegeben). Diese Analyse zeigt, dass ca. 90 % der kultivierten Zellen SMC Marker ausdrücken, und keiner beobachtet CD31 zum Ausdruck bringen. Skala bar, 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Kontinuierliche Infusion von Cilengitide In Vivo dämpft Eln(- / -) Aorta Hypermuscularization und Stenose. Männliche und weibliche Eln(+/-) Mäuse wurden gekreuzt. Das Integrin β3-Hemmer Cilengitide oder das Fahrzeug (PBS) wurde in schwanger Dämme mit osmotischen Mini-Pumpen ab E13.5 kontinuierlich infundiert. Querschnitte an P0.5 wurden für SMA (rot), CD31 (weiß) und Kerne (DAPI, blau) gefärbt. Lu, Aorten-Lumen. Maßstabsleiste, 100 µm. klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Im Gegensatz zu den umfangreichen Untersuchungen der murinen Aorta und ihrer großen Niederlassungen in Erwachsenen pathologischen Zuständen, wie z. B. Modelle von Arteriosklerose ist weniger bekannt, bezüglich der Morphogenese und der Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta. Hier setzen wir auf die embryonale/perinatale Aorta, speziell die SMCs und bieten Protokolle zur Untersuchung der Aorta durch in-Vivo, Gewebe Explant und SMC Isolierung nähert. Diese kostenlosen Ansätze bieten die Ermittler mit unterschiedlicher Ansätze, die embryonale/perinatale Aorta zu studieren.
Klonale Analyse ist ein sehr leistungsfähiges Ansatz, der es erlaubt, das Verhalten einzelner Zellen zu untersuchen. Wir haben vor kurzem diesen Ansatz verwendet, zur Identifizierung von spezialisierten SMCs in den Lungen Vasculature10. Es ist wichtig zu erkennen, dass in einer einzelnen Maus trägt einen Multi-Color-Cre-Reporter, gibt es eine Chance, die Zellen der gleichen Farbe von mehr als einem Rekombination Ereignis abgeleitet werden könnte. Somit erfordert klonalen Analyse mit einem Multi-Color-Reporter die Auswertung der zahlreichen Mäuse. Da Tamoxifen in der Mitte Ende gestational Periode Entbindung für Experimente stören kann, die Zellen zu markieren, in der Mitte Ende gestational Periode und postnatal zu verfolgen, sollte Progesteron und Tamoxifen damit auch injiziert werden. Ähnlich wie bei Protokolle im Embryo, Schicksal Kartierung und klonale Analyse von Zellen bei der erwachsenen Maus kann mit der intraperitonealen Injektion von Tamoxifen bei Erwachsenen durchgeführt werden.
Klonale Analyse und Schicksal Mapping von SMCs verwendet Mäuse tragen transgene mit dem Ausdruck der Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von Promotoren mit verstärkten Aktivitäten in der glatten Muskulatur. Hier beschreiben wir Protokolle, die mit Hilfe von Mäusen mit bedingten transgene Myh11 CreERT2 oder Acta2-CreERT2. Myh11 ist die spezifischste Markierung von SMCs19; Es ist jedoch herunterreguliert im Eln(- / -) Aorta9. Acta2 drückt sich in SMCs, einschließlich derjenigen der Eln-null Aorta, aber es ist nicht so genau, weil es auch in anderen Zelltypen zum Ausdruck kommt. Wenn diese bedingte transgene "undichte" wurden (d. h. induzieren Rekombination in der Abwesenheit von Tamoxifen), es könnte problematisch sein, da die Experimente nicht den Zeitpunkt der Zelle Markierung abgrenzen würde. Die Undichtigkeit von dieser transgenen wurde analysiert, bewertet Beta-Galaktosidase Aktivität bei Mäusen mit einem LacZ-basierte Cre Reporter und entweder Myh11 CreERT2 oder Acta2-CreERT2 nach Fahrzeug-Behandlung ( d. h., in Ermangelung von Tamoxifen Induktion)11,12. Basierend auf dieser Analyse, diese transgene nicht tropfenden galten.
Hypermuscularization kennzeichnet mehrere vaskuläre Erkrankungen beim Menschen. Supravalvular Aortenstenose (SVAS) ist zum Beispiel eine verheerende Geburtsgebrechen, die gekennzeichnet ist durch das Hindernis der großen und mittleren Arterien durch überschüssige SMCs. SVAS-Ergebnisse aus dem Verlust der Funktion von einem Allel des Gens ELN und tritt als eine isolierte Entität oder, häufig, im Rahmen des Williams-Beuren-Syndrom20,21,22,23,24. ELN(- / -) mutierte Mäuse Phenocopy viele Aspekte der Aorta Phänotyp SVAS18,21,22. Aorta Explantaten aus Eln(- / -) Embryonen werden schnell während Kultur, verschlossen, während Explantaten aus Wildtyp-Embryonen patent9,18bleiben. Die Aorta modellabhängigen Ansatz erleichtert Screening für Agents, die Stenose in Elastin Aortopathy9zu vermindern. Jedoch wird dieser Ansatz nicht die mechanische oder physikalische Kräfte berücksichtigt, denen die Aorta, während im Körper ist. Daher sollten positive Treffer in Aorta Explant Screening mit in-vivo Eln mutierte Maus-Modellen bewertet werden.
Das SMC-Isolierung-Protokoll ist eine schnelle und robuste Methode, um die perinatale murinen Aorta SMCs einzuholen. Ein ähnlicher Ansatz kann extrapoliert werden, um SMCs von Erwachsenen Mäusen zu isolieren. Wegen seiner relativ große Größe die Erwachsenen Aorta längs geöffnet werden kann und die Adventitia und Endothelzellen seziert entfernt. Um die Reinheit der Zellen isoliert aus der Aorta perinatale oder Erwachsenen zu bewerten, ist es wichtig, für den Ausdruck der SMC-Marker (z. B. SMMHC, Smoothelin, SM22α und SMA) und das Fehlen des Ausdrucks der Endothelzellen Marker (z. B. überprüfen CD31 und vaskulären endothelialen Cadherin). Eine mögliche alternative Isolierung Ansatz Durchflusszytometrie Eindringmittel isolieren soll beschriftet SMCs aus der seziert Aorta. Mäuse mit einem fluoreszierenden Cre-Reporter und Myh11 CreERT2, Acta2-CreERT2oder Tgln-Cre können verwendet werden, um Eindringmittel SMCs11,12,25bezeichnen, 26,27. Alternativ kann die vorhandene transgene Mäuse mit dem SMA-Promotor, den Ausdruck von einem Fluorophore (z. B. GFP, mCherry oder RFP) fahren gebrauchte28,29,30.
Implantierte osmotische Mini-Pumpen werden verwendet, um die kontinuierliche Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen Versuchstiere zu bieten. Wir haben Mini-Pumpen bei schwangeren Mäusen bei E13.5 Agenten liefern für die Entwicklung der Embryonen während der Rest der gestational Periode9implantiert. Um die Embryonen zu erreichen, müssen solche Mittel die Blut-Plazenta-Schranke passieren können. Im Allgemeinen, Mini-Pumpen sind sehr gut verträglich, und angesichts der niedrigen Rate von Infektion, routinemäßig Antibiotika sind nicht zu empfehlen. Wunde Dehiszenz ist selten; jedoch wenn eine Dehiszenz größer als 4 mm erkannt wird, sollte die Maus erneut betäubt und die Wunde gereinigt und wieder mit einer chirurgischen Naht verschlossen.
Diese Arbeit beschreibt ein Arsenal von Ansätzen, die verwendet werden können, um die normale Bildung der embryonalen und perinatale aortalen Wand während der Entwicklung, als auch nach Störungen in diesem Prozess während der Krankheit zu studieren. Darüber hinaus können diese Protokolle angewendet werden, um die Wartung und die Krankheit der Erwachsenen Aorta zu studieren. Ansätze können andere Blutgefäße sowie Glattmuskel-beschichtete nicht-vaskulären Strukturen, wie den Magen-Darm-Trakt oder die Lunge Atemwege extrapoliert werden. Zu guter Letzt können ähnliche Techniken verwendet werden, Zelltypen jenseits SMCs, wie Endothelzellen und Fibroblasten sowie das Zusammenspiel zwischen diesen Zellen und SMCs zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken für die gemeinsame Nutzung seiner Laborprotokoll für Aorten-SMC Isolierung Dean Li. Unterstützung wurde gefördert durch die National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 und R01HL133016, D.M.G), der American Heart Association (Beihilfe 14GRNT19990019, DMG) und der Yale University (Brown-Coxe Fellowship, Uhr und Start Fonds, DMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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