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Developmental Biology

Morphogenesis और भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए Vivo और ऊतक और सेल Explant दृष्टिकोण में का उपयोग करना

Published: September 12, 2017 doi: 10.3791/56039
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Summary

vivo क्लोनल विश्लेषण और भाग्य मानचित्रण, महाधमनी explants, और पृथक चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में उपयोग कर भ्रूण और प्रसवकालीन murine महाधमनी का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल यहां विस्तृत रहे हैं । ये विविध दृष्टिकोण सामान्य विकास में भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी के morphogenesis की जांच की सुविधा और रोग में रोगजनन.

Abstract

महाधमनी शरीर में सबसे बड़ी धमनी है । महाधमनी दीवार endothelial कोशिकाओं की एक भीतरी परत, लोचदार lamellae और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs) बारी की एक मध्यम परत, और fibroblasts और extracellular मैट्रिक्स की एक बाहरी परत से बना है । वयस्क महाधमनी में रोग मॉडल (जैसे, atherosclerosis) के व्यापक अध्ययन के विपरीत, बहुत कम भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी के बारे में जाना जाता है । यहां, हम SMCs पर ध्यान केंद्रित करने और सामांय विकास और रोग में भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी SMCs के morphogenesis और रोगजनन के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, चार प्रोटोकॉल शामिल हैं: i) vivo भ्रूण भाग्य मानचित्रण और क्लोनल विश्लेषण में ; ii) explant भ्रूण महाधमनी संस्कृति; iii) प्रसवकालीन महाधमनी से एसएमसी अलगाव; और iv) चमड़े के नीचे परासरणी मिनी-गर्भवती (या गैर-गर्भवती) चूहों में पंप प्लेसमेंट । इस प्रकार, इन तरीकों के मूल (ओं) की जांच की सुविधा, भाग्य, और SMCs के क्लोनल वास्तुकला में महाधमनी में vivo। वे औषधीय एजेंटों के लिए सतत जोखिम से utero में भ्रूण महाधमनी morphogenesis के नियमन के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, पृथक महाधमनी ऊतक explants या महाधमनी SMCs जैसे muscularization, प्रसार, और प्रवास के रूप में मौलिक प्रक्रियाओं के दौरान विशिष्ट जीन लक्ष्यों की भूमिका में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन परिकल्पना-अलग SMCs और explanted महाधमनी पर प्रयोगों पैदा कर सकते है तो vivo में संदर्भ में औषधीय और आनुवंशिक दृष्टिकोण के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है ।

Introduction

कोशिकीय जीवों के संचार प्रणालियों कोशिकाओं है कि बाहरी वातावरण के साथ संपर्क में नहीं है और इन कोशिकाओं से अपशिष्ट उत्पादों और कार्बन डाइऑक्साइड को दूर करने के लिए पोषक तत्वों और ऑक्सीजन देने के लिए कार्य करते हैं । रीढ़ में, प्राथमिक संचार प्रणाली दिल है, जो रक्त वाहिकाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से रक्त पंप के होते हैं । बड़ी रक्त वाहिकाओं की दीवारों, इस तरह के धमनियों और नसों के रूप में, तीन परतों से मिलकर बनता है: i) intima, या endothelial कोशिकाओं की भीतरी परत; ii) मीडिया, या मध्यम परत की बारी circumferentially लम्बी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं SMCs और लोचदार lamellae; और iii) adventitia, या संयोजी ऊतक और fibroblasts की बाहरी परत । endothelial कोशिकाओं पर संवहनी जीवविज्ञान ध्यान में अध्ययन के विशाल बहुमत, नए endothelial सेल के गठन की जांच angiogenesis के माध्यम से ट्यूब लाइन में खड़ा । इसकी तुलना में, SMCs अपेक्षाकृत कम ध्यान प्राप्त करते हैं । हालांकि, SMCs सामान्य धमनी दीवार के निर्माण में और संवहनी विकृतियों में एक महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार हैं ।

महाधमनी दिल के बाईं निलय से हृदय उत्पादन प्राप्त करने, शरीर में सबसे बड़ा कैलिबर धमनी है । यह atherosclerosis, धमनीविस्फार, और विच्छेदन सहित विविध मानव रोगों से पीड़ित है । वयस्क जीवों में, महाधमनी और इसकी प्रमुख शाखाओं में संवहनी रोग के मॉडलों में तीव्रता से अध्ययन किया जाता है । उदाहरण के लिए, उच्च वसा वाले आहार चूहों कि कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर या apolipoprotein ई एंकोडिंग जीन के लिए नल हैं, atherosclerosis विकसित करने, और हाल ही में भाग्य मानचित्रण अध्ययन संकेत मिलता है कि पूर्व मौजूदा SMCs में कई प्रकार के सेल को जंम दे atherosclerotic पट्टिका1. महाधमनी aneurysms में, रोग परिवर्तन एसएमसी apoptosis और extracellular मैट्रिक्स remodeling2,3शामिल हैं ।

काफी कम भ्रूण और प्रसवकालीन अवधि के दौरान एसएमसी morphogenesis और रोगजनन के बारे में जाना जाता है । यहाँ, हम vivo मेंभ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी SMCs का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, ऊतक explants में और अलग कोशिकाओं में. उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल के पहले खंड रूपरेखा भाग्य मानचित्रण और भ्रूण चूहों में क्लोनल विश्लेषण । Cre recombinase एक कोशिका विशेष प्रवर्तक के नियंत्रण में व्यक्त विशिष्ट कोशिकाओं और उनकी संतान के अंकन की सुविधा4,5,6; हालांकि, सेल विशेष लेबलिंग के अस्थाई नियंत्रण चूहों में भ्रूण के विकास के दौरान चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस संदर्भ में, SMCs में सक्रिय एक प्रवर्तक के तहत सशर्त CreER व्यक्त भ्रूण के साथ (जैसे, Myh11 या Acta2) और एक Cre रिपोर्टर, हम tamoxifen या उसके सक्रिय metabolite इंजेक्शन के लिए तरीके प्रदान करते हैं 4-OH-tamoxifen गर्भवती बांधों में और भ्रूण या प्रसव वंश में लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए । इसके अलावा, भाग्य मानचित्रण अध्ययन है, जो predominately एक रिपोर्टर fluorophore के साथ Cre संवाददाताओं का उपयोग करने के विपरीत में1,7, क्लोनल विश्लेषण काफी बहु रंग Cre पत्रकारों के साथ बढ़ाया है ।

प्रोटोकॉल के दूसरे और तीसरे वर्गों अलग और संवर्धन भ्रूण महाधमनी explants और SMCs से महाधमनी नवजात, क्रमशः के लिए तरीकों का वर्णन । इन तरीकों संकेतन रास्ते के हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, विशेष रूप से महाधमनी explants या SMCs में, और औषधीय एजेंटों के प्रत्यक्ष प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए । इस प्रकार, ब्याज के ऊतकों में विशिष्ट जीन की भूमिका चूहों में पारंपरिक आनुवंशिक जोड़तोड़ के माध्यम से कहीं अधिक तेजी से फैशन में दिखलाई जा सकता है । इसके अलावा, पृथक एसएमसी अध्ययन सेल प्रवासन और आसंजन, जो vivo मेंतकनीकी रूप से सीमित कर रहे है के विश्लेषण की सुविधा ।

अंत में, चौथा प्रोटोकॉल अनुभाग एक चमड़े के नीचे परासरणी मिनी-गर्भवती (या गैर गर्भवती) चूहों में औषधीय एजेंटों के साथ भरी हुई पंप के स्थान रूपरेखा । इस विधि क्योंकि तेजी से चयापचय की सतत अर्क की आवश्यकता होती है कि एजेंटों की वजह से भ्रूण विकास पर प्रभाव के विश्लेषण की सुविधा । अक्सर इंजेक्शन के वैकल्पिक कई एजेंटों के लिए व्यावहारिक नहीं है और बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह गर्भवती बांध में महत्वपूर्ण असुविधा का कारण हो सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सभी माउस प्रोटोकॉल येल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।

< p class = "jove_title" > 1. in Vivo भ्रूण किस्मत मानचित्रण और क्लोनल विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: हम इन दृष्टिकोणों का उपयोग किया है व्यापक रूप से कोशिकाओं के मूल का मूल्यांकन करने के लिए और उनके विकास और रोग मॉडल में क्लोनिंग वास्तुकला < सुप वर्ग = "xref" > ७ , < सुप वर्ग = "xref" > ८ , < सुप वर्ग = "xref" > ९ , < सुप वर्ग = "xref" > १० .

  1. एक CreER रिपोर्टर के साथ चूहों और चूहों के बीच सहवास सेट अप Cre.
    नोट: एक CreER एसएमसी अंकन के लिए प्रयोग किया जाता है; Myh11-CreERT2 or Acta2-CreERT2 चूहों < सुप class = "xref" > 11 , < सुप class = "xref" > 12 का प्रयोग सामान्यतः इस प्रयोजन के लिए किया जाता है । हमने ROSA26R-CreERT2 चूहों का उपयोग किया है < सुप वर्ग = "xref" > 13 मोटे तौर पर भ्रूण के ऊतकों को चिह्नित करने के लिए ।
    1. क्लोनल विश्लेषण के लिए, एक बहु रंग Cre रिपोर्टर ( उदा का उपयोग करें, कंफ़ेद्दी या इंद्रधनुष [आरबी] चूहों) < सुप क्लास = "xref" > 8 , < सुप क्लास = "xref" > 14 , < सुप क्लास = "xref" > 15 और भाग्य मानचित्रण के लिए, एक का उपयोग करें सिंगल कलर Cre रिपोर्टर ( eg, ROSA26R-YFP चूहों < सुप class = "xref" > 16 ) या डबल कलर Cre रिपोर्टर ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) < सुप class = "xref" > 17 .
      नोट: इस प्रजनन योजना वयस्क चूहों का उपयोग करता है कि 2-6 महीने पुराने है (आम तौर पर ~ 30 जी) और एक CreER और एक Cre रिपोर्टर के साथ भ्रूण उत्पंन होगा ।
  2. सुबह में योनि प्लग के लिए जांच एक धातु की जांच का उपयोग कर और भ्रूण दिवस के रूप में प्लग का पता लगाने के दिन पर विचार दोपहर (ई) ०.५.
  3. एक प्लग का पता चला है जब पुरुष से महिला को अलग.
  4. तैयार 4-OH-tamoxifen और tamoxifen काम समाधान ।
    1. के लिए 4-OH-tamoxifen, भंग 5 मिलीग्राम में ५० & #181; १००% इथेनॉल, भंवर के 2 मिनट के लिए और फिर जोड़ें ४५० & #181; l मकई का तेल. बर्फ पर, sonicate उत्पादन स्तर 2 पर 10 एस चक्र के लिए चक्र के बीच आराम करने के लिए जब तक नमूना ठंडा नीचे । के बाद नमूना पूरी तरह से भंग कर दिया है (आमतौर पर ~ sonication के 4-5 चक्र), ले २०० & #181; l के sonicated समाधान और भंग में १,८०० & #181; मकई तेल के एल बनाने के लिए अंतिम काम समाधान (4-OH-tamoxifen, 1 मिलीग्राम/
      2. tamoxifen के लिए
    2. , १००% इथेनॉल और भंवर में ५० मिलीग्राम/एमएल को पतला जब तक यह भंग है । मकई के तेल में पतला करने के लिए अंतिम काम समाधान (tamoxifen, 10 मिलीग्राम/एमएल) और ४५ पर हलचल & #176; C यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह पूरी तरह से भंग हो गया है ।
  5. जल्दी भ्रूण प्रेरण के लिए, एक गर्भवती बांध में 4-OH-tamoxifen intraperitoneally सुई ।
    1. उपयोग 4-OH-tamoxifen इंजेक्शन (अप करने के लिए ~ १५० & #181; जी प्रति गर्भवती माउस, या मोटे तौर पर 5 मिलीग्राम/kg bodyweight) ई 5.5 और उसके बाद के रूप में वे उपज व्यवहार्य बांध, भ्रूण, और पिल्ले ।
    2. ०.५-१.५ मिलीग्राम की खुराक पर tamoxifen का उपयोग करें (या 17-50 मिलीग्राम/भ्रूण के साथ गर्भवती बांधों के लिए ~ E9 और उसके बाद । सभी इंजेक्शन के लिए एक 30G सुई का प्रयोग करें.
      & #160; नोट: निस्पंदन के माध्यम से एक ०.२२ & #181; मी फिल्टर आम तौर पर इंजेक्शन से पहले सभी मिश्रण को निष्फल करने के लिए प्रयोग किया जाता है । & #160;
  6. क्लोनिंग विश्लेषण के लिए, 4-OH-intraperitoneal की उच्च खुराक के tamoxifen इंजेक्शन का उपयोग करें ( उदा. , 5 मिलीग्राम/किग्रा) या tamoxifen ( उदा. , ५० मिलीग्राम/) एकाधिक कक्षों को चिह्नित करने के लिए ।
    1. व्यक्तिगत कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए, अनुमापन नीचे 4-OH-tamoxifen या tamoxifen खुराक कि ब्याज के ऊतकों में ( यानी, , महाधमनी), लगभग सभी भ्रूण विश्लेषण (जैसा कि इस खंड के अंत में नीचे वर्णित है) या तो कोई कक्ष है या केवल कोशिकाओं लेबल एक ही रंग का; यह थ्रेशोल्ड खुराक है ।
  7. कोशिकाओं के मध्य देर से गर्भावधि अवधि में चिह्नित करने के लिए और उनके भाग्य का पता लगाने के लिए या प्रसव माउस में clonality, intraperitoneal के साथ गर्भवती बांध concomitantly के tamoxifen गुहा में प्रोजेस्टेरोन इंजेक्षन एक 1:2 (प्रोजेस्टेरोन: tamoxifen) खुराक अनुपात.
    नोट: Tamoxifen खुराक रहे हैं 17-50 मिलीग्राम/kg और प्रोजेस्टेरोन खुराक रहे हैं ८.५-25 मिलीग्राम/kg ( यानी , Tamoxifen खुराक का आधा). प्रोजेस्टेरोन इंजेक्शन श्रम में देरी कर सकते हैं ~ 1-2 दिन.
  8. Euthanize एक वांछित उंर के भ्रूण के साथ बांध गर्भवती एक खुली बूंद विधि का उपयोग कर, जहां बांध कपास या पतला isoflurane के साथ लथपथ धुंध युक्त संदूक में रखा गया है । वातिलवक्ष प्रेरित करने के लिए छाती गुहा खोलने के द्वारा मौत की पुष्टि, महत्वपूर्ण अंगों को हटाने के द्वारा, और/या गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के द्वारा ।
  9. ७०% इथेनॉल के साथ पेट शुद्ध । पेट को खुले में काटने के लिए कैंची का प्रयोग करें और गर्भाशय को बाहर टुकड़े । गर्भाशय से भ्रूण निकालें और ध्यान से संदंश.
    10. का उपयोग कर अपरा और जर्दी थैली से भ्रूण को अलग
  10. Euthanize या तो ग्रीवा अव्यवस्था या शल्य कैंची या एक तेज ब्लेड के साथ decapitation प्रदर्शन से E15 या पुराने पर भ्रूण ।
    नोट: E15 से छोटी भ्रूण तेजी से मां की इच्छामृत्यु और/या मां से भ्रूण को हटाने के बाद मर जाते हैं ।
  11. बर्फ में भ्रूण जगह-ठंड पंजाब और CreER और Cre रिपोर्टर के लिए जीनोटाइप करने के लिए कैंची का उपयोग कर पूंछ का एक छोटा सा टुकड़ा काट लिया ।
  12. 4% paraformaldehyde में भ्रूण को ठीक 4 & #176; ग के लिए 2 ज. पंजाब में तीन बार भ्रूण धोने और फिर 15 मिलीलीटर ट्यूबों में 30% पंजाब में सुक्रोज में भ्रूण की मशीन, जब तक वे सिंक है, जो दो दिन तक लग सकता है इंतज़ार कर रहे ।
  13. अधिकतम काटने तापमान (OCT) यौगिक के साथ अधिक से अधिक स्तर के 2/3 करने के लिए प्लास्टिक ठंड molds भरें । प्लेस प्रत्येक भ्रूण मोल्ड में खड़ी, पूरी तरह से कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अक्टूबर में जलमग्न (आरटी) बुलबुले को कम करने के लिए ।
  14. प्लेस ठंड ऊतक ब्लॉकों एक सूखी बर्फ में ईमानदार, ७०% इथेनॉल स्नान फ्रीज करने के लिए । पर ब्लॉक्स स्टोर-८० & #176; C.
  15. सेट cryostat तापमान को-22 & #176; ग और कट ब्लाकों के माध्यम से अनुप्रस्थ वर्गों को उत्पन्न करने के लिए पूरे महाधमनी, 10-20 & #181; मी थिक । उन पर संग्रहीत करने से पहले 30 मिनट के लिए RT पर स्लाइड को सुखाएं-८० & #176; ग.
  16. गल आरटी पर स्लाइड, प्रकाश से संरक्षित fluorophores के ब्लीचिंग से बचने के लिए । पंजाबियों के साथ स्लाइड धो-Tween20 ०.१% । क्लोनल विश्लेषण के लिए
    1. , नाभिक के लिए स्लाइड दाग (DAPI, 5 मिलीग्राम/एमएल) और सीधे छवि इंद्रधनुष Cre रिपोर्टर में अंय fluorophores (आसमानी: ४३३-एनएम उत्तेजना मैक्स, ४७५-एनएम उत्सर्जन मैक्स; mOrange: ५४८ एनएम, ५६२ एनएम; mCherry: ५८७ एनएम, ६१० एनएम) ।
      1. एक ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ fluorophores का पता लगाने के लिए निंनलिखित फिल्टर का उपयोग करें: DAPI (उत्तेजना मैक्स/बैंडविड्थ 350/50 एनएम, उत्सर्जन मैक्स/बैंडविथ 460/50 एनएम), आसमानी (उत्तेजना 436/20 एनएम, उत्सर्जन 480/40 एनएम), टेक्सास लाल (उत्तेजना 560/ ४० एनएम, उत्सर्जन 630/75 एनएम) और कस्टम फिल्टर mOrange (उत्तेजना 577/10 एनएम, उत्सर्जन 630/50 एनएम) से mCherry अलग करने के लिए ।
    2. mTmG Cre रिपोर्टर के साथ भाग्य मानचित्रण के लिए, GFP (४८४ एनएम, ५१० एनएम) का पता लगाने, या तो सीधे इमेजिंग द्वारा या immunostaining का उपयोग करके । एक ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए एक GFP फिल्टर (उत्तेजना 470/40 एनएम, उत्सर्जन 525/50 एनएम) का उपयोग करें ।
    3. के लिए immunostaining, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर में 4 & #176; सी, ०.१% ट्राइटन X-पंजाब में १०० के साथ धोने और फिर 1 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन का उपयोग करें विरोधी CD31 (अंतिम एकाग्रता ०.००१६ मिलीग्राम/एमएल), विरोधी GFP (०.००६ मिलीग्राम/एमएल) और Cy3-सीधे संयुग्मित विरोधी SMA (1:500 अंतिम कमजोर पड़ने) प्राथमिक एंटीबॉडी और उपयोग माध्यमिक antibodieएस सीधे fluorophores को संयुग्मित (1:500 अंतिम कमजोर पड़ने) (सामग्री के तालिका देखें) ।
  17. एक ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवि स्लाइड (बढ़ाई: 4x-20X) या फोकल माइक्रोस्कोप (10x-63X) । उच्च आवर्धन के लिए, 1.4-0.6 और १,०२४ x १,०२४ पिक्सेल का एक फ्रेम आकार के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक फोकल इमेजिंग 63x तेल उद्देश्य का उपयोग करें ।
< p class = "jove_title" > 2. Explant भ्रूण महाधमनी संस्कृति

< p class = "jove_content" > नोट: यह दृष्टिकोण पहले से integrin beta3 की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया गया था explanted Eln (-/-) भ्रूण महाधमनी < सुप वर्ग = "xref" > 9 , < सुप वर्ग = "xref" > १८ .

  1. Euthanize ई 15.5 पर एक समय पर गर्भवती बांध अतिरिक्त isoflurane सांस लेना, के रूप में कदम १.८, ऊपर के अनुसार ।
  2. फसल और भ्रूण euthanize, कदम के अनुसार १.९-१.१०, ऊपर.
  3. स्थिति भ्रूण supinely और विस्तृत अंग विच्छेदन बोर्ड को पिन । एक विच्छेदन stereoscope के साथ कल्पना और कैंची का उपयोग करने के लिए ऊपरी छाती को उरोस्थि के माध्यम से पेट से एक ऊर्ध्वाधर चीरा काट । टुकड़े दूर थाइमस, श्वासनली, फेफड़े, घेघा, जिगर, और आंत.
  4. धीरे संदंश का उपयोग कर ventrally दिल खींच और महाधमनी वक्ष और उदर गुहाओं के पृष्ठीय पहलू से दूर टुकड़े के लिए कैंची का उपयोग करें । महाधमनी जारी करने के लिए, यह समीपस्थ रूट और बाहर पेट की स्थिति में कटौती ।
  5. जगह एक सेल संस्कृति हूड में बर्फ ठंडा बाँझ पंजाब में महाधमनी । महाधमनी को 24-वेल प्लेट में ट्रांसफर करें और DMEM में कल्चर इसे ०.५% FBS के साथ 24 ज पर ३७ & #176; C.
    नोट: संस्कृति माध्यम एक अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ पूरक किया जा सकता है ( उदा, anti-integrin & #945; v & #946; 3 एंटीबॉडी पर ०.०२ mg/मब < सुप वर्ग = "xref" > 9 ; सामग्री की तालिका देखें) या एक औषधीय एजेंट.
  6. महाधमनी दो बार पंजाबियों के साथ धो लें और फिर इसे 4% paraformaldehyde के साथ 20 min.
    7. के लिए ठीक करें
  7. ने पंजाबियों के साथ तीन बार धुलाई की और महाधमनी को 30% सुक्रोज के साथ १.५-एमएल ट्यूब को पंजाब में ट्रांसफर कर रहे हैं । महाधमनी सिंक के बाद, जमे हुए ऊतक ब्लॉकों बनाओ, वर्गों में कटौती, और immunostain, के रूप में चरणों में वर्णित १.१३-१.१५, ऊपर.
< p class = "jove_title" > 3. प्रसवकालीन से एसएमसी अलगाव महाधमनी

< p class = "jove_content" > नोट: यह प्रकिया वर्तमान में SMCs Eln (-/-) और wildtype चूहों से पृथक किए गए महाधमनी प्रसवकालीन के जीवविज्ञान की तुलना करने के लिए उपयोग में लिया जा रहा है ।

  1. Euthanize प्रसव दिवस (पी) ०.५ में एक murine पिल्ला, या तो ग्रीवा अव्यवस्था या शल्य कैंची या एक तेज ब्लेड के साथ decapitation द्वारा, के रूप में चरण १.१०, ऊपर में वर्णित है ।
  2. २.३ कदम प्रदर्शन और फिर, छाती और पेट खोलने के बाद, पंचर 23G सुई के साथ निलय छोड़ दिया है । एक ऊंचा स्थिति में खड़ी आयोजित इतना है कि पंजाबियों गुरुत्वाकर्षण द्वारा छोड़ दिया निलय में बहती है बाँझ-पंजाब-युक्त सिरिंज के लिए सुई कनेक्ट करने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग का प्रयोग करें. छोड़ दिया निलय में बाँझ पंजाबियों के अर्क की अनुमति दें जब तक जिगर में उबाल ।
    1. महाधमनी के बाहर adventitial ऊतक निकालने के लिए संदंश का उपयोग करें और टुकड़े चरण २.४ में बताए गए अनुसार महाधमनी ।
  3. डाइजेस्ट के एकल समाधान में महाधमनी DMEM (५०० & #181; L) के पूरक २२५ u/एमएल collagenase, २.२५ u/एमएल elastase, और 1x एंटीबायोटिक-antimycotic ४५ मिनट के लिए ३७ & #176; C. मैंयुअल रूप से ट्यूब शेक हर 5-10 min.
    4. बाँझ कोशिका संस्कृति हूड में
  4. , titurate के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा डाइजेस्ट ऊतक एक २००-& #181; L पिपेट एक एकल-कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए. एक 15 एमएल ट्यूब करने के लिए एकल-सेल निलंबन स्थानांतरण, DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ९२० पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक 25 & #176; C.
  5. त्याग supernatant । एसएमसी कल्चरल मीडियम के 3 एमएल में सेल की गोली फिर से सस्पेंड (DMEM युक्त 10% FBS सप्लीमेंट विथ 1 & #181; जी/एमएल rhFGF, 10 & #181; जी/एमएल rhEGF, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/streptomycin, और २.५ & #181; जी/एमएल Amphotericin बी) । एक ३५-mm संस्कृति प्लेट को हस्तांतरण ।
    नोट: प्रारंभिक अलगाव पर, ~ ४००,००० कोशिकाओं को एक एकल पी 0.5 wildtype महाधमनी से प्राप्त कर रहे हैं; ~ ३००,००० इन कोशिकाओं के SMCs हैं.
  6. कल्चर ऑन सेल ३७ & #176; सी और फ्रेश एसएमसी कल्चर मीडियम को हर 3 दिन में बदलें । trypsin के साथ मानक तकनीक का प्रयोग, जब धाराप्रवाह कोशिकाओं बीतने । प्रयोगों के लिए, 3-7.
    7. मार्ग से कोशिकाओं का उपयोग
< p class = "jove_title" > 4. चमड़े के नीचे परासरणी मिनी-पंप में नियुक्ति गर्भवती (या गैर-गर्भवती) चूहे

< p class = "jove_content" > नोट: यह दृष्टिकोण पहले से लगातार एक औषधीय एजेंट देने के लिए इस्तेमाल किया गया था ( उदा, integrin & #946; 3 और & #946; 5 अवरोधक cilengitide) को भ्रूण utero < सुप वर्ग = "xref" > 9 . पंप गर्भवती बांध में ई 13.5 में डाला गया था और प्रसव तक बनाए रखा ।

  1. Anesthetize चूहों में 2-5% isoflurane के साथ ऑक्सीजन (1 एल/मिनट की दर प्रवाह) के लिए प्रेरण और रखरखाव के लिए 1-3% । संज्ञाहरण के स्तर पर नजर रखने के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा का उपयोग करें, और संवेदनाहारी एजेंट आवश्यकतानुसार समायोजित । analgesia.
    2. के लिए चमड़े के नीचे buprenorphine (०.०५-०.१ मिलीग्राम/
  2. कतरनों के साथ पीठ के निचले हिस्से दाढ़ी । बाँझ पर्दे, दस्ताने, और उपकरणों का उपयोग करें और सर्जरी के दौरान एक हीटिंग सर्जिकल प्लेट पर चूहों को बनाए रखने.
  3. जगह प्रवण स्थिति में प्रत्येक माउस और isopropyl शराब के बाद betadine के साथ वापस हाथ धोने । लगभग 3-5 सेमी पीठ के निचले हिस्से में पूंछ के आधार करने के लिए rostral, एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए अंतर्निहित मांसपेशी घायल बिना लंबाई में एक क्षैतिज त्वचा चीरा ०.५-१.० सेमी बनाने के लिए ।
  4. चीरा में एक hemostat डालने और hemostat जबड़े को खोलने और बंद करने से पंप आरोपण के लिए एक चमड़े के नीचे जेब rostrally बनाने के लिए ।
  5. एक परासरणी मिनी पंप पसंद के एजेंट के साथ भरें, के रूप में निर्माता & #39; एस दिशानिर्देश ( सामग्री की तालिका देखें) के अनुसार । जेब में भर पंप डालें और क्लिप या 6-0 गैर अवशोषित टांके के साथ चीरा बंद । सुनिश्चित करें कि कुल शल्य चिकित्सा समय से कम है 10 min.
  6. पोस्ट-ऑपरेटिव, चूहों हर 15 मिनट की निगरानी जब तक वे स्टर्नल recumbency से बरामद किया है. प्रशासन के चमड़े के नीचे buprenorphine (०.०५-०.१ मिलीग्राम/हर 6-12 एच के लिए ४८ एच । जब चूहों को पूरी तरह से सामान्य संज्ञाहरण से बरामद किया है, उन्हें दैनिक निगरानी. क्लिप या टांके निकालें 7-10 दिनों के बाद सर्जरी ।

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Representative Results

SMCs के एक प्रतिनिधि क्लोनिंग में भ्रूण उत्परिवर्ती में विश्लेषण के लिए Eln (जीन extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन elastin एंकोडिंग), Eln(+/-), Acta2-CreERटी 2 चूहों Eln करने के लिए साथी थे (+/ चूहों को भी ले जा रिपोर्टर-बहु रंग ROSA26R(आरबी/ के रूप में चरण 1 में वर्णित है, प्लग की जांच की गई, गर्भवती बांध एक एकल tamoxifen इंजेक्शन के साथ प्रेरित किया गया (१.५ मिलीग्राम) e 12.5 पर, और वे ई 18.5 में बलिदान किया गया । भ्रूण काटा, स्थिर, जमे हुए थे, और genotyped । अनुप्रस्थ उतरते महाधमनी cryosections काट रहे थे । Eln से अनुभाग (+/, Acta2-CreERटी 2, ROSA26R(आरबी/ भ्रूण को संकेत मिलता है कि अतिरिक्त भीतरी परत SMCs है कि Eln-अशक्त चूहों में संचित (ई 15.5 के बाद शुरू) कई रंगों द्वारा चिह्नित कर रहे है ( चित्र 1) और इसलिए कई अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (SMA)+ कोशिकाओं है कि ~ 12.5 e पर मौजूद है से प्राप्त । ई 12.5 महाधमनी में, SMA+ कोशिकाओं tunica मीडिया तक ही सीमित हैं ।

उत्पंन करने के लिए Eln(-/-) भ्रूण aortas के लिए explants, पुरुष और महिला Eln(+/ चूहों साथी थे । चरण 2 में वर्णित विधियों का उपयोग कर, प्लग की जांच की गई और गर्भवती Eln(+/ बांधों ई 15.5 पर बलिदान किया गया । aortas से पृथक किए गए थे Eln(-/-) भ्रूण और संस्कृति के लिए 0 या 18 एच की उपस्थिति में एक विरोधी integrin β3 अवरुद्ध एंटीबॉडी या एक IgG1 नियंत्रण. Aortas तो स्थिर, जमे हुए थे, और cryosectioned, और cryosections SMA (एसएमसी मार्कर), CD31 (endothelial सेल मार्कर), और नाभिक (DAPI) (चित्रा 2) के लिए दाग थे । परिणाम प्रदर्शित करता है कि संवर्धन के 18 ज के भीतर, e 15.5 Eln(-/-) महाधमनी हो जाता है hypermuscular और stenotic । इस प्रक्रिया को एक विरोधी integrin β3 अवरुद्ध एंटीबॉडी द्वारा तनु है ।

SMCs पी ०.५ पर wildtype चूहों के महाधमनी से अलग-थलग थे. चरण 3 में वर्णित के रूप में, SMCs एंजाइम पाचन द्वारा विच्छेदित नवजात महाधमनी से अलग थे और संस्कृति थे । कोशिकाओं को पारित किया गया, और गद्यांश 3 कोशिकाओं एसएमसी मार्करों के लिए दाग थे (यानी, SMA, चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला (SMMHC), या transgelin (SM22α के रूप में भी जाना जाता है)), CD31, और नाभिक (DAPI) (चित्रा 3) । अधिकांश कल्चरल कोशिकाएं एसएमसी मार्करों को अभिव्यक्त करती हैं लेकिन CD31 नहीं ।

integrin β3 के औषधीय निषेध hypermuscularization और Eln का एक प्रकार का रोग क्षीणन कर सकते हैं कि क्या मूल्यांकन करने के लिए vivo में -/ महाधमनी, हम लगातार अपने छोटे आधे जीवन की वजह से अवरोधक cilengitide संचार प्लाज्मा में । Eln(+/−) पुरुषों और महिलाओं के साथी थे, और, के रूप में 4 चरण में वर्णित है, परासरणी मिनी cilengitide से भरी पंपों ई 13.5 पर गर्भवती बांधों में प्रत्यारोपित किया गया । पी 0.5 पर, पिल्ले euthanized और genotyped थे, और उनके aortas विश्लेषण किया गया । Cilengitide उपचार महत्वपूर्ण Eln में महाधमनी प्रकार का रोग और hypermuscularization (-/ चूहों (चित्रा 4) wildtype महाधमनी9फेरबदल के बिना क्षीणन । इस प्रकार, विरोधी integrin β3 elastin aortopathy का इलाज करने के लिए एक संभावित होनहार इनवेसिव दृष्टिकोण है ।

Figure 1
चित्र 1 . अतिरिक्त SMCs में Eln(-/-) महाधमनी एकाधिक पूर्व-विद्यमान SMCs से व्युत्पन्न है. बांधों Eln के साथ गर्भवती (-/-), Acta2-CreERटी 2 भ्रूण भी बहुरंगा Cre रिपोर्टर ROSA26R ले(आरबी/ intraperitoneal के एक tamoxifen इंजेक्शन के साथ प्रेरित किया गया ई 12.5 पर (१.५ मिलीग्राम) । बांधों ई 18.5 में बलिदान किया गया, और भ्रूण के घटते aortas के अनुप्रस्थ वर्गों का विश्लेषण किया गया, DAPI के लिए दाग के साथ और आरबी रंग के प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति, आसमानी (Cer), mCherry (एमसीएच), और mOrange (मोर) । अतिरिक्त SMCs ई 15.518के बाद Eln-अशक्त महाधमनी के भीतरी पहलू में संचित । अतिरिक्त भीतरी परत SMCs कई रंगों (तारक), polyclonality का संकेत की कोशिकाओं में शामिल हैं । लू, महाधमनी लुमेन. स्केल बार, 10 µm., २०१६ 9मिसळा. से पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . विरोधी αvβ3 Integrin नाकाबंदी क्षीणन Hypermuscularization और एक प्रकार का रोग Eln के(-/ महाधमनी Explant। ई 15.5 पर, गर्भवती बांधों euthanized थे और Eln के aortas (-/ भ्रूण काटा गया । पृथक aortas या तो तुरंत तय कर रहे थे या एक isotype नियंत्रण IgG1 या एक integrin αvβ3 के लिए 18 एच निर्धारण करने से पहले के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध की उपस्थिति में संस्कृति । फिक्स्ड aortas CD31, SMA, और नाभिक (DAPI) के लिए दाग थे । लू, महाधमनी लुमेन. स्केल बार, १०० µm., २०१६ 9को मिसळा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . नवजात चूहों से पृथक और सुसंस्कृत महाधमनी SMCs चिकनी मांसपेशी मार्करों एक्सप्रेस । SMCs पी 0.5 पिल्ले से अलग थे और संस्कृति थे । तीसरे मार्ग से कोशिकाओं को ठीक किया गया और CD31 (ईसी मार्कर), नाभिक (DAPI), और एक एसएमसी मार्कर (या तो SMA, SM22α, या SMMHC, संकेत के रूप में) के लिए दाग । यह विश्लेषण इंगित करता है कि ~ ९०% प्रसंस्कृत कोशिकाओं एसएमसी मार्करों एक्सप्रेस, और कोई भी CD31 व्यक्त करने के लिए मनाया गया । स्केल बार, १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . Vivo में Cilengitide के सतत अर्क Eln(-/ महाधमनी Hypermuscularization और एक प्रकार का रोग । नर और मादा Eln(+/ चूहों को पार कर गया । integrin β3 अवरोध करनेवाला cilengitide या वाहन (पंजाबियों) लगातार गर्भवती परासरणी मिनी का उपयोग कर बांधों में संचार किया गया था, ई 13.5 पर शुरू पंपों । p 0.5 पर अनुप्रस्थ अनुभाग SMA (लाल), CD31 (सफेद), और नाभिक (DAPI, नीला) के लिए दाग थे । लू, महाधमनी लुमेन. स्केल बार, १०० µm । इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

atherosclerosis के मॉडल के रूप में वयस्क रोग की स्थिति में murine महाधमनी और इसकी प्रमुख शाखाओं की व्यापक जांच के विपरीत, कम morphogenesis और भ्रूण और रोगजनन प्रसवकालीन के महाधमनी के बारे में जाना जाता है । यहां, हम भ्रूण/प्रसवकालीन महाधमनी पर ध्यान केंद्रित, विशेष रूप से SMCs, और प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए महाधमनी के माध्यम से vivo मेंअध्ययन करने के लिए, ऊतक explant, और एसएमसी अलगाव दृष्टिकोण । इन मानार्थ दृष्टिकोण विविध दृष्टिकोण भ्रूण का अध्ययन/प्रसवकालीन महाधमनी के साथ अंवेषक प्रदान करते हैं ।

क्लोनल विश्लेषण एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि एक व्यक्ति की कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने की अनुमति देता है । हम हाल ही में फुफ्फुसीय vasculature में विशेष SMCs की पहचान करने में मदद करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया है10. यह पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है कि, एक व्यक्ति माउस में एक बहु रंग Cre रिपोर्टर ले जा, वहां एक मौका है कि एक ही रंग की कोशिकाओं को एक से अधिक संयोजन घटना से निकल सकता है । इस प्रकार, एक बहु रंग रिपोर्टर के साथ क्लोनल विश्लेषण कई चूहों के मूल्यांकन आवश्यक । क्योंकि मध्य देर से गर्भावधि अवधि में tamoxifen प्रसव के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, प्रयोगों के लिए है कि मध्य देर से गर्भावधि अवधि में कोशिकाओं को चिह्नित और उन्हें ट्रेस postnatally, प्रोजेस्टेरोन और tamoxifen concomitantly इंजेक्ट किया जाना चाहिए. भ्रूण में प्रोटोकॉल के समान, भाग्य मानचित्रण और वयस्क माउस में कोशिकाओं के क्लोनल विश्लेषण वयस्क में tamoxifen के intraperitoneal इंजेक्शन के साथ किया जा सकता है ।

क्लोनिंग विश्लेषण और SMCs के भाग्य मानचित्रण चिकनी मांसपेशी में बढ़ाया गतिविधि के साथ प्रवर्तकों के नियंत्रण में Cre recombinase की अभिव्यक्ति के साथ transgenes ले चूहों का उपयोग करता है । यहाँ, हम सशर्त transgenes Myh11-CreERटी 2 या Acta2-CreERटी 2ले जाने चूहों का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन. Myh11 के सबसे विशिष्ट मार्कर है SMCs19; तथापि, यह Eln में downregulated है (-/ महाधमनी9। Acta2 SMCs में व्यक्त किया जाता है, जिसमें Eln-null महाधमनी भी शामिल है, लेकिन यह उतने विशिष्ट नहीं है, क्योंकि यह अंय प्रकार के सेल में व्यक्त किया जाता है । यदि इन सशर्त transgenes थे "टपका हुआ" (यानी, tamoxifen के अभाव में संयोजन प्रेरित), यह समस्याग्रस्त हो सकता है, के रूप में प्रयोगों सेल अंकन के समय चित्रित नहीं होगा. इन transgenes के leakiness चूहों में बीटा-galactosidase गतिविधि का आकलन एक lacZ आधारित Cre रिपोर्टर और या तो Myh11-CreERटी 2 या Acta2-CreERटी 2 निम्नलिखित वाहन उपचार ( यानी, tamoxifen इंडक्शन के अभाव में)11,12. इस विश्लेषण के आधार पर इन transgenes को लीक नहीं माना गया.

Hypermuscularization मनुष्यों में कई संवहनी विकृतियों की विशेषता है । उदाहरण के लिए, supravalvular महाधमनी एक प्रकार का रोग (SVAS) एक विनाशकारी जन्मजात हालत है कि अधिक SMCs के कारण बड़े और मध्यम आकार की धमनियों की रुकावट की विशेषता है । SVAS जीन के एक एलील के समारोह के नुकसान से परिणाम और एक अलग इकाई के रूप में होता है या, और अधिक सामांयतः, विलियंस के भाग के रूप में-Beuren सिंड्रोम20,21,22,23,24। Eln(-/-) उत्परिवर्ती चूहों SVAS18,21,22के महाधमनी phenotype के कई पहलुओं को phenocopy । महाधमनी से explants Eln(-/-) भ्रूण तेजी से संस्कृति के दौरान occluded हो जाते हैं, जबकि explants भ्रूण से wildtype9,18पेटेंट रहते हैं । महाधमनी explant दृष्टिकोण एजेंटों कि elastin aortopathy9में एक प्रकार का रोग क्षीणन के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा । हालांकि, इस दृष्टिकोण को ध्यान में यांत्रिक या शारीरिक बलों है कि महाधमनी शरीर में समय के अधीन नहीं ले करता है । इस प्रकार, महाधमनी explant स्क्रीनिंग में सकारात्मक हिट vivo Eln उत्परिवर्ती माउस मॉडल में के साथ मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

एसएमसी आइसोलेशन प्रोटोकॉल प्रसवकालीन murine महाधमनी से SMCs प्राप्त करने के लिए एक तीव्र और सुदृढ़ विधि है । एक समान दृष्टिकोण वयस्क चूहों से SMCs को अलग करने के लिए extrapolated जा सकता है । इसके अपेक्षाकृत बड़े आकार की वजह से वयस्क महाधमनी को longitudinally खोला जा सकता है और adventitia और endothelial कोशिकाएं दूर से ही विदारक हो जाती हैं. प्रसवकालीन या वयस्क महाधमनी से पृथक कोशिकाओं की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए, एसएमसी मार्करों (जैसे, SMMHC, smoothelin, SM22α, और SMA) की अभिव्यक्ति के लिए जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और endothelial सेल मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी (उदा., CD31 और संवहनी-endothelial cadherin). एक संभावित वैकल्पिक अलगाव दृष्टिकोण के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए अलग फ्लोरोसेंट SMCs से चिह्नित महाधमनी । चूहों एक फ्लोरोसेंट Cre रिपोर्टर और Myh11-CreERटी 2ले जाने, Acta2-CreERटी 2, या Tgln-Cre फ्लोरोसेंट लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता SMCs11,12,25, 26,27. वैकल्पिक रूप से, एक fluorophore (यानी, GFP, mCherry, या आरएफपी) की अभिव्यक्ति ड्राइविंग SMA प्रमोटर के साथ मौजूदा ट्रांसजेनिक चूहों28,29,30इस्तेमाल किया जा सकता है ।

प्रत्यारोपित परासरणी मिनी पंपों प्रयोगशाला पशुओं के लिए औषधीय एजेंटों के निरंतर वितरण प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है । हम मिनी को प्रत्यारोपित किया है गर्भवती चूहों में पंप ई 13.5 में गर्भावधि अवधि9के आराम के दौरान भ्रूण के विकास के लिए एजेंटों देने के लिए. भ्रूण तक पहुंचने के लिए ऐसे एजेंटों को ब्लड-अपरा बैरियर पास करने में सक्षम होना जरूरी है । सामांय में, मिनी पंपों बहुत अच्छी तरह से सहन कर रहे है और, संक्रमण की कम दर को देखते हुए, नियमित एंटीबायोटिक दवाओं की सिफारिश नहीं कर रहे हैं । घाव dehiscence दुर्लभ है; हालांकि, अगर एक dehiscence से अधिक 4 मिमी का पता चला है, माउस फिर से होना चाहिए anesthetized और घाव साफ और एक शल्य टांका के साथ फिर से बंद कर दिया ।

इस काम के दृष्टिकोण का एक armamentarium का वर्णन है कि विकास के दौरान भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी दीवार के सामांय गठन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ इस प्रक्रिया में रोग के दौरान perturbations के बाद । इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल के रखरखाव और वयस्क महाधमनी के रोग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । दृष्टिकोण अंय रक्त वाहिकाओं के लिए extrapolated जा सकता है, साथ ही साथ चिकनी मांसपेशी लेपित गैर संवहनी संरचनाओं, जैसे जठरांत्र संबंधी मार्ग या फेफड़ों एयरवेज । अंत में, समान तकनीकों को SMCs से परे कक्ष प्रकारों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि endothelial कक्ष या fibroblasts, साथ ही इन कक्षों के प्रकारों और SMCs के बीच में पुनरावृत्ति ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम महाधमनी एसएमसी अलगाव के लिए अपनी प्रयोगशाला प्रोटोकॉल बांटने के लिए डीन ली धंयवाद । फंडिंग सहायता राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21NS088854, R01HL125815, और R01HL133016 को डी. एम. जी.) द्वारा प्रदान की गई थी, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (ग्रांट-इन-एड 14GRNT19990019 टू D.M.G.), और येल विश्वविद्यालय (ब्राउन-Coxe फेलोशिप टू A.M. एंड स्टार्टअप D.M.G. के लिए फंड) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon 
 TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory  19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory  8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory   026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory   006148 
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory  13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

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