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Neuroscience

Vivo में मापने Extracellular न्यूरोट्रांसमीटर में स्वाभाविक रूप से पुरस्कृत व्यवहार के दौरान महिला सीरियाई हंसटर में परिवर्तन

Published: September 12, 2017 doi: 10.3791/56135
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota

Summary

इस पत्र का उपयोग करें फिक्स्ड क्षमता amperometric रिकॉर्डिंग कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड और एंजाइमी में प्राकृतिक पुरस्कृत व्यवहार के दौरान उच्च लौकिक संकल्प के साथ डोपामाइन और ग्लूटामेट की रिहाई को मापने के लिए प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए महिला हंसटर ।

Abstract

एक तेजी से समय पैमाने पर न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने की क्षमता neurotransmission के पैटर्न विशिष्ट व्यवहार या जोड़तोड़ से जोड़ा जा करने के लिए अनुमति देता है; elucidating अंतर्निहित तंत्र और सर्किट में एक शक्तिशाली उपकरण । जबकि microdialysis की तकनीक दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है मस्तिष्क में रुचि के लगभग किसी भी analyte उपाय, इस तकनीक लौकिक संकल्प में सीमित है । वैकल्पिक रूप से, तेजी से स्कैन चक्रीय voltammetry दोनों अस्थायी सटीक और अत्यंत संवेदनशील है; हालांकि, क्योंकि यह तकनीकी रूप से कठिन विधि ब्याज की analyte के electroactivity पर निर्भर करता है, nonelectroactive पदार्थों का पता लगाने की संभावना (जैसे, न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट) समाप्त हो जाता है । यह कागज एक टर्नकी प्रणाली है कि फिक्स्ड-संभावित amperometry और एंजाइमी संवेदन दोनों electroactive और लौकिक परिशुद्धता के साथ nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर उपाय को जोड़ती है का उपयोग विवरण । इन दो शक्तिशाली तकनीकों के बाँधना रिश्तेदार आसानी से दोनों टॉनिक और चरणबद्ध neurotransmission की माप के लिए अनुमति देता है, और एक साथ कई न्यूरोट्रांसमीटर की रिकॉर्डिंग परमिट. इस पांडुलिपि का उद्देश्य एक स्वाभाविक रूप से पुरस्कृत व्यवहार का उपयोग vivo में डोपामाइन और ग्लूटामेट neurotransmission को मापने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए है (यानी, महिला हंसटर में यौन व्यवहार), प्रदर्शित करने के अंतिम लक्ष्य के साथ अंय व्यवहार और प्रायोगिक मानदंड की जांच के लिए इस परख के तकनीकी व्यवहार्यता ।

Introduction

को जगाए व्यवहार पशुओं में न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने की क्षमता शोधकर्ताओं neurotransmission के स्थानिक और लौकिक पैटर्न के साथ विशिष्ट व्यवहार लिंक करने के लिए अनुमति देता है-तंत्र और सर्किट दोनों अंतर्निहित की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण दोनों प्राकृतिक और वास्तविक समय में व्यवहार अनुकूलन । ऐतिहासिक रूप से, microdialysis मस्तिष्क के extracellular वातावरण में दोनों बिजली प्रतिक्रियाशील और प्रतिक्रियात्मक पदार्थों को मापने के लिए नियोजित किया गया है1। इस तकनीक extracellular द्रव के लिए समान ईओण संरचना का एक जलीय समाधान के एक सतत प्रवाह का उपयोग करता है, एक microdialysis एक semipermeable खोखले फाइबर झिल्ली2से बना टिप के साथ एक छोटी सी शाफ्ट से बना जांच के माध्यम से । जांच, न्यूरोट्रांसमीटर या ब्याज की अन्य analytes के सम्मिलन के बाद उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा बाद में विश्लेषण के लिए अंतराल पर एकत्र किया जा रहा से पहले निष्क्रिय प्रसार द्वारा semipermeable झिल्ली को पार कर सकते हैं, एक विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान तकनीक आमतौर पर अलग करने के लिए उपयोग की पहचान, और एक विषम मिश्रण में घटकों को बढ़ाता है3।

हालांकि microdialysis एक संवेदनशील तकनीक है कि वस्तुतः ब्याज की किसी भी analyte उपाय किया जा सकता है, लौकिक संकल्प कम है, मिनट के क्रम पर अधिकतम नमूना दरों के साथ मिनट के दसियों1,2। तेजी से स्कैन चक्रीय voltammetry के आविष्कार (FSCV), एक तकनीक है कि electroactive प्रजातियों की redox क्षमता पर निर्भर करता है, स्पष्ट द्रव में ब्याज की analyte के तात्कालिक सांद्रता के पास extracellular कर सकते हैं । संक्षेप में (देखें रॉबिंसन एट अल । एक व्यापक समीक्षा के लिए 4 ), एक इलेक्ट्रोड बढ़ाने के लिए लागू किया जाता है और एक तेजी से समय स्केल4पर एक त्रिकोणीय तरंग फैशन में वोल्टेज कम. जब वोल्टेज सही रेंज में है, ब्याज की चक्रवृद्धि बार ऑक्सीकरण और कम है । इस ऑक्सीकरण और इलेक्ट्रॉन की एक आंदोलन में कमी परिणाम है कि एक छोटी सी बारी वर्तमान बनाता है । स्कैन दर ऑक्सीकरण और microseconds में होने वाली यौगिकों की कमी के साथ उप दूसरे पैमाने पर जगह ले । परिणामस्वरूप वर्तमान से जांच के द्वारा बनाई गई पृष्ठभूमि वर्तमान घटाकर, एक एक मौजूदा एक यौगिक के लिए अद्वितीय साजिश बनाम एक वोल्टेज उत्पन्न कर सकते हैं. वोल्टेज दोलनों के समय पैमाने पर जाना जाता है के बाद से, इन डेटा समय के एक समारोह के रूप में वर्तमान के एक भूखंड की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, यौगिक के सापेक्ष सांद्रता एक ऑक्सीकरण और कमी प्रतिक्रिया में स्थानांतरित इलेक्ट्रॉनों की संख्या के रूप में लंबे समय के रूप में निर्धारित किया जा सकता है4जाना जाता है ।

इस रासायनिक विशिष्टता और उच्च लौकिक संकल्प FSCV vivo मेंरासायनिक सांद्रता बदलने का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बनाते हैं । हालांकि, इन कई गुना लाभ के बावजूद, इस तकनीक व्यापक तकनीकी विशेषज्ञता और महंगा उपकरण और सेटअप की आवश्यकता है । इसके अलावा, nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर (जैसे, ग्लूटामेट) इस तकनीक का उपयोग कर मापा नहीं जा सकता । सौभाग्य से, electrochemistry के क्षेत्र में तकनीकी प्रगति5, साथ ही इन आविष्कारों के व्यावसायीकरण, एक अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण को मापने के लिए शुरू की है गैर electroactive न्यूरोट्रांसमीटर व्यवहार पशु लौकिक परिशुद्धता समझौता किए बिना-एक तकनीक एंजाइमी के रूप में जाना जाता है । इस तकनीक के दो सब्सट्रेट में ब्याज की nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर के एंजाइमी रूपांतरण का उपयोग करता है, जिनमें से एक electroactive हाइड्रोजन पेरोक्साइड है कि एक amperometric ऑक्सीकरण वर्तमान एक लागू संभावित द्वारा उत्पन्न के रूप में पाया जाता है5 . व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संवेदी जांच ( चित्र 1देखें) अंतर्जात के योगदान को प्रतिस्पर्धी रूप से कम करके रुचि के analytes को चुनिंदा माप देता है । ग्लूटामेट के मामले में, आम दिग्दर्शन ascorbic एसिड (ए. ए.) के योगदान प्रतिस्पर्धात्मक रूप से मापा वर्तमान करने के लिए सक्रिय एंजाइमी सतह संवेदक के पर सह-स्थानीयकृत aa oxidase द्वारा कम है, ए. ए.-electroactive परिवर्तित dihydroascorbate और पानी । इसके अलावा, एक नकारात्मक एंजाइम परत के तहत वर्तमान Nafion बहुलक परत चार्ज अंतर्जात anionic यौगिकों शामिल नहीं है ।

यह वही एक प्रकार का संवेदी प्रयोगात्मक सेटअप FSCV में के रूप में electroactive न्यूरोट्रांसमीटर उपाय कर सकते हैं, लेकिन इसके बजाय यह एक निश्चित-संभावित रिकॉर्डिंग6काम. FSCV में लागू दोलन वोल्टेज के विपरीत, एक निश्चित क्षमता रिकॉर्डिंग में वोल्टेज ब्याज की analyte के लिए redox क्षमता पर रखा जाता है । हालांकि यह कम रासायनिक FSCV की तुलना में चयनात्मक के रूप में कई न्यूरोट्रांसमीटर एक ही redox क्षमता हो सकता है, मस्तिष्क क्षेत्रों में है कि भारी एक न्यूरोट्रांसमीटर की ओर विषम, इस दृष्टिकोण की बारी-प्रमुख प्रकृति रासायनिक की कमी का वजन विशिष्टता.

के पास वास्तविक समय में दोनों electroactive और nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने और विशिष्ट व्यवहार की घटनाओं के लिए यह लिंक करने की क्षमता converging न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की जाँच करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है. इस पांडुलिपि विवरण इस प्रणाली के उपयोग के लिए दोनों डोपामाइन और ग्लूटामेट neurotransmission में प्राकृतिक इनाम के जवाब में पूछताछ करने के लिए । इस कागज का उद्देश्य विस्तार करने के लिए महिला हंसटर में यौन व्यवहार के दौरान इस न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने की प्रक्रिया है, अन्य व्यवहार और प्रायोगिक मानदंड की जांच के लिए अपनी व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लक्ष्य के साथ.

हंसटर विद्युत रिकॉर्डिंग में उपयोग के लिए एक आदर्श मॉडल है
ऐतिहासिक रूप से, चूहे और चूहों के मॉडल यौन व्यवहार के अध्ययन में नियोजित किया गया है । इन कुतर प्रजातियों एक गतिशील copulatory अनुक्रम में संलग्न, कई महिला याचना व्यवहार शामिल है कि hopping, डार्टिंग, और कान के लिए पीछा करने के लिए पुरुष को लुभाने के लिए और अंत में महिला7माउंट के लिए उतारना । पुरुष द्वारा बढ़ते (के साथ या योनि प्रवेश के बिना) केवल कुछ ही सेकंड रहता है, जिसके दौरान महिला उसे यौन व्यवहार मुद्रा में संलग्न है ( अग्रकुब्जताशब्द) भी केवल कुछ ही सेकंड के लिए सक्रिय कानूनन व्यवहार शुरू करने से पहले । व्यवहार का यह पैटर्न, गतिशीलता की संक्षिप्त अवधि के साथ गतिविधि interspersed के उच्च स्तर से बना, जानवरों बर्ताव में neurotransmission को मापने के लिए समस्याग्रस्त है. सबसे पहले, वहां amperometric रिकॉर्डिंग है कि तंत्रिका गतिविधि के लिए असंबंधित है में आंदोलन कलाकृतियों हो सकता है । दूसरा, गतिवान कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों में विशेष न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई के साथ जुड़ा हुआ है. उदाहरण के लिए, डोपामाइन जारी पृष्ठीय और ventral striatum8,9में हरकत गतिविधि को युग्मित किया गया है, एक खोज है कि डोपामाइन निम्नलिखित psychostimulant के microdialysis माप के लिए आधार का गठन प्रशासन10. क्योंकि महिला-राज्यमंत्री में ठेठ याचना व्यवहारt कुतर हरकत गतिविधि के उच्च स्तर शामिल है, और एक 10 मिनट के यौन व्यवहार की परीक्षा के थोक द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, यह यह कठिन यौन व्यवहार के स्पष्ट घटकों के लिए neurotransmission में परिवर्तन परमशॆवर है कि केवल पिछले मिनट.

महिला यौन व्यवहार के neurochemical प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए, इस प्रयोगशाला बाहर यौन व्यवहार के साथ कम हरकत गतिविधि है जिसमें एक प्रजाति की मांग की । सीरियाई हंसटर में copulatory अनुक्रम (Mesocricetus auratus) याचना व्यवहार की कमी के कारण आम तौर पर चूहों और चूहों में देखा11neurochemical रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श है । एक परिणाम के रूप में, महिला हंसटर में प्रवेश और 9 मिनट के ऊपर के लिए अग्रकुब्जता मुद्रा बनाए रखने के एक 10 मिनट के परीक्षण सत्र12से बाहर होगा । महिला द्वारा बाहरी हरकत आंदोलनों की कमी के साथ, जो पुरुष के साथ यौन बातचीत के घटकों के साथ संबद्ध किया जा सकता है vivo विद्युत रिकॉर्डिंग में प्राप्त किया जा सकता है ।

हंसटर में Copulatory डटकर
परीक्षण कक्ष में एक पुरुष उत्तेजना जानवर की शुरूआत के बाद, पुरुष शुरू में उसे (चित्रा 2) बढ़ते पहले महिला के anogenital जांच (एअर इंडिया) में संलग्न होगा । आदेश में पुरुष के लिए माउंट करने के लिए, महिला एक ग्रहणशील यौन अग्रकुब्जता के रूप में जाना जाता है, जिसमें वह उसे वापस मेहराब और उसकी पूंछ इतना है कि बढ़ते पुरुष उसकी योनि के लिए शिश्न का उपयोग हासिल कर सकते है के रूप में जाना जाता मुद्रा ग्रहण करना चाहिए । पुरुष महिला माउंट, दोनों पंजे के साथ उसके hindquarters (चित्रा 2बी) अकवार, और एक शिश्न intromission (चित्रा 2सी) हासिल करने के प्रयास में जोर शुरू करते हैं । पुरुष (प्रविष्टि के बिना) के रूप में अच्छी तरह से अंततः स्खलन को प्राप्त करने से पहले कई बार intromit महिला माउंट होगा । mounts और स्खलन के लिए अग्रणी intromissions के इस अनुक्रम एक "copulatory मुक्केबाज़ी" करार है । नर एक ही सत्र के भीतर कई copulatory डटकर होगा ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहाँ वर्णित सभी प्रक्रियाएँ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा मिनेसोटा विश्वविद्यालय के अनुमोदित की गईं, और प्रयोगशाला पशुओं के देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के अनुसार < सुप वर्ग = "xref" > १३ .

< p class = "jove_title" > 1. पशु और Cannulation सर्जरी

  1. लगभग ५५ दिनों की उंर में एक आम जानवर आपूर्तिकर्ता से सीरियाई हंसटर प्राप्त ।
    नोट: हालांकि जानवरों की उम्र विभिन्न प्रायोगिक मानदंड की कमी के कारण भिन्न होगा, यौन व्यवहार के लिए यह यौन परिपक्व जानवरों है कि सभी लगभग एक ही उम्र के हैं प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    2. एक नियंत्रित तापमान में
  2. घर जानवरों (22 & #176; ग) और प्रकाश (14 एच प्रकाश 13:00 ज पर बाहर रोशनी के साथ 10 एच अंधेरे के बाद) पर्यावरण, भोजन और पानी उपलब्ध विज्ञापन libitum प्रयोगात्मक परीक्षण की अवधि के दौरान छोड़कर ।
    नोट: के बाद से हंसटर सीजन में प्रतिलिपि, इस 14:10 प्रकाश/काले चक्र उनके प्राकृतिक प्रजनन शर्तों की नकल ।
    3. प्रयोगशाला के लिए एक 1-सप्ताह acclimation के बाद
  3. , सामान्य संज्ञाहरण के तहत रोकनेवाला द्विपक्षीय ovariectomies और intracranial stereotaxic cannulations प्रदर्शन ( जैसे , pentobarbital), और उचित संस्थागत रूप से प्रशासन-अनुमोदित पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक और एंटीबायोटिक उपचार पहले वर्णित के रूप में < सुप class = "xref" > 14 , < सुप class = "xref" > 15 .
    नोट: यौन व्यवहार के अध्ययन के लिए ovariectomies यौन हार्मोन के प्रमुख अंतर्जात स्रोत को दूर करने के लिए आवश्यक हैं ताकि जानवरों को समान रूप से प्रयोगात्मक समयरेखा के अनुसार exogenous हार्मोन के साथ यौन ग्रहणशीलता के लिए प्रेरित किया जा सके । दोनों dopaminergic और glutamatergic जांच आरोपण के लिए
    1. , stereotaxically प्रत्यारोपण गाइड cannulae (०.७ मिमी व्यास; < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ) ब्याज के क्षेत्र में ( जैसे , इस प्रयोगशाला सही नाभिक accumbens (एनएसी) लक्षित) के रूप में stepwise विस्तार में वर्णित है कहीं < सुप क्लास = "xref" > १५ .
      नोट: हालांकि प्रस्तुत डेटा एक ग्लूटामेट या प्रति पशु डोपामाइन जांच के एकल संवेदक रिकॉर्डिंग से कर रहे हैं, इस प्रणाली को एक ही जानवर में 4 सेंसर के लिए एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है; इस प्रकार, 1-4 cannulae वांछित प्रयोगात्मक डिजाइन और परिणामों के आधार पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है ।
      1. एक stereotaxic एटलस का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र के प्रत्यारोपण निर्देशांक निर्धारित ( जैसे , गोल्डन हंसटर मस्तिष्क द्वारा Morin & #38; लकड़ी), ध्यान में रखते हुए कि सेंसर मस्तिष्क ऊतक में प्रवेशनी के नीचे 1 मिमी फैली हुई है.
    2. के बाद एक प्रवेशनी वांछित पृष्ठीय-stereotaxically स्थान के लिए कम ventral है, यह खोपड़ी के लिए यह एक टोपी का उपयोग करके चिपकाएं दंत एक्रिलिक से निर्मित, स्टेनलेस स्टील हड्डी शिकंजा और एक प्लास्टिक हेड माउंट के साथ सुरक्षित (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ; < सुप वर्ग = "xref" > 15 अधिक जानकारी के लिए देखें).
      3. कार्बन फाइबर परीक्षण के लिए
    3. , contralateral गोलार्द्ध में एक संदर्भ इलेक्ट्रोड (३५० & #956; m व्यास, ७.५ mm कुल लंबाई) डालें.
      नोट: एक विशिष्ट स्थान या प्रवेशनी से दूरी की आवश्यकता नहीं है; संदर्भ इलेक्ट्रोड contralateral गोलार्द्ध में कहीं भी रखा जा सकता है कि सुविधाजनक है.
< p class = "jove_title" > 2. -सेंसर और कार्बन फाइबर परीक्षण

  1. सर्जरी से वसूली के 1 सप्ताह के बाद, हार्मोन भड़काना आहार यौन ग्रहणशीलता प्रेरित करने के लिए ।
    1. injection 10 & #181; एस्ट्राडियोल benzoate की ०.१ मिलीलीटर में बिनौला तेल के चमड़े के नीचे (एस॰सी॰), लगभग ४८ एच और 24 एच के यौन व्यवहार से पहले परीक्षण करने के लिए, पुरुष के प्रति यौन ग्रहणशीलता प्रेरित < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
    2. इंजेक्षन ५०० & #181; बिनौला तेल, एस॰सी॰, 4 एच के ०.१ मिलीलीटर में प्रोजेस्टेरोन के g यौन ग्रहणशीलता प्रेरित करने के लिए पुरुष की शुरूआत करने से पहले < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
  2. अपने दैनिक चक्र के अंधेरे चरण के शुरू में सभी जानवरों का परीक्षण, के रूप में कुतर के सामाजिक व्यवहार सफेद प्रकाश और लाल बत्ती के तहत परिवर्तन के अधीन है परीक्षण शर्तों < सुप वर्ग = "xref" > 16 , < सुप वर्ग = "xref" > १७ , < सुप वर्ग = "xref" > १८ .
  3. एंजाइमी के लिए सेंसर ग्लूटामेट परीक्षण, सेंसर जांचना इन विट्रो (< मजबूत वर्ग = "" > चित्रा 4 xfig) पहले वर्णित के रूप में उपयोग करें < सुप वर्ग = "" > १५ xref , < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
    1. अंशांकन समाधान 20 मिलीलीटर ग्लास केंद्रापसारक ट्यूबों में परीक्षण के दिन पर ताजा बनाओ । analyte समाधान के लिए, ७.४ मिलीग्राम एल-glutamic एसिड की 10 मिलीलीटर में अल्ट्रा शुद्ध एच 2 धीरे ट्यूब पलटने से ओ. को भंग करके दिग्दर्शन समाधान बनाओ अल्ट्रा के 10 मिलीलीटर में १७६.१ मिलीग्राम एए-शुद्ध एच 2 ओ.
    2. एक बुनियादी प्रयोगशाला अंगूठी स्टैंड के आधार पर एक चुंबकीय सरगर्मी रखकर अंशांकन के लिए सेट अप । चुंबकीय सरगर्मी के शीर्ष पर एक 20 मिलीलीटर जैकेट चोंच प्लेस, और एक मध्यम 2-शूल दबाना का उपयोग कर जगह में दबाना ।
      1. एक चुंबकीय हलचल बार और १०० mM फॉस्फेट के 20 मिलीलीटर में जोड़ें जैकेट चोंच में खारा (पंजाब) बफर । एक परिचालित पानी स्नान के लिए जैकेट चोंच कनेक्ट करने के लिए बफर समाधान गर्मी ३७ & #176; ग.
        नोट: एंजाइमी गतिविधि तापमान से प्रभावित है के बाद से एंजाइमीीय सेंसर अंशांकन शरीर के तापमान पर किया जाना चाहिए.
    3. जैकेट चोंच के शीर्ष पर सेंसर अंशांकन धारक जगह है, और एक सही कोण क्लैंप का उपयोग कर जगह में सुरक्षित, शीर्ष पर एक 4 चैनल अंशांकन एम्पलीफायर सेट. अंशांकन डेटा रिकॉर्ड करने के लिए एक डेटा कंडीशनिंग और प्राप्ति डिवाइस के लिए एम्पलीफायर से कनेक्ट करें ।
    4. एक के ऊपर अंशांकन धारक में जांच रखकर प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग से पहले ग्लूटामेट (या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध , ग्लूकोज) के लिए ब्याज की अन्य analytes के लिए प्रत्येक एंजाइमी के सेंसर की संवेदनशीलता का परीक्षण जैकेट चोंच, संवेदन गुहा और रजत क्लोराइड (AgCl) संदर्भ तार के कुछ हिस्से बफर समाधान में उपविलय ।
      1. प्रत्येक संवेदक को जोड़ने से पहले (4) एक 4 चैनल अंशांकन एम्पलीफायर पर एक बंदरगाह के लिए परीक्षण किया जा रहा है, मुफ्त डाउनलोड अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कंप्यूटर इंटरफेस पर एक नई रिकॉर्डिंग आरंभ. सेंसर एक स्थिर आधार रेखा तक पहुंचने के लिए अनुमति दें ।
    5. सेंसर एक स्थिर आधार रेखा तक पहुँच गए हैं जब analyte इंजेक्शन जोड़ने शुरू. बफर समाधान के लिए एक पिपेट टिप शुरू करने के लिए अंशांकन धारक में छेद का प्रयोग करें । जब एक इंजेक्शन बनाया है व्याख्या करने के लिए रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में त्वरित कुंजी एनोटेशन उपकरण का उपयोग करें ।
      1. कर 10 & #181; मीटर जोड़कर ग्लूटामेट की pipetting ४० & #956; के एल analyte समाधान के बफर समाधान में. सेंसर को परिवर्धन के बीच स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें । दिग्दर्शन ए. ए. से एक इंजेक्शन जोड़ने से पहले analyte समाधान के 3 इंजेक्शन जोड़ें समाधान (५० & #956; L इंजेक्शन मात्रा for २५० & #956; मी एकाग्रता में परिवर्तन).
        नोट: अंशांकन amperometric संकेत में परिवर्तन के रूपांतरण के लिए अनुमति देता है (चरण २.१२ में एंजाइमी प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग के दौरान देखा) ग्लूटामेट एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए, यदि वांछित । संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > १५ stepwise निर्देश देखें. इस प्रयोगशाला द्वारा प्रयुक्त dopaminergic जांच वाणिज्यिक प्रदाता द्वारा निर्माण प्रक्रिया के दौरान तुले हुए हैं । ग्लूटामेट जांच का उपयोग समय पर तुले होना चाहिए क्योंकि उनकी संवेदनशीलता समय के साथ कम हो सकती है क्योंकि एंजाइमी अवयव नीचा < सुप वर्ग = "xref" > १९ . क्योंकि कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड क्षरण से गुजरना नहीं है, अंशांकन करने से पहले कंपनी द्वारा प्रदर्शन किया है के रूप में टी के साथ पर्याप्त लदानयहां अतिरिक्त हैंडलिंग के माध्यम से पतली कार्बन फाइबर (३५० & #956; m व्यास) को नुकसान पहुंचाने की एक बढ़ी हुई संभावना है ।
  4. लाइन पशु & #39 से लिया बिस्तर के साथ परीक्षण कक्ष; s घर पिंजरे.
    नोट: यह बढ़ जाती है महिला & #39; एस परीक्षण कक्ष के साथ परिचित, साथ ही साथ यौन उत्तेजक घ्राण संभोग cues कि एस्ट्राडियोल उपचार के जवाब में महिला द्वारा वितरित किया गया पुरुष को उजागर करता है ।
  5. हल्के से isoflurane या एक प्रेरण कक्ष में एक और अस्थिर संवेदनाहारी द्वारा जांच की प्रविष्टि से पहले पशुओं anesthetize ।
  6. गाइड प्रवेशनी से पूर्णावरोधक obdurator निकालें, और या तो कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड या एंजाइमी गाइड शाफ्ट के माध्यम से जांच डालें.
  7. के बाद जांच बिंद, पशु परीक्षण कक्ष में जगह है ।
    नोट: इस प्रयोगशाला एक 10-लड़की ग्लास मछलीघर (२४.५ x ४८.९ x २९.४ सेमी) का उपयोग करता है, लेकिन बराबर क्षेत्र के दौर कक्षों भी कार्यरत हो सकता है ।
  8. किसी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में वीडियो और समय-अवरोधित amperometric सिग्नल रिकॉर्ड करना शुरू करें, कहीं विस्तार से वर्णन किया गया < सुप वर्ग = "xref" > 15 .
  9. रिकॉर्डिंग प्रणाली के लिए सेंसर कनेक्ट: एक विद्युत परिरक्षण केबल और एक विद्युत कुंडा के माध्यम से potentiostat. सिर माउंट पर एक पिन लगाव पंगा लेना द्वारा संवेदक कनेक्शन स्थिर । यदि आवश्यक हो तो लैब फिल्म का उपयोग कर कनेक्शन सुदृढ़ ।
    नोट: एक स्वनिर्धारित कनेक्टर potentiostat करने के लिए दोनों कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड संलग्न करने के लिए आवश्यक है, जबकि एंजाइमी ग्लूटामेट सेंसर सीधे potentiostat.
    10. करने के लिए कनेक्ट किया जा सकता
  10. प्रयोगात्मक परीक्षण से पहले सेंसर मस्तिष्क में equilibrate करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: Equilibration बार रिकॉर्डिंग संवेदक ( जैसे , एंजाइमी सेंसर 2-4 एच Equilibration की आवश्यकता के आधार पर अलग है, जबकि कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड केवल के बारे में 30 मिनट की आवश्यकता है). यदि दोनों प्रकार के सेंसर प्रत्यारोपित किए जाते हैं तो अब एंजाइमी सेंसर समय के लिए equilibrate.
  11. सेंसर equilibration के बाद, परीक्षण कक्ष में एक उत्तेजना पुरुष परिचय.
  12. पहले शिश्न सम्मिलन (intromission के साथ) उत्तेजना पुरुष द्वारा माउंट के बाद, एक अतिरिक्त 10-30 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग जारी, प्रयोगात्मक लक्ष्यों पर निर्भर करता है.
  13. निम्न व्यवहार गर्ने भन्ने, म पनि स्त्री & #39; s संव.
  14. परीक्षण कक्ष से दोनों हंसटर निकालें । बिस्तर निकालें और ७०% इथेनॉल का उपयोग कर चैंबर साफ ।
    नोट: कार्बन फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक संक्षिप्त equilibration के कारण, कदम २.३-२.१४ एक ही दिन में कई जानवरों का परीक्षण करने के लिए दोहराया जा सकता है. इसके विपरीत, क्योंकि एंजाइमी सेंसर equilibration के बारे में 4 एच की आवश्यकता होती है, जानवरों में अंतर के कारण संभावित अंतर-विषय भिन्नता को सीमित करने के लिए प्रति दिन केवल एक पशु का परीक्षण & #39; परीक्षण पर circadian समय.
< p class = "jove_title" > 3. कुर्बानी और छिड़काव

  1. परीक्षण अवधि के समापन के बाद, गहराई से एक euthanizing एजेंट के साथ महिला परीक्षण विषय anesthetize ( उदा , इस प्रयोगशाला ०.२ मिलीलीटर intraperitoneal और फ़िनाइटोइन समाधान का एक pentobarbital इंजेक्शन का उपयोग करता है) .
  2. Transcardially perfuse 25 मिमी पंजाबियों के साथ पशु, पीएच ७.६, सभी परिसंचारी रक्त, 4% paraformaldehyde-पंजाबियों का उपयोग कर एक 20 मिनट के निर्धारण के बाद हटाने के लिए ।
  3. में मस्तिष्क और पोस्टफिक्स 4% paraformaldehyde समाधान की ~ 30 मिलीलीटर में एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब रातोंरात निकालें ।
    1. एक 10% में मस्तिष्क की दुकान सुक्रोज-पंजाबियों समाधान धारावाहिक अनुभाग के लिए तैयार जब तक.
      नोट: दिमाग 2 हफ्तों तक संग्रहित किया जा सकता है, साप्ताहिक सुक्रोज समाधान परिवर्तन के साथ संदूषणों की संभावित वृद्धि से बचने के लिए ।
  4. धारावाहिक धारा मस्तिष्क में ४० & #181; के साथ प्रत्यारोपित क्षेत्र के माध्यम से मीटर स्लाइसें या तो एक ठंड microtome या cryostat के रूप में पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
    5. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिपकने वाली स्लाइड पर
  5. माउंट स्लाइस प्रश्नपत्र (या < सुप वर्ग = "xref" > 20 बनाने के लिए देखें). शुष्क करने के लिए अनुमति दें, कम से रात भर.
  6. cresyl वायलेट डाई के साथ स्लाइड दाग, स्पष्ट, और coverslip पहले वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > २० .
  7. छवि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए सेंसर की संरचनात्मक नियुक्ति की पुष्टि स्लाइड.
< p class = "jove_title" > 4. व्यवहार कोडिंग

  1. देखें और व्याख्या मुक्त व्यावसायिक रूप से डाउनलोड सॉफ्टवेयर का उपयोग वीडियो (सामग्री के तालिका देखें) धीमी गति में ठीक कोड व्यवहार समय amperometric संकेत करने के लिए बंद करने के लिए ।
    नोट: विश्लेषण में MATLAB कोड का उपयोग करने के लिए ( नीचे देखें) , व्याख्या प्रारंभ और अंत प्रत्येक महिला के & #39; s और नर & #39; s यवहार.
    1. व्याख्या startLordosis फ्रेम में जब महिला उसकी पीठ के एक dorsoflexion शुरू होता है और उसकी पूंछ ऊपर की मनोकामना । व्याख्या endLordosis जब महिला इस आसन है, जो अक्सर होता है जब महिला परीक्षण कक्ष में एक और स्थान पर पुनः समायोजन समाप्त होता है ।
    2. व्याख्या startAI जब मादा अग्रकुब्जता आसन में जाती है और पुरुष अपने थूथन को मादा & #39; एस anogenital क्षेत्र की ओर ले जाता है, जहाँ सूँघने, चाट, या उसके nuzzling क्षेत्र की perineal हो सकती है. व्याख्या एएंडई जब पुरुष अपने थूथन को करीब निकटता से निकालता है मादा & #39; s anogenital क्षेत्र.
    3. व्याख्या startMount जब पुरुष दृष्टिकोण और एक बढ़ते मुद्रा में महिला पर अपने forepaws स्थानों, माउंट प्रयास के उंमुखीकरण की परवाह किए बिना ( जैसे , पक्ष, रुंप).
    4. व्याख्या startIntromission जब सफल जोर लाभ घुड़सवार पुरुष शिश्न का उपयोग करने के लिए महिला & #39; s योनि.
      नोट: एक intromission व्यवहार से अलग है घुड़सवारी जोर है कि intromission से पहले होता है, के रूप में पुरुष दिखाई अपने शरीर की ओर अपने ऊपरी अंग खींचती है, उसके आगे श्रोणि जोर, और कर्ल अपनी पूंछ ऊपर की तरफ, प्रवेश का संकेत (देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४       ग ).
      1. जब लागु, व्याख्या स्खलन .
        नोट: एक संभोग मुक्केबाज़ी के अंत में और एक सफल intromission के साथ संयोजन के रूप में, पुरुष बोल पड़ना होगा । हालांकि एक वास्तविक उत्सर्जन कल्पना करने में असमर्थ है, पुरुष हंसटर एक intromission < सुप वर्ग = "xref" > 21 के दौरान उनके हिंद पैर के साथ एक विशेषता चलने गति है, इस प्रकार पैर आंदोलन की घटना पर स्खलन व्याख्या ।
    5. व्याख्या endIntromission तथा endMount साथ ही फ्रेम में जब पुरुष अपने सामने दो पंजे हटा दिया है और इस तरह, महिला के साथ कोई संपर्क नहीं है । लगातार अक्षमता के कारण उसकी वापसी कल्पना करने के लिए, एक साथ कोड इन दोनों व्यवहार संभोग डटकर भर में निरंतरता और विश्वसनीयता के लिए अनुमति देने के लिए ।
      ध्यान दें: एक संभोग मुक्केबाज़ी या तो एक सफल हांक इस प्रकार है या जब महिला अग्रकुब्जता आसन टूट जाता है कम एक माउंट .
      6. के बाद
< p class = "jove_title" > 5. उदाहरण डेटा विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: फिक्स्ड-संभावित कार्बन फाइबर और डोपामाइन के लिए एंजाइमी रिकॉर्डिंग का उपयोग एकएन डी ग्लूटामेट, क्रमशः, दोनों टॉनिक और विद्युत रिहाई के phase पैटर्न को मापने की क्षमता के लिए अनुमति देता है । इस प्रयोगशाला का उपयोग करता है एक मुक्त, वाणिज्यिक अधिग्रहण प्रणाली और सॉफ्टवेयर रिकॉर्ड करने के लिए और एनालॉग से डिजिटल करने के लिए दर्ज संकेतों परिवर्तित (पूर्वाग्रह ०.६०० V, नमूना दर = 1 हर्ट्ज).

  1. उदाहरण डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल
    1. का विवरण हालांकि अन्य कार्यक्रमों का इस्तेमाल किया जा सकता है, विद्युत का उपयोग कर दर्ज MATLAB संकेत में टॉनिक और चरणबद्ध (क्षणिक) परिवर्तन को बढ़ाता है. प्रस्तुत आंकड़ों के लिए
      1. , एक ५०-पॉइंट मूविंग एवरेज फिल्टर का उपयोग कर टॉनिक सिग्नल की गणना करें । संकेत के एक क्षणिक केवल सामान्यीकृत प्रतिनिधित्व कच्चे डेटा से टॉनिक संकेत घटाई द्वारा गणना की गई थी । जब चरणबद्ध चोटियों की पहचान, वहाँ विभिन्न एल्गोरिथम विकल्प हैं ( उदा , संकेत में परिवर्तन के रूप में लेबल चोटियों 1 से अधिक एसडी मतलब ऊपर).
      2. इन चोटियों के स्थानों की पहचान, यानी , स्थानीय maxima, MATLAB समारोह का उपयोग करते हुए सामान्यीकृत संकेत से peakfinder न्यूनतम चोटी आयाम सेट के साथ के संकेत के मूल माध्य वर्ग के लिए. सामान्यीकृत संकेत से पता लगाया चोटियों का स्थान प्रत्येक चोटी से आयाम निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चोटियों का पता लगाने की क्षमता किसी भी समय की पहचान के लिए अनुमति देता है-व्यवहार है कि के साथ मेल हो सकता है बंद, या जांच के तहत neurochemical में रिश्तेदार चोटी ड्राइविंग ।
    2. खंड व्यवहार एनोटेशन के अनुसार संसाधित डेटा (चरण 3 देखें); a Student & #39; s t -परीक्षण टॉनिक न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, यात्रियों की घटना, और के आयाम पूर्व संभोग मुक्केबाज़ी के दौरान अग्रकुब्जता बनाम अग्रकुब्जता के दौरान यात्रियों । के लिए विद्युत रिलीज के टॉनिक पैटर्न में परिवर्तन को मापने, डेटा अग्रकुब्जता स्थिति के दौरान सीधे एक संभोग मुक्केबाज़ी से पहले होने वाले अंक ( यानी , पूर्व संभोग मुक्केबाज़ी अग्रकुब्जता) एक संभोग मुक्केबाज़ी के दौरान डेटा बिंदुओं की तुलना में थे एक टी परीक्षण का उपयोग सत्र.
  2. वर्णित डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल के लिए अपुष्ट डेटा की तैयारी
    नोट: जैसा कि कहा गया है, हालांकि अन्य कार्यक्रमों या विश्लेषणों समान रूप से व्यवहार्य विकल्प हो सकता है, आदेश में ऊपर वर्णित MATLAB कोड का उपयोग करने के लिए, कच्चे डेटा में तैयार किया जाना चाहिए निंन तरीका:
    1. एनोटेशन और वोल्टेज फ़ाइलें निर्यात करें । ऐसा करने के लिए, & #39; फ़ाइल & #39; टैब, के अंतर्गत & #39; निर्यात & #39; फ़ंक्शन का चयन करें और एनोटेशन को सहेजने के लिए & #39; एनोटेशन & #39; टैब का चयन करें । के अधीन & #39; फाइल & #39; tab, का चयन & #39; निर्यात & #39; णाली पर करना तथा & #34 का चयन करना; TSV & #39; एक TSV एक्सटेंशन फ़ाइल के रूप में वोल्टेज माप को बचाने के लिए टैब ।
    2. स्प्रेडशीट प्रोग्राम के साथ प्रत्येक फ़ाइल खोलें और के रूप में सहेजें & #39; xls/xlsx & #39; फ़ाइलों को MATLAB.
      के साथ संगत बनाने के लिए नोट: के लिए & #39; एनोटेशन & #39; फ़ाइल, अतिरिक्त एनोटेशन है कि मैंयुअल रूप से जोड़ा जाना चाहिए पोस्ट निर्यात एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में शुरू और दोनों पूर्व संभोग मुक्केबाज़ी अग्रकुब्जता के अंत हुक्म ( PreMBlordorsis के रूप में व्याख्या ) और संभोग मुक्केबाज़ी इतना है कि इन समय अंक सीधे चरण 5.1.2 में वर्णित के रूप में तुलना की जा सकती है ।
    3. पूर्व संभोग मुक्केबाज़ी अग्रकुब्जता के शुरू व्याख्या ( startPreMBlordosis ) एक अग्रकुब्जता व्यवहार के रूप में एक ही समय में शुरू होता है ( startLordosis ) कि भी शामिल है एक माउंट व्यवहार, और भी एक नया संभोग मुक्केबाज़ी के शुरू में अगर महिला अग्रकुब्जता आसन में रहता है.
    4. व्याख्या पूर्व संभोग मुक्केबाज़ी अग्रकुब्जता ( endPreMBlordosis ) के अंत में जब पहली माउंट शुरू होता है ।
    5. एक संभोग मुक्केबाज़ी के शुरू व्याख्या ( startMB ) endPreMBlordosis के एक ही समय में, के रूप में यह एक संभोग मुक्केबाज़ी की शुरुआत का प्रतीक है ।
    6. एक संभोग मुक्केबाज़ी (endMB) के अंत में एक पर्वत है कि एक हांक (कदम 4.1.4.1 देखें), या निंनलिखित अग्रकुब्जता आसन ( endLordosis ) की समाप्ति की महिला & #39; एस के अंत में शामिल हैं ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित विद्युत और व्यवहार कोडिंग पद्धति का उपयोग करते हुए, इस प्रयोगशाला ने vivo में यौन व्यवहार की रिकॉर्डिंग के दौरान दोनों टॉनिक और दोनों में चरणबद्ध उतार चढ़ाव को चिह्नित करना शुरू कर दिया है । इस पद्धति का लौकिक-सटीक तरीके के कारण, हम अधिक सही यौन व्यवहार के दौरान neurotransmission की विशेषताएं कर सकते हैं; के रूप में अच्छी तरह के रूप में परमशॆवर विशेष परिवर्तन संभोग मुक्केबाज़ी के दौरान इसी टॉनिक परिवर्तन करने के लिए, और इसी क्षणिक उतार चढ़ाव व्यक्तिगत copulatory व्यवहार की महिला की प्राप्ति के दौरान (उदा, intromission, फटना) बढ़ते नर से.

विशेष रूप से, हम अलग जानवरों की एनएसी में डोपामाइन और ग्लूटामेट के रिलीज पैटर्न को मापने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इस पद्धति का इस्तेमाल किया । एनएसी एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है इनाम प्रसंस्करण22 में शामिल है और यौन व्यवहार23के इनाम पहलुओं में एक अभिंन क्षेत्र के रूप में वर्णित किया गया है ।

हमने देखा है कि यौन व्यवहार के दौरान, महिलाओं संभोग मुक्केबाज़ी के दौरान एनएसी कोर में dopaminergic स्तर में एक टॉनिक वृद्धि का प्रदर्शन (चित्रा 5) । हालांकि इन टॉनिक परिवर्तन सभी संभोग मुक्केबाज़ी के लिए दिखाए जाते हैं, इस पद्धति के ऊपर वर्णित एक संभोग मुक्केबाज़ी के बीच टॉनिक परिवर्तन उपाय कर सकते हैं, और इस तरह न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई के स्तर टॉनिक के लिए समग्र परिवर्तन के अस्थाई पहचान में वृद्धि पूरा सत्र । इसके अलावा, यह वर्णित पद्धति चरणबद्ध परिवर्तन तुच्छ और अस्थाई व्यवहार की संभावना इन चरणबद्ध न्यूरोट्रांसमीटर उतार चढ़ाव के साथ जुड़े नक्शा कर सकते हैं. विशेष रूप से, इन प्रारंभिक परिणामों का सुझाव है कि संभोग के दौरान, एनएसी में dopaminergic यात्रियों योनि प्रविष्टि के दौरान पैदा (intromission) पुरुष द्वारा (चित्रा 6) । इसके अलावा, intromission के साथ इस संबंध में विशिष्ट है, ऐसे एअर इंडिया के रूप में अंय copulatory व्यवहार के लिए नगण्य dopaminergic प्रतिक्रियाओं के साथ ।

एक समान पैटर्न ग्लूटामेट रिहाई के संबंध में अंय जानवरों में देखा गया है, तेजी से यात्रियों कि एक copulatory मुक्केबाज़ी (चित्रा 7) के दौरान पृष्ठीय एनएसी कोर में व्यक्तिगत intromissions के अनुरूप के साथ । इस पैटर्न कोई समझदार एनएसी खोल या अंय जानवरों के औसत दर्जे caudate में होने वाली संकेत के साथ क्षेत्र विशेष है ।

Figure 1
चित्र 1 : एंजाइमी-संवेदी प्रौद्योगिकी ।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइमी के मानक निर्माण की जांच कि एंजाइम मध्यस्थ प्रसंस्करण के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाने (वाम छवि). glutamatergic सेंसरों के मामले में, ग्लूटामेट oxidase एंजाइमी परत (सही छवि) में कार्यरत है nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर को electroactive हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) में परिवर्तित करने के लिए जो में ऑक्सीकरण द्वारा पाया जाता है प्लैटिनम-इरिडियम (Pt-Ir) इलेक्ट्रोड । Ascorbic एसिड (एए), एक आम दिग्दर्शन है कि एक ही क्षमता में ऑक्सीकरण हो जाता है, एंजाइमी परत पर ए. ए. oxidase के एक अतिरिक्त के माध्यम से बाहर रखा गया है कि nonelectroactive पानी के लिए दिग्दर्शन धर्मांतरित । मस्तिष्क में मौजूद अन्य नकारात्मक electroactive दिग्दर्शन एक निष्क्रिय चयनात्मक झिल्ली के माध्यम से बाहर रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक हंसटर संभोग मुक्केबाज़ी के अवयव ।
हंसटर में, एक संभोग मुक्केबाज़ी copulatory व्यवहार, जिसके दौरान महिला अग्रकुब्जता मुद्रा में रहता है, जबकि पुरुष anogenitally जांच (ए), mounts (ख)के एक दृश्य के होते हैं, और intromission (सी) प्राप्त . नोट एक intromission व्यवहार से अलग है के रूप में पुरुष बढ़ते अपने शरीर की दिशा में अपने ऊपरी अंग खींचती है, उसके आगे श्रोणि जोर, और कर्ल अपनी पूंछ ऊपर की ओर, प्रवेश का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : खोपड़ी कैप निर्माण ।
गाइड cannulae, हड्डी शिकंजा, और दंत एक्रिलिक एक खोपड़ी टोपी के निर्माण में उपयोग किया जाता है कार्बन फाइबर या एंजाइमी जांच के सम्मिलन की अनुमति (देखें15 stepwise विवरण के लिए). यह आंकड़ा एक एंजाइमी संवेदक (कोई प्रत्यारोपित संदर्भ इलेक्ट्रोड) और सेंसर स्थिरता के लिए प्लास्टिक सिर माउंट के लिए सही एनएसी पर एक एकल प्रवेशनी प्रत्यारोपण दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : ग्लूटामेट सेंसर अंशांकन ।
ग्लूटामेट के लिए प्रत्येक-संवेदी की संवेदनशीलता ३७ डिग्री सेल्सियस पर ग्लूटामेट (green) की 10 µm जोड़कर प्रायोगिक रिकॉर्डिंग से पहले इन विट्रो में परीक्षण किया जाता है (चूंकि एंजाइमी गतिविधि तापमान से प्रभावित होती है) । प्रत्येक संवेदक ascorbic एसिड के लिए गैर उत्तरदाई होने की पुष्टि की है (एए; लाल) या डोपामाइन (दा; नीला) । यह अंशांकन ग्लूटामेट एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग के दौरान देखा amperometric संकेत में परिवर्तन के रूपांतरण के लिए अनुमति देता है ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : टॉनिक एक संभोग मुक्केबाज़ी के दौरान डोपामाइन में बढ़ जाती है ।
मुक्केबाज़ी अग्रकुब्जता संकेत बनाम संभोग मुक्केबाज़ी अग्रकुब्जता संकेत संभोग के ए शैली उदाहरण। टॉनिक डोपामाइन रिलीज को मापने के लिए, एक संभोग मुक्केबाज़ी (एमबी) से पहले अग्रकुब्जता के दौरान डोपामाइन के स्तर को amperometric प्रतिक्रियाओं एक एमबी के दौरान उन लोगों की तुलना में थे । धूसर बॉक्स एक MB से पहले अग्रकुब्जता इंगित करते हैं । बीएलएक MB के दौरान यत बक्से अग्रकुब्जता इंगित करते हैं । B. प्रतिनिधि preMB अग्रकुब्जता और एमबी अग्रकुब्जता के बीच मतलब वोल्टेज की तुलना एक जानवर से ठहराव । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि दर्शाती हैं, और तारांकन महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है (p-value & #60; ०.०५) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : प्रतिनिधि डोपामाइन ट्रेस ।
डोपामाइन का चरणबद्ध रिलीज समय है-पृष्ठीय एनएसी कोर में पुरुष से intromissions के लिए बंद कर दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : प्रतिनिधि ग्लूटामेट ट्रेस ।
ग्लूटामेट यात्रियों एक विस्तारित यौन अनुभव के दौरान पृष्ठीय एनएसी कोर में पुरुष से व्यक्तिगत intromissions के अनुरूप हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि अपेक्षाकृत सरल, कुछ मुद्दों जब इस तकनीक को रोजगार पैदा कर सकते हैं । सबसे पहले, जांच के stereotaxic स्थान सटीक होना चाहिए: microdialysis के विपरीत है कि नमूनों की जांच आसपास के extracellular वातावरण के एक व्यापक त्रिज्या, इस तकनीक केवल एक न्यूरोट्रांसमीटर है कि सीधे संपर्क में आता है की माप की अनुमति देता है साथ ही जांच की । दूसरा, कार्बन फाइबर रिकॉर्डिंग के मामले में, फाइबर की छोटी चौड़ाई के कारण, टूटना हो सकता है, और जांच जानबूझकर देखभाल के साथ डाला जाना चाहिए । glutamatergic के मामले में, एंजाइमी क्षरण हो सकता है अगर जांच की गारंटी समय-फ्रेम के भीतर 3-सप्ताह का उपयोग नहीं किया जाता है । सौभाग्य से, इन मुद्दों के सभी संबोधित कर रहे हैं, और उचित देखभाल और विस्तार के लिए ध्यान के साथ समाप्त किया जा सकता है ।

एक संभावित समस्याग्रस्त चेतावनी निश्चित क्षमता कार्बन फाइबर रिकॉर्डिंग की विशिष्टता में पैदा होती है । क्योंकि डोपामाइन के लिए लागू की क्षमता अन्य monoamines, जैसे norepinephrine के साथ मेल खाता है, यदि रिकॉर्डिंग क्षेत्रों में किया जाता है कि दोनों न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, रासायनिक विशिष्टता की इस कमी से परिणाम की व्याख्या को सीमित कर सकते हैं. एनएसी में यह एक बड़ी समस्या पैदा नहीं करता है, के साथ डोपामाइन प्राथमिक catecholamine ट्रांसमीटर24जा रहा है । क्योंकि एनएसी में कोशिकाओं के मोटे तौर पर ९८% मध्यम कंटीला न्यूरॉन्स है कि dopaminergic neurotransmission24का जवाब है, संकेत डोपामाइन का पता लगाने की दिशा में पक्षपातपूर्ण है और इस अधिक बारी के उपयोग की सुविधा प्रमुख दृष्टिकोण ।

इस एंजाइमी के एक अंय लाभ और स्थिर संभावित कार्बन फाइबर रिकॉर्डिंग प्रणाली है कि दोहरे जांच रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया जा सकता है, ताकि दोनों electroactive और nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर जैसे डोपामाइन और ग्लूटामेट में मापा जा सकता है एक ही जानवर समवर्ती । हालांकि यहां प्रस्तुत डेटा अलग जानवरों में रिकॉर्डिंग से आते हैं, इन तकनीकों को समवर्ती ऐसे है कि एक कई मस्तिष्क क्षेत्रों में या एक ही क्षेत्र में neurotransmission के अभिसरण का मूल्यांकन कर सकते है नियोजित किया जा सकता है द्विपक्षीय । एक ही जानवर, या जानवरों भर में रिकॉर्डिंग की तुलना के भीतर रिकॉर्डिंग का संयोजन यहां दिखाया गया है, नेटवर्क कनेक्शन और सिग्नलिंग के पीछे elucidating तंत्र में दोनों शक्तिशाली उपकरण हैं ।

संक्षेप में, इस कागज एंजाइमी के शक्तिशाली तकनीक को दर्शाता है संवेदन और फिक्स्ड-संभावित रिकॉर्डिंग को मापने के लिए एकाधिक electroactive और nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर एक प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग । यहाँ प्रस्तुत डेटा एकाधिक जानवरों भर में व्यक्तिगत न्यूरोट्रांसमीटर रिकॉर्डिंग से आते हैं, इस प्रणाली को एक साथ एक जानवर समवर्ती15में 4 सेंसर से रिकॉर्ड करने की क्षमता प्रदान करता है. नमूना परिणाम सामूहिक रूप से महिला हंसटर में तेजी से neurotransmission में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए पुरुष से copulatory उत्तेजना के विशिष्ट पैटर्न से उत्पंन प्रस्तुत । इसके अलावा, इन प्रयोगों समय का प्रदर्शन-पुरुष से intromission करने के लिए महिला के एनएसी कोर में dopaminergic और glutamatergic यात्रियों की प्रतिक्रियाओं को बंद कर दिया, सुझाव है कि इस रिलीज के विशिष्ट पुरस्कृत गुणों एंकोडिंग के लिए जिंमेदार हो सकता है यौन व्यवहार । हमारा लक्ष्य महिला सीरियाई हंसटर में संभोग पैटर्न का उपयोग जारी रखने के लिए vivo में डोपामाइन और ग्लूटामेट रिहाई और copulatory उत्तेजनाओं के व्यक्तिगत घटकों के लिए अंतर्निहित सर्किट के संबंध का एक अधिक व्यापक चित्र विकसित करने के लिए है पुरुष से. हम मानते है कि क्षमता इन न्यूरोट्रांसमीटर के पैटर्न को चिह्नित करने के लिए केवल एक बुनियादी विज्ञान के परिप्रेक्ष्य से लाभप्रद नहीं है23, लेकिन यह भी elucidating के रोग रूपों के लिए संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण में इस तरह के पुरस्कार व्यवहार नशीली दवाओं की लत के रूप में25।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक अपनी मदद के लिए Matlab कोड और स्नातक एलेक्स Boettcher चलाने में व्यवहार प्रयोगों चलाने में उनकी सहायता के लिए स्नातक डैनियल कोरुस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस परियोजना NSF IOS १२५६७९९ के लिए R.L.M. द्वारा समर्थित है, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान पुरस्कार संख्या T32DA007234 के तहत राष्ट्रीय संस्थानों की नशीली दवाओं के दुरुपयोग पर ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nembutal Oak Pharmaceuticals Inc. 76478-501-50 Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally. 
Loxicom analgesic  Norbrook Laboratories  6451603670 NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. 
Enroflox antibiotic  Norbrook Laboratories  5552915411 Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D  Merck Animal Health 00061047305 Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws Pinnacle Technologies, Inc. 8111-16 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. 
Dental acrylic (Bosworth Duz-All) Bosworth  166261C  Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup  Pinnacle Technologies, Inc. 8400-K2 Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package Pinnacle Technologies, Inc. 9000-K1 The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. 
Video EQ700 EverFocus camera  package Pinnacle Technologies, Inc.  9000-K10  EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. 
Sirenia Acquisition software Pinnacle Technologies, Inc. Free--available to download from pinnaclet.com Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit Pinnacle Technologies, Inc. 7000-K2-T-BAS  In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). 
Stir plate  Corning 6795-410D Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation PolyScience 8006A11B PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. 
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae Pinnacle Technology, Inc. 7002-CFS Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode Pinnacle Technology, Inc. 7065 Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors  Pinnacle Technology, Inc. 7001  Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae Pinnacle Technologies, Inc. 7030  Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats  Pinnacle Technologies, Inc. 7011  Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.

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References

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तंत्रिका अंक १२७ महिला यौन व्यवहार पुरुष copulatory व्यवहार इनाम नाभिक accumbens डोपामाइन ग्लूटामेट सीरियाई हंसटर फिक्स्ड संभावित amperometry एंजाइमी ।
<em>Vivo में</em> मापने Extracellular न्यूरोट्रांसमीटर में स्वाभाविक रूप से पुरस्कृत व्यवहार के दौरान महिला सीरियाई हंसटर में परिवर्तन
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Moore, K. M., Himmler, B. T.,… More

Moore, K. M., Himmler, B. T., Teplitzky, B. A., Johnson, M. D., Meisel, R. L. Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters. J. Vis. Exp. (127), e56135, doi:10.3791/56135 (2017).

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