Måling In Vivo ændringer i ekstracellulær neurotransmittere under naturligt belønne adfærd i kvindelige syriske hamstere

Summary

Dette papir beskriver brugen af faste potentiale amperometric optagelser ved hjælp af kulfiber elektroder og enzymatiske biosensor teknologi til at måle frigivelsen af dopamin og glutamat med høj tidsmæssige opløsning under naturlige givende adfærd i den kvinde hamster.

Abstract

Evnen til at måle neurotransmitter frigivelse på en hurtig tidsskala giver mønstre af neurotransmission at være knyttet til specifikke adfærd eller manipulationer; et kraftfuldt værktøj i belyse underliggende mekanismer og kredsløb. Mens teknikken med mikrodalyse har været anvendt i årtier til at måle næsten alle analysand af interesse i hjernen, er denne teknik begrænset i tidsmæssig opløsning. Alternativt, hurtig scanning cyklisk voltammetry er både tidsligt præcis og yderst følsomme; men fordi denne teknisk vanskeligt metode bygger på electroactivity af analysand af interesse, mulighed for at opdage nonelectroactive stoffer (fx, neurotransmitteren glutamat) er elimineret. Dette papir beskriver brugen af en turn-key system, der kombinerer fast potentiale amperometry og enzymatisk biosensing at måle både electroactive og nonelectroactive neurotransmittere med tidsmæssige præcision. Parring af disse to kraftfulde teknikker giver mulighed for måling af både tonic og phasic neurotransmission med relativ lethed, og giver mulighed for optagelse af flere neurotransmittere samtidigt. Formålet med dette manuskript er at demonstrere proces til måling dopamin og glutamat neurotransmission i vivo ved hjælp af et naturligt givende adfærd (dvs., seksuel adfærd) i kvindelige hamstere, med det endelige mål at vise den tekniske gennemførlighed af denne analyse for at undersøge andre adfærd og eksperimenterende paradigmer.

Introduction

Evnen til at måle neurotransmitter frigivelse i vågen opfører dyr giver forskere at knytte bestemte funktionsmåder med rumlige og tidsmæssige mønstre af neurotransmission-et kraftfuldt værktøj til at undersøge mekanismerne og kredsløb underliggende både naturlige og operant adfærd i realtid. Historisk set har været mikrodalyse ansat til at måle elektrisk reaktive og nonreactive stoffer i det ekstracellulære miljø af hjernen¹. Denne teknik bruger en kontinuerlig strøm af en vandig opløsning af lignende ionisk komposition til den ekstracellulære væske, gennem en mikrodalyse sonde består af en lille aksel med tip af en semipermeable hule fiber membran². Efter indføring af sonden neurotransmittere eller andre analysander interesse kan krydse den semipermeable membran ved passiv diffusion før opsamles med mellemrum til efterfølgende analyse af high-performance væskekromatografi (HPLC), en analytisk kemi teknik almindeligt udnyttet til at adskille, identificere og kvantificere komponenter i en heterogen blanding³.

Selv om mikrodalyse er en følsom teknik, der kan bruges til at måle næsten alle analysand af interesse, er den tidsmæssige opløsning lav, med maksimal prøveudtagning satser på rækkefølgen minutter til snese minutter^1,2. Opfindelsen af hurtig scanning cyklisk voltammetry (FSCV), en teknik, der er afhænger af redox potentiale af electroactive arter, kan belyse nær øjeblikkelige koncentrationer af analysand af interesse i den ekstracellulære væske. I korte træk (Se Robinson et al. ⁴ for en omfattende revision), en elektrode er anvendt til at hæve og sænke spændingen i en trekantet bølge mode på en hurtig tid skala⁴. Når spændingen er i det korrekte område, er sammensatte af interesse gentagne gange oxideret og reduceret. Denne oxidation og reduktion af resultaterne i en bevægelse af elektroner, der skaber en lille vekselstrøm. Skan satser finder sted på de lynhurtige skala med oxidation og reduktion af forbindelser forekommer i mikrosekunder. Ved at fratrække baggrunden nuværende lavet af sonden fra den resulterende strøm, kan man generere en spænding vs nuværende plot unikke for hvert stof. Da tidsskala af spænding svingninger er kendt, kan disse data bruges til at beregne et plot af strømmen som funktion af tiden. De relative koncentrationer af stoffet kan således bestemmes som antallet elektroner overført i hver oxidation og reduktion reaktionen er kendt⁴.

Denne kemiske specificitet og høj tidsmæssige opløsning gør FSCV en kraftfuld teknik til påvisning af skiftende kemiske koncentrationer i vivo. Men trods disse mangfoldige fordele, denne teknik kræver omfattende tekniske ekspertise og dyrt udstyr og installation. Yderligere, nonelectroactive neurotransmittere (fx, glutamat) ikke kan måles ved hjælp af denne teknik. Heldigvis, teknologiske fremskridt inden for elektrokemi⁵, samt kommercialisering af disse opfindelser, har indført en relativt enkel metode at måle ikke-electroactive neurotransmittere i vågen opfører dyr uden at kompromittere tidsmæssige præcision-en teknik kendt som enzymatisk biosensor teknologi. Denne teknik bruger enzymatisk omdannelse af nonelectroactive neurotransmitter af interesse til to substrater, hvoraf den ene er electroactive hydrogenperoxid, som er opdaget som en amperometric oxidation aktuelle genereret af en anvendt potentiale⁵ . Kommercielt tilgængelige biosensor sonder måle (Se figur 1) selektivt analysander interesse af konkurrencedygtige reduktion af endogene interferents bidrag. I tilfælde af glutamat, er bidrag af den fælles interferent ascorbinsyre (AA) konkurrencedygtige reduceret til den målte aktuelle af co lokalisering AA oxidase aktive enzymatisk overfladen af sensor, konvertere AA til ikke-electroactive dihydroascorbate og vand. Desuden udelukker en negativt ladede Nafion polymer lag findes under laget enzym endogene anioniske stoffer.

Denne samme biosensor eksperimentel opsætning kan måle electroactive neurotransmittere som i FSCV, men i stedet den beskæftiger en fast-potential optagelse⁶. I modsætning til den oscillerende spænding i FSCV i en fast-potential optagelse holdes spændingen på redox potentiale for analysanden af interesse. Selv om det er mindre kemisk selektiv end FSCV som flere neurotransmittere kan have den samme redox potentiale, i områder i hjernen der overvældende vride i retning af en neurotransmitter, opvejer turn-key arten af denne tilgang manglen på kemiske specificitet.

Evnen til at måle både electroactive og nonelectroactive neurotransmitter frigivelse i nær real-time og knytte den til specifikke adfærdsmæssige begivenheder giver mulighed for at undersøge konvergerende neurotransmitter frigivelse. Dette manuskript detaljer brugen af dette system til at afhøre både dopamin og glutamat neurotransmission reaktion på naturlige belønning i vågen opfører hamstere. Formålet med dette papir er for detaljer processen at måle denne neurotransmitter frigivelse under seksuel adfærd hos kvindelige hamstere, med mål at demonstrere dens gennemførlighed for at undersøge andre adfærd og eksperimenterende paradigmer.

Hamstere er en ideel model for brug i elektrokemiske optagelser
Historisk, har rotter og mus modeller været ansat i studiet af seksuel adfærd. Disse gnaver arter indgå i et dynamisk copulatory sekvens, der involverer mange kvindelige solicitation adfærd, der omfatter hopping, stod og øre wiggling for at lokke den mandlige at jage og i sidste ende montere den kvindelige⁷. Montering af mandlige (med eller uden vaginal penetration) varer kun et par sekunder, hvorunder kvindelige engagerer sig i sin seksuelle adfærd kropsholdning (betegnes lordosis) også kun i et par sekunder før du genoptager aktive solicitation adfærd. Dette mønster af adfærd, der består af høje niveauer af aktivitet afbrudt med korte perioder med immobilitet, er problematisk for måling neurotransmission i opfører dyr. Først, kan der være bevægelse artefakter i de amperometric optagelser, der er relateret til neurale aktivitet. For det andet er bevægelse forbundet med udgivelsen af særlige neurotransmittere i visse områder af hjernen. For eksempel, har dopamin frigivelse været koblet til bevægeapparatet aktivitet i dorsal og ventral striatum^8,9, en konstatering, der dannede grundlag for mikrodalyse målinger af dopamin efter psykostimulanser administration¹⁰. Fordi de kvinde-typiske solicitation adfærd i most gnavere indebærer høje niveauer af bevægeapparatet aktivitet, og er repræsenteret af hovedparten af en 10 minutters seksuel adfærd test, det gør det vanskeligt at tillægge de eksplicitte komponenter af seksuel adfærd, der kollektivt vare kun ændringer i neurotransmission minutter.

For at analysere de neurokemiske profil af kvindelige seksuelle adfærd, opsøgte denne øvelse en art, hvor der er minimal bevægeapparatet aktivitet ledsager seksuel adfærd. Den copulatory sekvens i syriske hamstere (Mesocricetus auratus) er ideel til neurokemiske optagelser på grund af manglende solicitation adfærd ses typisk hos rotter og mus¹¹. Som en konsekvens, vil kvindelige hamstere indtaste og vedligeholde lordosis kropsholdning for op til 9 minutter ud af 10 minutters test session¹². Med manglen på uvedkommende bevægeapparatet bevægelser af den kvindelige, i vivo kan elektrokemiske optagelser, der kan være forbundet med komponenter af seksuelle interaktioner med mandlige opnås.

Copulatory anfald i hamstere
Efter indførelsen af en mandlig stimulus dyr i test kammer, vil hannen i første omgang deltage i anogenitale undersøgelse (AI) af kvindelige før montering hendes (fig. 2A). For at den mandlige at montere, kvindelige må påtage sig en modtagelig seksuel kropsholdning kendt som lordosis, hvori hun buer ryggen og afbøjer sin hale, så at montering mand kan få penis adgang til hendes vagina. Hannen vil montere kvinde, knugede hende bagfjerdinger med begge poter (figur 2B), og begynde frådede i et forsøg på at få penis intromission (figur 2C). Hannen vil montere kvinde (uden indsættelse) samt intromit et antal gange før til sidst at opnå ejakulation. Denne sekvens af mounts og intromissions fører til sædafgang kaldes en "copulatory bout". Mænd vil have flere copulatory anfald inden for en enkelt session.

Protocol

alle procedurer, der beskrives her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af The University of Minnesota, og er i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr ¹³ .

1. dyr og Cannulation kirurgi

1. Hent syriske hamstere fra en fælles animalske leverandør til ca. 55 dage med alder.
   Bemærk: Selv om en alder af dyr vil variere på grund af begrænsninger af forskellige eksperimentelle paradigmer, seksuel adfærd er det vigtigt at få seksuelt modne dyr, der er alle cirka samme alder.
2. Hus dyr i en kontrolleret temperatur (22 ° C) og belysning (14 h lys efterfulgt af 10 h mørk med lys ud på 13:00 h) miljø, med mad og vand tilgængelig ad libitum undtagen i perioder med eksperimentel afprøvning.
   Bemærk: Da hamstere sæsonkorrigerede reproducere, denne 14:10 lys/mørke cyklus efterligner deres naturlige formering betingelser.
3. Efter en 1-ugers akklimatisering til laboratoriet, udføre aseptisk bilaterale ovariectomies og intrakraniel stereotaxisk cannulations under generel anæstesi (fx, pentobarbital), og administrere passende institutionelt-godkendt postoperativ smertestillende og antibiotika behandling som tidligere beskrevet ^{14 , 15}.
   Bemærk: For undersøgelse af seksuel adfærd, ovariectomies er nødvendigt at fjerne den endogene hovedkilde til seksuel hormoner, så dyrene kan være ensartet induceret til seksuel modtagelighed med udefrakommende hormon i overensstemmelse med den eksperimentelle tidslinje.
   1. For både dopaminerge og glutamatergic sonde implantation, stereotaxically implantat guide kanyler (0,7 mm diameter; figur 3) i området af interesse (f.eks. denne øvelse målrettet højre kernen accumbens (NAc)) som beskrevet i trinvis detaljer andetsteds ¹⁵.
      Bemærk: Selv om de fremlagte data er fra enkelt sensor optagelser af en glutamat eller dopamin sonde pr. dyr, dette system giver mulighed for simultan optagelse af op til 4 sensorer i et enkelt dyr; således, 1-4 kanyler kan implanteres ønskede eksperimentelle design og resultater.
      1. Bestemme implantat koordinaterne for det pågældende område, ved hjælp af et stereotaxisk atlas (f.eks. The Golden Hamster hjerne af Morin & træ), holde for øje at sensoren strækker sig 1 mm under kanylen ind i hjernevævet.
   2. Efter en kanyle er stereotaxically sænkes til den ønskede placering, dorsal-ventral, anbringer det til kraniet ved hjælp af en fælles landbrugspolitik konstrueret fra dental akryl, sikret med rustfrit stål knogleskruer og en plastik hoved mount ( figur 3 ; Se ¹⁵ for flere detaljer).
   3. Til carbon fiber test, Indsæt en referenceelektrode (350 μm diameter, 7.5 mm total længde) i de kontralaterale halvkugle.
      Bemærk: Et bestemt sted eller distance fra kanylen er ikke påkrævet; referenceelektroder kan placeres hvor som helst i de kontralaterale halvkugle, der er praktisk.

2. Biosensor og Carbon Fiber test

1. efter 1-uge af genopretning fra kirurgi, administrere hormon priming regime til at fremkalde seksuel modtagelighed.
   1. Indsprøjtes 10 µg af estradiol benzoate i 0,1 mL af bomuldsfrø olie subkutant (s.c.), cirka 48 timer og 24 timer før seksuel adfærd test, for at fremkalde seksuel modtagelighed over for de mandlige ¹¹.
   2. Indsprøjtes 500 µg af progesteron i 0,1 mL af bomuldsfrø olie, s.c., 4 h før indførelsen af den mandlige at fremkalde seksuel modtagelighed ¹¹.
2. Tester alle dyr i starten af den mørke fase af deres daglige cyklus, som sociale adfærd af gnavere er underlagt ændring under hvide lys og røde lys test betingelser ^{16 , 17 , 18}.
3. for enzymatisk biosensor glutamat test, kalibrere sensorer i vitro ( figur 4) før brug som tidligere beskrevet ^{15 , 19}.
   1. gøre kalibrering løsninger friske dag af test i 20 mL glas centrifugeres rør. Den analysand løsning, opløses 7,4 mg af L-glutaminsyre til 10 mL af ultra-rene H ₂ O ved forsigtigt invertering af røret. Gør den interferent løsning ved at opløse 176.1 mg AA i 10 mL af ultra-rene H ₂ O.
   2. Sæt op til kalibrering ved at placere en magnetomrører på basis af en grundlæggende lab ring stand. En 20-mL dobbeltvægget anbringes på magnetomrørerpladen, og klemme på plads ved hjælp af en mellemlang 2-ben klemme.
      1. Tilføj opsigt magnetiske bar og 20 mL af 100 mM phosphat bufferet saltvand (PBS) i det dobbeltvæggede bægerglas. Tilslut dobbeltvægget bægerglasset til en cirkulerende vandbad til at opvarme stødpudeopløsning til 37 ° C.
         Bemærk: Enzymatisk biosensor kalibreringer skal udføres ved kropstemperatur, da enzymatisk aktivitet er påvirket af temperaturen.
   3. At placere sensor calibration indehaveren på toppen af det dobbeltvæggede bægerglas, og angive en 4-kanals kalibrering forforstærker på toppen, sikring på plads ved hjælp af en retvinklet klemme. Tilslut forforstærker til en data conditioning og erhvervelse enhed til at optage kalibreringsdata.
   4. Test følsomheden af hver enzymatisk biosensor glutamat (eller andre analysander af interesse for andre kommercielt tilgængelige biosensor sonder f.eks. glukose) før den eksperimentelle optagelse ved at placere sonden i kalibrering holderen på toppen af en dobbeltvægget bægerglas, nedsænkning sensing hulrummet og nogle del af sølv chlorid (AgCl) reference ledning i stødpudeopløsning.
      1. , Før du tilslutter hver sensor (op til 4) bliver testet til en port på en 4-kanals kalibrering forforstærker, indlede en ny optagelse på computer interface udnytte gratis downloades erhvervelse software. Tillad sensorer til at nå frem til en stabil basislinje.
   5. Begynde at tilføje analysand injektioner, når sensorerne har nået en stabil basislinje. Brug hullet i kalibrering indehaveren til at indføre en pipette tip til stødpudeopløsning. Brug værktøjet quick vigtige anmærkninger i optagelse software for at anmærke ved en injektion.
      1. Gøre 10 µM tilføjelser af glutamat af pipettering 40 μL af analysand løsning i stødpudeopløsning. Vent for sensoren at stabilisere mellem tilføjelser. Tilføje 3 injektioner af analysand løsning før du tilføjer en enkelt injektion fra interferent AA løsning (50 μL Injektionsvolumen for 250 μM ændring i koncentration).
         Bemærk: Kalibreringen giver mulighed for konvertering af ændringer i det amperometric signal (set under den enzymatiske eksperimentelle optagelse i trin 2.12) til ændringer i glutamat koncentration, hvis det ønskes. Se reference ¹⁵ for trinvis instruktion. De dopaminerge sonder anvendes af denne øvelse er kalibreret under fremstillingsprocessen af den kommerciel udbyder. Glutamat sonder skal kalibreret på tidspunktet for brug, som deres følsomhed kan falde over tid, så de enzymatiske bestanddele nedbrydes ¹⁹. Fordi kulfiber elektroderne ikke undergår nedbrydning, er kalibreringen udføres af firmaet inden afsendelse tilstrækkelig langs som tHer er en øget sandsynlighed for at beskadige den tynde kulfiber (350 μm diameter) gennem yderligere håndtering.
4. Linje testkammeret med sengetøj taget fra dyret ' s hjem bur.
   Bemærk: Dette øger kvindelige ' s fortrolighed med test kammer, såvel som udsætter mand til seksuelt stimulerende olfaktoriske parring stikord, der blev distribueret af kvindelige svar på estradiol behandling.
5. Let bedøver dyr før indsættelse af sonden af enten isofluran eller en anden flygtige anæstesi i en induktion afdeling.
6. Fjerne den okklusiv obdurator fra guide kanyle, og Indsæt enten kulfiber elektrode eller enzymatisk sonde gennem guide skaft.
7. Efter sonde indsættelse, placere dyret i den test afdeling.
   Bemærk: Denne øvelse bruger en 10-gal glas akvarium (24,5 x 48,9 x 29.4 cm), men runde kamre i samme område kan også være ansat.
8. Begynde optagelse video og tid-låst amperometric signalet i en kommercielt tilgængelig softwareprogram, beskrevet i detaljer andetsteds ¹⁵.
9. Forbinde sensoren til optagelse system: potentiostat via en elektrisk skærmet kabel og en elektrisk swivel. Stabilisere sensor forbindelsen ved at skrue en pin vedhæftet fil på hovedet mount. Styrke forbindelsen ved hjælp af lab film, hvis nødvendigt.
   Bemærk: En tilpasset stik er nødvendigt at tillægge potentiostat, både kulfiber elektrode og referenceelektrode, mens enzymatisk glutamat sensorer kan tilsluttes direkte til potentiostat.
10. Tillade sensor til Reagensglasset i hjernen før eksperimentel testning.
    Bemærk: Ækvilibrering gange varierer afhængigt af optagelse sensor (f.eks. enzymatisk sensorer kræver 2-4 h ækvilibrering, mens kulfiber elektroder kun kræve ca 30 min). Hvis begge typer af sensorer er implanteret, Blandingen henstår i enzymatisk sensor længere.
11. Efter sensor ækvilibrering, indføre en stimulus mand i den test afdeling.
12. Efter den første mount med penis indsættelse (benævnte intromission) af stimulus mand, fortsætte optagelsen til en yderligere 10-30 min, afhængig af de eksperimentelle mål.
13. Efter adfærdsmæssige tester, afbryde kvindelige ' s sensor.
14. Fjerne begge hamstere fra den test kammer. Fjerne strøelse og rengøre kammeret med 70% ethanol.
    Bemærk: På grund af den korte ækvilibrering kræves for kulfiber optagelser, trin 2.3-2.14 kan gentages til at teste flere dyr i den samme dag. Derimod fordi enzymatisk sensorerne kræver omkring 4 h af ækvilibrering, teste kun ét dyr pr. dag at begrænse mulige indbyrdes underlagt variation skyldes forskelle i dyrenes ' døgnrytmen tid på test.

3. Offer og Perfusion

1. efter indgåelsen af testperioden, dybt bedøver den kvindelige testpersonen med en euthanizing agent (f.eks. denne øvelse bruger en intraperitoneal injektion af 0,2 mL phenytoin og pentobarbital opløsning) .
2. Transcardially perfuse dyr med 25 mM PBS, pH 7,6, fjerne alle cirkulerende blod, efterfulgt af en 20 min fiksering ved hjælp af 4% PARAFORMALDEHYD-PBS.
3. Fjerne hjernen og postfix i ~ 30 mL 4% PARAFORMALDEHYD løsning i en 50 mL konisk slange natten over.
   1. Store hjerne i en 10% saccharose-PBS løsning indtil klar til seriel afsnit.
      Bemærk: Hjerner kan lagres til 2-uger, med ugentlige saccharose løsning ændringer for at undgå potentielle vækst af forureninger.
4. Seriel afsnit hjernen i 40 µm skiver gennem regionen implanterede med enten en indefrysning mikrotomen eller kryostaten som tidligere beskrevet ¹⁹.
5. Montere skiver seriefremstillede på kommercielt tilgængelige lim-belagt dias (eller se ²⁰ at gøre). Tillad for at tørre mindst natten.
6. Pletten dias med cresyl violet farve, klar, og coverslip som tidligere beskrevet ²⁰.
7. Billede dias ved hjælp af lysfelt mikroskopi til at bekræfte den anatomiske placering af sensoren.

4. Adfærdsmæssige kodning

1. Se og anmærke videoer ved hjælp af gratis kommercielt downloades software (Se Tabel af materialer) i slowmotion at netop kode adfærd tid låst til amperometric signal.
   Bemærk: At bruge MATLAB kode i analysen (Se under ), anmærke start og slutningen af hver af kvindelige ' s og mandlige ' s opførsel.
   1. Opret note startLordosis i rammen, når kvindelige indleder en dorsoflexion af ryggen og mangler sin hale opad. Anmærke endLordosis når kvindelige afslutter denne kropsholdning, som ofte opstår, når kvindelige justerer til en anden placering i den test kammer.
   2. Anmærke startAI når hunnen er i lordosis kropsholdning og mandlige flytter sin snude mod kvindelige ' s anogenitale region, hvor snuse, slikke eller nuzzling af hendes bækkenbunden regionen kan forekomme. Anmærke endAI når mandlige fjerner sin snude fra nærhed til kvindelige ' s anogenitale region.
   3. Anmærke startMount når hannen nærmer sig og placerer sin forepaws på kvinder i en montering kropsholdning, uanset orientering af mount forsøg (f.eks., side, rump).
   4. Anmærke startIntromission når vellykket frådede opnår den monterede mandlige penis adgang til kvindelige ' s vagina.
      Bemærk: En intromission er behaviorally kan skelnes fra den monterede frådede, der opstår før intromission, som mandlige synligt trækker sine arme mod sin krop, kaster sin bækkenet frem og krøller sin hale opad, med angivelse af penetration (Se < stærk class = "xfig" > figur 4 C).
      1. Når det er relevant, anmærke sædafgang.
         Bemærk: I slutningen af en parring bout og sammen med en vellykket intromission hannen vil ejakulere. Selvom man er i stand til at visualisere den faktiske emission, mandlige hamstere har karakteristisk trampede bevægelse med deres bagben fod under en intromission ²¹, således anmærke sædafgang på forekomsten af mund bevægelighed.
   5. Anmærke endIntromission og endMount samtidig i stellet, når hannen har fjernet to forpoterne og således har ingen kontakt med kvindelige. På grund af den hyppige manglende evne til at visualisere hans tilbagetrækning, samtidige kode disse to opførsel til at tillade konsistens og pålidelighed på tværs af parring anfald.
      Bemærk: En parring bout enten følger en vellykket sædafgang eller er når kvindelige bryder lordosis kropsholdning efter mindst én mount.

5. Eksempel dataanalyse

Bemærk: brugen af faste potentiale kulfiber og enzymatiske optagelser til dopamin ennd glutamat, henholdsvis, giver mulighed for evnen til at måle både tonic og phasic mønstre af elektrokemiske frigivelse. Denne øvelse bruger en gratis, kommerciel erhvervelse system og software til at optage og konvertere indspillet signaler fra analog til digital (bias 0.600 V, samplingfrekvens = 1 Hz).

1. Beskrivelse af eksempel data analyse protokol
   1. selv om andre programmer kan bruges, kvantificere tonic og phasic (forbigående) ændringer i den registrerede elektrokemiske signal ved hjælp af MATLAB.
      1. Til de præsenterede data, beregne tonic signal ved hjælp af en 50-punkt bevægeligt gennemsnit filter. En transient-only normaliseret gengivelse af signalet blev beregnet ved at fratrække tonic signalet fra de rå data. Når du identificerer phasic toppe, der er forskellige algoritmisk muligheder (f.eks. mærkning toppe som ændringer i signalet mere end 1 SD over middelværdien).
      2. Visitering af toppene, dvs, lokale maxima, fra den normaliserede signal ved hjælp af MATLAB funktion peakfinder med minimum peak amplitude angivet til kvadratiske af signalet. Placeringen af toppe opdaget fra den normaliserede signal blev brugt til at udtrække amplitude fra hver top. Evnen til at opdage toppe giver mulighed for identifikation af enhver tid-låst adfærd, der kan være sammenfaldende med, eller køre den relative peak i de neurokemiske under efterforskning.
   2. Segment de behandlede data i overensstemmelse med de adfærdsmæssige anmærkninger (Se trin 3), en studerendes ' s t-test blev anvendt til at vurdere forskelle i tonic neurotransmitteren niveau, forekomst af transienter og amplituden af transienter i løbet af de pre parring bout lordosis versus lordosis under parring anfald. For at måle ændringer i tonic mønstre af elektrokemiske frigivelse, sammenlignet datapunkter opstår under positionen Lordosis direkte før en parring bout (dvs., før parring bout lordosis) med datapunkterne i en parring bout session ved hjælp af en t-test
2. Forberedelse af rå data for beskrevet data analyse protokol
   Bemærk: som nævnt, selv om andre programmer eller analyser kan være lige så levedygtige muligheder, før du kan bruge MATLAB kode beskrevet ovenfor, skal forberedes de rå data i følgende måde:
   1. eksportere filerne annotation og spænding. At gøre dette, under den ' fil ' fane, skal du vælge den ' eksport ' funktion og vælge den ' anmærkninger ' fane til at gemme anmærkningerne. Under den ' fil ' fane, skal du vælge den ' eksport ' funktion og vælge den " TSV ' tab for at gemme spænding målinger som en TSV forlængelse.
   2. Åbn hver fil med et regnearksprogram og Gem som ' xls/xlsx ' til at gøre filerne kompatible med MATLAB.
      Bemærk: For de ' anmærkning ' fil, der er flere anmærkninger, der skal manuelt tilføjet efter eksport i et regnearksprogram til at diktere start og afslutning af både den pre parring bout lordosis (kommenteret som PreMBlordorsis ) og den parring bout således at disse tidspunkter kan sammenlignes direkte, som nævnt i trin 5.1.2.
   3. Anmærke starten af den pre parring bout lordosis (startPreMBlordosis) på samme tid som en lordosis adfærd begynder (startLordosis) som også omfatter en mount adfærd, og også i starten af en ny parring bout hvis kvindelige forbliver i lordosis kropsholdning.
   4. Anmærke udgangen af den forud parring bout lordosis (endPreMBlordosis), når den første montere begynder.
   5. Anmærke start af en parring bout (startMB) på samme tid af endPreMBlordosis, som betyder starten på en parring bout.
   6. Anmærke slutningen af en parring bout (endMB) enten for enden af en mount der omfatter en ejakulation (Se trin 4.1.4.1), eller efter kvindelige ' s opsigelse af lordosis kropsholdning (endLordosis).

Representative Results

Ved hjælp af elektrokemiske og adfærdsmæssige kodning metode beskrevet ovenfor, begyndt denne lab at karakterisere både tonic og phasic udsving i både dopamin og glutamat under i vivo optagelser af seksuel adfærd. På grund af de tidsmæssigt præcise måde af denne metode, kan vi mere præcist beskrive neurotransmission under seksuel adfærd; samt tilskrive specifikke ændringer i version mønstre til tilsvarende tonic ændringer under parring anfald, og tilsvarende forbigående udsving under kvindens modtagelse af individuelle copulatory adfærd (f.eks., intromission, sædafgang) fra montering mand.

Specifikt, brugte vi denne metode til at fokusere på måling release mønstre af dopamin og glutamat i NAc separat dyr. NAc er et kritisk område involveret i belønning behandling²² og er blevet beskrevet som et integreret område på belønning aspekter af seksuel adfærd²³.

Vi observerede, at hunnerne under seksuel adfærd, viser en tonic stigning i dopaminerge niveauer i NAc kerne under parring anfald (figur 5). Mens ændringerne tonic er kan vist for alle parring anfald, den metode beskrevet ovenfor måle tonic ændringer mellem hver parring bout, og dermed øge den tidsmæssige identifikation af overordnede ændringer til tonic niveauer af neurotransmitter frigivelse i hele hele sessionen. Yderligere, denne beskrevne metode kan lokalisere phasic ændringer og tidsligt kort adfærd sandsynligvis forbundet med disse phasic neurotransmitter udsving. Specifikt, tyder disse foreløbige resultater på, at under parring anfald, dopaminerge transienter i NAc opstår i løbet af vaginal indsættelse (intromission) af mandlige (figur 6). Desuden, denne forening med intromission er specifikke, med ubetydelige dopaminerge svar til andre copulatory adfærd, såsom AI.

Et lignende mønster er blevet observeret i andre dyr med hensyn til glutamat udgivelse, med hurtige transienter, der svarer til individuelle intromissions i den dorsale NAc kerne under en copulatory bout (figur 7). Dette mønster er regionen specifikke, med ingen mærkbar signal forekommer i NAc shell eller mediale spiegelske af andre dyr.

Figur 1 : Enzymatisk Biosensor teknologi.
Standard fabrikation af kommercielt tilgængelige enzymatisk biosensor sonder, der registrerer neurotransmittere via enzym-medieret forarbejdning (venstre billedet). I tilfælde af glutamatergic sensorer, er glutamat oxidase ansat i den enzymatiske lag (billedet til højre) til at konvertere nonelectroactive neurotransmitter til electroactive hydrogenperoxid (H₂O₂), der registreres af oxidation på den Platinum-iridium (Pt-Ir) elektrode. Ascorbinsyre (AA), en fælles interferentet, der er oxideret på det samme potentiale, er udelukket via en tilføjelse af AA oxidase ved enzymatisk lag, der konverterer interferentet til nonelectroactive vand. Andre negative electroactive interferents stede i hjernen er udelukket via en passiv selektiv membran. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Komponenter af en Hamster parring Bout.
I hamstere består en parring anfald af en sekvens af copulatory adfærd, hvorunder kvindelige forbliver i immobile lordosis kropsholdning, mens den mandlige anogenitally undersøger (A), mounts (B), og opnår intromission (C). . Bemærk en intromission er behaviorally kan skelnes fra montering som mandlige trækker sine arme mod sin krop, kaster hans bækken frem, og krøller hans hale opad, med angivelse af penetration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Kraniet Cap konstruktion.
Guide kanyler, knogleskruer og dental akryl bruges i opbygningen af en kalot tillade indsættelse af carbon fiber eller enzymatisk sonde (Se¹⁵ for trinvis detaljer). Denne figur viser en enkelt kanyle implantat over den rigtige NAc for en enzymatisk sensor (ingen implanterede referenceelektrode) og plast hoved mount for sensor stabilitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Glutamat Biosensor kalibrering.
Følsomheden af hver biosensor til glutamat er testet in vitro- før eksperimentelle optagelse af 10 µm tilføjelser af glutamat (grøn) ved 37 ° C (da enzymatisk aktivitet er påvirket af temperaturen). Hver sensor er bekræftet for at være ikke-lydhøre over for ascorbinsyre (AA, red) eller dopamin (DA, blå). Denne kalibrering giver mulighed for konvertering af ændringer i det amperometric signal set under eksperimentelle optagelse til ændringer i glutamat koncentration.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Tonic øger i dopamin under en parring Bout.
A. stiliseret eksempel på premating bout lordosis signal vs parring bout lordosis signal. For at måle tonic dopamin frigivelse, blev amperometric svar til dopamin niveauer under lordosis før en parring bout (MB) sammenlignet med dem under en MB. Grå bokse angive lordosis før en MB. BlUE kasser indikere lordosis under en MB. B. repræsentative kvantitativ bestemmelse fra ét dyr sammenligne den gennemsnitlige spænding mellem preMB lordosis og MB lordosis. Fejllinjer angive standard fejl af middelværdien (SEM), og stjerne angiver signifikant forskel (p-værdi < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 : Repræsentant dopamin Trace.
Phasic frigivelsen af dopamin er tid-låst til intromissions fra mandlige i den dorsale NAc kerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7 : Repræsentant glutamat Trace.
Glutamat transienter svarer til individuelle intromissions fra mandlige i den dorsale NAc kerne under en udvidet seksuel oplevelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Selvom relativt ligetil, kan nogle problemer opstå når beskæftiger denne teknik. Først, sonderne stereotaxisk placering skal være præcis: i modsætning til mikrodalyse, der prøver en bredere radius af det ekstracellulære miljø omkring sonden, denne teknik kun tillader måling af en neurotransmitter, der kommer i direkte kontakt med sonden. For det andet for kulfiber-optagelse på grund af den lille bredde af fiber, brud kan opstå, og sonden skal indsættes med bevidst pleje. I tilfælde af glutamatergic biosensorer, kan Enzymatisk nedbrydning forekomme hvis sonden ikke anvendes inden for den garanterede tidsramme 3-uger. Heldigvis, alle disse spørgsmål er adresserbare, og kan elimineres med ordentlig pleje og opmærksomhed for detaljer.

Et potentielt problematiske caveat opstår i specificiteten af fast potentiale kulfiber optagelser. Fordi den anvendte potentiale for dopamin falder sammen med andre monoaminer, såsom noradrenalin, hvis optagelserne er foretaget i områder, der frigiver både neurotransmittere, end denne mangel på kemisk specificitet kan begrænse fortolkningen af resultaterne. I NAc udgør dette ikke et stort problem med dopamin er den primære catecholamin sender²⁴. Fordi omkring 98% af cellerne i NAc er mellemstore spiny neuroner, der reagerer på dopaminerge neurotransmission²⁴, signalet er forudindtaget mod påvisning af dopamin og letter brugen af denne mere turn-key tilgang.

En anden fordel ved denne enzymatiske biosensor og fast potentiale kulfiber optagelse system er at dual-sonde optagelser kan udføres, således at både electroactive og nonelectroactive neurotransmittere som dopamin og glutamat kan måles i samme dyr samtidigt. Selvom data præsenteres her kommer fra optagelser i separate dyr, kan disse teknikker være ansat samtidigt sådan, at man kan evaluere konvergens af neurotransmission i flere områder af hjernen eller i samme region bilateralt. Kombination af optagelser inden for samme dyr eller sammenligning af optagelser på tværs af dyr som vist her, er begge stærke værktøjer i belyse mekanismerne bag netværksforbindelser og signalering.

I sum viser dette papir de kraftfulde teknikker af enzymatiske biosensing og fast-potential optagelse til at måle flere electroactive og nonelectroactive neurotransmittere udnytter en enkelt eksperimentel opsætning. Skønt data præsenteres her kommer fra individuelle neurotransmitter optagelser på tværs af flere dyr, dette system giver mulighed for at optage fra op til 4 sensorer i ét dyr samtidigt¹⁵. Prøveresultater præsenteret kollektivt giver indsigt i hurtige neurotransmission i den kvindelige hamster som følge af specifikke mønstre af copulatory stimulation fra hannen. Yderligere, disse eksperimenter vise tid-låst svar af dopaminerge og glutamatergic transienter i NAc kernen i kvindelige intromission fra den mandlige, tyder på, at denne udgivelse kan være ansvarlig for kodning særskilte givende egenskaber seksuel adfærd. Vores mål er at fortsætte udnytter den parring mønster i kvindelige syriske hamstere at udvikle et mere omfattende billede af forholdet mellem i vivo dopamin og glutamat frigivelse og den underliggende kredsløb til individuelle komponenter af copulatory stimuli fra mandlige. Vi mener, at evnen til at karakterisere mønstrene af disse neurotransmittere ikke er kun gavnligt fra et grundlæggende videnskab perspektiv²³, men også i belyse mulige terapeutiske tilgange for patologisk former for belønning adfærd, sådan som narkotika afhængighed²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.