टोल की तरह रिसेप्टर सिग्नलिंग के इनहिबिटरस के लिए फागोसिटिक इम्यून सेल में बायोएक्टिव नैनोकणों को स्क्रीनिंग करना
Summary
टोल की तरह रिसेप्टर (टीएलआर) सिग्नलिंग कई मानव भड़काऊ बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और बायोइएक्टिव नैनोकणों द्वारा टीएलआर प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए कई सूजन स्थितियों में फायदेमंद होने का अनुमान है। टीएचआर -1 सेल आधारित रिपोर्टर कोशिकाएं टीएलआर सिग्नलिंग के उपन्यास इनहिबिटर्स की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी और मजबूत स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करती हैं।
Abstract
टोल की तरह रिसेप्टर (टीएलआर) के जवाबों के औषधीय विनियमन कई सूजन रोगों के उपचार में महान वादा करता है। हालांकि, टीएलआर सिग्नल को कम करने के लिए अब तक उपलब्ध सीमित यौगिकों मौजूद हैं और नैदानिक उपयोग में कोई नैदानिक रूप से अनुमोदित टीएलआर अवरोधक (मलेरिया विरोधी दवा हाइड्रोइजिकलक्वाइन को छोड़कर) नहीं किया गया है। नैनो-प्रौद्योगिकी में तेजी से प्रगति की स्थिति में नैनो-उपकरणों का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का हेरफेर इन रोगों के इलाज के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकता है। इसके साथ ही, हम फॉगोसिटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में टीएलआर सिग्नल को बाधित करने वाले उपन्यास जैव-सक्रिय नैनोकणों की पहचान करने के लिए एक उच्च थ्रूपूट स्क्रीनिंग विधि पेश करते हैं। यह स्क्रीनिंग प्लेटफार्म टीएचपी -1 सेल आधारित रिपोर्टर कोशिकाओं पर बनाया गया है जिसमें रंगीनमेट्रिक और ल्यूसफेरेज़ एलेस शामिल हैं। रिपोर्टर कोशिकाओं को मानव टीएचपी -1 मोनोसाइटैटिक सेल लाइन से दो inducible रिपोर्टर निर्माणों के स्थिर एकीकरण के द्वारा इंजीनियर किया गया है। एक एक गुप्त भ्रूणीय क्षारीय फॉस्फेट (एसईएपी) जीन को व्यक्त करता हैप्रतिलेखन कारक एनएफ-κबी और एपी -1 द्वारा अनुमोदित प्रमोटर के नियंत्रण के तहत, और दूसरे एक इंटरवारोन विनियामक कारकों (आईआरएफ) द्वारा अनुमोदित प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत एक गुप्त लुइसफेर रिपोर्टर जीन को व्यक्त करते हैं। टीएलआर उत्तेजना के बाद, रिपोर्टर कोशिकाओं को सक्रिय प्रतिलेखन कारक और बाद में सीएपी और / या ल्यूइफेरेज़ का उत्पादन करते हैं, जिसे उनके संबंधित सब्सट्रेट अभिकर्मकों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के तौर पर हमारे पिछले अध्ययनों में स्थापित पेप्टाइड-गोल्ड नैनोपैर्टिकल (जीएनपी) संकर की लाइब्रेरी का उपयोग करते हुए हमने एक पेप्टाइड-जीएनपी संकर की पहचान की जो कि प्रभावी रूप से अपने प्रोटोटाइपिकल लिगैंड, लिपोपोलिसेकेराइड (एलपीएस) द्वारा शुरू होने वाले टीएलआर 4 सिग्नलिंग कैस्केड को बाधित कर सके। इन निष्कर्षों को इम्यूनोब्लॉटिंग सहित मानक जैव रासायनिक तकनीकों के द्वारा मान्य किया गया था। आगे के विश्लेषण ने स्थापित किया कि इस लीड संकर में एक व्यापक अवरोधक स्पेक्ट्रम था, जिसमें टीएलआर 2, 3, 4, और 5 सहित कई टीएलआर मार्गों पर अभिनय किया गया था। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता हैआरए नैनोपार्टिकल (या अन्य चिकित्सीय यौगिकों) फ़ैगोसिटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में विशिष्ट टीएलआर सिगनल को नियंत्रित कर सकते हैं।
Introduction
संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में योगदान देने वाले सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) महत्वपूर्ण तत्व हैं। टीएलआर पाथोजेन-संबंधित आणविक पैटर्न (या पीएएमपी) के एक प्रदर्शनों की सूची को पहचानकर आक्रमणकारी रोगज़नक़ों की पहचान करने और सिग्नल ट्रांसडकेशन 1 , 2 के झरने के माध्यम से रक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाना करने के लिए जिम्मेदार हैं। पहचान के 10 मानव टीएलआर हैं; टीएलआर 10 को छोड़कर, जिसके लिए लिगैंड अस्पष्ट रहते हैं, प्रत्येक टीएलआर को पीएएमपी के एक अलग, संरक्षित समूह को मान्यता मिल सकती है। उदाहरण के लिए, टीएलआर 2 और टीएलआर 4, मुख्यतः सेल की सतह पर स्थित है, क्रमशः ग्रामो-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया से लिपोप्रोटीन और ग्लाइकोलीपिड का पता लगा सकते हैं; जबकि टीएलआर 3, टीएलआर 7/8 और टीएलआर 9 मुख्य रूप से एन्डोसॉमल डिब्बों में मौजूद होते हैं, वे आरएनए और डीएनए उत्पादों को वायरस और बैक्टीरिया से समझ सकते हैं 3 जब पीएएमपी द्वारा प्रेरित किया जाता है, तो टीएलआर प्रो-आईएनएफ जारी करके आवश्यक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को गति प्रदान करता हैथके हुए मध्यस्थों, प्रभावकारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भर्ती और सक्रिय करना, और बाद में अनुकूली प्रतिरक्षा घटनाओं का समन्वय करना 4 ।
टीएलआर सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन को केवल दो मुख्य रास्ते 5 , 6 में वर्गीकृत किया जा सकता है। एक एडेप्टर प्रोटीन मायलोइड भेदभाव कारक 88 (माइद 88) पर निर्भर है – माइद 88-निर्भर मार्ग टीएलआर 3 को छोड़कर सभी टीएलआर, सक्रिय बी कोशिकाओं (एनएफ-κबी) और एमटोजेन-जुड़े प्रोटीन केनसेस (एमएपीके) के परमाणु कारक कप्पा-लाइट-चेन-एनएन्टेनर को सक्रिय करने के लिए इस मार्ग का उपयोग करते हैं, जिससे टीएनएफ-एफएम जैसे प्रो-भड़काऊ मध्यस्थों की अभिव्यक्ति हो सकती है। Α, आईएल -6 और आईएल -8 इंटरफेन (आईएफएन) नियामक कारकों (आईआरएफ) और एनएफ-κबी को सक्रिय करने के लिए दूसरे मार्ग में एडीएपी-उत्प्रेरित इंटरफेरॉन-बीओ (टीआरआईएफ) – टीआरआईएफ-आश्रित या माइंड 88-स्वतंत्र मार्ग का उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्पादन होता है प्रकार I IFNs बरकरार टीएलआर सिग्नलिंगमाइक्रोबियल और वायरल संक्रमण से हमारे दैनिक संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है; टीएलआर सिग्नलिंग रास्ते में दोष से इम्यूनोडिफीसिअन हो सकता है और अक्सर मानव स्वास्थ्य के लिए हानिकारक होता है। 7
हालांकि, टीएलआर सिग्नलिंग एक 'दोधारी तलवार' है और अत्यधिक, अनियंत्रित टीएलआर सक्रियण हानिकारक है। निष्क्रिय टीएलआर प्रतिक्रियाएं कई तीव्र और पुरानी मानव भड़काऊ रोगों में रोगजनन के लिए योगदान देती हैं 8 , 9 । उदाहरण के लिए, सिसिस जो कि प्रणालीगत सूजन और बहु-अंग की चोट के कारण होती है, मुख्य रूप से संक्रमण के प्रति तीव्र, भारी प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं के कारण होता है, टीओएलआर 2 और टीएलआर 4 के साथ सेप्सिस पैथोफिज़ियोलॉजी 10 , 11 , 12 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके अलावा, टीओएलआर 5 को सिस्टिक फाइब्रोसिस 13 के रोगियों की पुरानी फेफड़ों की सूजन में योगदान करने के लिए पाया गया है, 14 इसके अलावा, डिज़ेग्रेटेड एंडोसोमल टीएलआर सिग्नलिंग (जैसे, टीएलआर 7 और टीएलआर 9) जोरदार रूप से प्रणालीगत ल्यूपस एरीथेमेटोसस (एसएलई) और रुमेटीयड गठिया (आरए) 15 , 16 सहित कई स्वयंइम्यून रोगों के विकास और प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है। सबूत के इन converging लाइनों कई भड़काऊ रोगों 17 के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में TLR संकेत की पहचान।
हालांकि टीएलआर प्रतिक्रियाओं के औषधीय विनियमन को कई सूजन स्थितियों में फायदेमंद होने की उम्मीद है, दुर्भाग्य से, वर्तमान में टीएलआर सिग्नलिंग 9 , 17 , 18 को रोकने के लिए नैदानिक रूप से बहुत कम यौगिकों उपलब्ध हैं। यह आंशिक रूप से प्रतिरक्षा होमोस्टेसिस और रोग विकृति में शामिल टीएलआर मार्गों की जटिलता और अतिरेक के कारण है। इसलिए, उपन्यास, पाटन के लिए खोजटी चिकित्सीय एजेंटों को कई टीएलआर सिग्नलिंग मार्गों को लक्षित करने के लिए मौलिक अंतराल को तोड़ सकता है, और क्लिनिक में टीएलआर अवरोधकों को आगे बढ़ाने की चुनौती को दूर कर सकता है।
नैनोसाइंस और नैनोटेक्नोलॉजी में तेजी से प्रगति के मामले में, नैनोविसेज उनकी अनूठी संपत्तियों 1 9 , 20 , 23 के कारण अगली पीढ़ी के टीएलआर मॉड्यूलर्स के रूप में उभर रहे हैं। नैनोस्केल आकार इन नैनो-चिकित्सीय विज्ञानों को बेहतर जैव-वितरण और निरंतर परिसंचरण 24 , 25 , 26 की अनुमति देता है । वांछित फार्माकोडायनेमिक और फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल 27 , 28 , 2 9 को पूरा करने के लिए उन्हें और अधिक कार्यात्मक बनाया जा सकता है। और रोमांचक रूप से, इन उपन्यासों की जैव-क्रियाएं उनके आंतरिक गुणों से उत्पन्न होती हैं, जिसे इनके लिए तैयार किया जा सकता हैएक चिकित्सीय एजेंट के लिए डिलीवरी वाहन के रूप में कार्य करने की बजाय, विशिष्ट चिकित्सा अनुप्रयोग। उदाहरण के लिए, एक उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) जैसे नैनोपेक्टिकल टीएलआर 4 लेगांड एलपीएस 23 को सफाई करके टीएलआर 4 सिग्नल को बाधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसके अलावा, हमने एक पेप्टाइड-सोना नैनोपार्टिकल संकर प्रणाली विकसित की है, जहां सजाया पेप्टाइड्स सोने की नैनोकणों की सतह के गुणों को बदल सकती हैं, और उन्हें विभिन्न जैव गतिविधियों 30 , 31 , 32 , 33 की अनुमति दे सकती है । इससे उन्हें अगली पीढ़ी के नैनो-चिकित्सा विज्ञान के रूप में दवा की एक विशेष श्रेणी (या "नैनो-ड्रग") बनाती है
इस प्रोटोकॉल में, हम पेप्टाइड-सोना नैनोपैर्टिकल (पेप्टाइड-जीएनपी) संकर के एक उपन्यास वर्ग की पहचान करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जो फागोसिटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं 32 में कई टीएलआर सिग्नलिंग पथ को असीमित रूप से रोक सकते हैं , </suP> 33 यह दृष्टिकोण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध THP-1 रिपोर्टर सेल लाइनों पर आधारित है। रिपोर्टर कोशिकाओं में दो स्थिर, प्रारंभिक रिपोर्टर निर्माण होते हैं: ट्रांसक्रिप्शन कारक एनएफ-κबी और एक्टिवेटर प्रोटीन 1 (एपी-1) द्वारा एक प्रेरक के अनुयायी नियंत्रण में एक सिक्रेटेड भ्रुण क्षारीय फॉस्फेट (एसईएपी) जीन किया जाता है; दूसरे में इंटरफेरॉन नियामक कारकों (आईआरएफ) द्वारा अनुमोदित प्रमोटरों के नियंत्रण में एक गुप्त लुसिएफेज़ रिपोर्टर जीन शामिल है। टीएलआर उत्तेजना पर, संकेत पारगमन एनएफ-κबी / एपी-1 और / या आईआरएफ के सक्रियण की ओर जाता है, जो रिपोर्टर जीन को गुप्त सीएपी और / या ल्यूइफेरेज़ में बदल देता है; ऐसी घटनाओं को आसानी से स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या ल्यूमिनमीटर के साथ उनके संबंधित सब्सट्रेट अभिकर्मकों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। पेप्टाइड-जीएनपी संकर की हमारी पहले से स्थापित पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने सीसा उम्मीदवारों को पहचान लिया है जो टीएलआर 4 सिग्नलिंग पथ को पूरी तरह से बाधित कर सकते हैं। लीड पेप्टाइड के निरोधात्मक गतिविधि-जीएनपी संकर तब immunoblotting के एक और जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग करके मान्य किया गया, और अन्य टीएलआर मार्गों पर मूल्यांकन किया गया। यह दृष्टिकोण टीएलआर सिग्नलिंग मार्गों को लक्षित करने वाले उपन्यास एजेंटों के तेज, प्रभावी स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि टीएलआर कई भड़काऊ बीमारियों के रोगजनन में शामिल हैं, इसलिए वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और सूजन परिस्थितियों के मॉड्यूलेशन के लिए चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा है। हालांकि, टीएलआर सिग्नलिंग …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक शंघाई संस्थानों के उच्च शिक्षण (एचवाई), शंघाई प्रथम पीपुल्स हॉस्पिटल (एचवाई) से शुरू होने वाले फंड, विशेष रूप से शंघाई जियाओटोंग से गॉफ़ेंग क्लिनिकल मेडिसिन ग्रांट सहायता में विशेष नियुक्ति (पूर्वी विद्वान) के प्रोफेसर के लिए कार्यक्रम से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं। यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (एचवाई), और क्रोहन और कोलाइटिस फाउंडेशन ऑफ़ कनाडा (सीसीएफसी) (एसईटी एंड एचवाई) से फंडिंग।
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
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