Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster

Summary

Dieses Papier beschreibt behoben-Potential amperometrischen Bildaufzeichnungen mit Kohlefaser-Elektroden und enzymatische Biosensor-Technologie zur Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat mit hoher zeitlicher Auflösung während natürliche lohnende Verhalten in der weibliche Hamster.

Abstract

Neurotransmitter-Freisetzung auf einer schnellen Zeitskala zu messen, können Muster Neurotransmission in Zusammenhang mit bestimmten Verhaltensweisen oder Manipulationen werden; ein mächtiges Werkzeug in der Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und Schaltung. Während die Technik der Mikrodialyse jahrzehntelang verwendet worden ist, um nahezu jeden Analyten von Interesse im Gehirn zu messen, ist diese Technik in zeitlicher Auflösung begrenzt. Alternativ ist Schnellscan zyklischer Voltammetrie zeitlich präzise und extrem empfindlich; Da diese technisch schwierige Methode stützt sich auf die Electroactivity des Analyten von Interesse, entfällt jedoch die Möglichkeit, Nonelectroactive Substanzen (z.B. der Neurotransmitter Glutamat) zu erkennen. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von ein Turnkey-System, das feste Potenzial strommesstechnik und enzymatische Biosensoren elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter mit zeitlichen Präzision zu messen. Die Paarung dieser beiden leistungsfähigen Methoden ermöglicht die Messung der tonischen und phasischen Neurotransmission mit relativer Leichtigkeit und ermöglicht die Aufnahme von mehreren Neurotransmittern gleichzeitig. Dieses Manuskript soll den Prozess der Messung von Dopamin und Glutamat Neurotransmission in Vivo mit einem natürlich lohnende Verhalten (d. h., Sexualverhalten) in weibliche Hamster, mit dem Ziel der Darstellung zeigen die technische Machbarkeit des Assays für die Prüfung anderer Verhaltensweisen und experimentelle Paradigmen.

Introduction

Die Fähigkeit zur Messung der Neurotransmitter-Freisetzung in wach Verhalten Tiere erlaubt Forschern, bestimmte Verhaltensweisen mit räumlichen und zeitlichen Muster der Neurotransmission, ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, Mechanismen und Schaltung zugrunde liegen beide verbinden natürliche und das operante Verhalten in Echtzeit. In der Vergangenheit wurde Mikrodialyse eingesetzt, um sowohl elektrisch reaktiver und nichtreaktiven Stoffe in das extrazelluläre Milieu des Gehirns¹messen. Diese Technik verwendet einen kontinuierlichen Fluss von einer wässrigen Lösung ähnlicher ionische Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit durch eine Mikrodialyse-Sonde besteht aus einer kleinen Welle mit einer Spitze eines halbdurchlässigen Hohlfaser-Membran²gemacht. Nach dem Einführen der Sonde, Neurotransmitter oder anderen Analyten von Interesse können die halbdurchlässige Membran durch passive Diffusion vor gesammelt in Abständen für die spätere Analyse durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), überqueren eine analytische Chemie Technik häufig genutzt, um zu trennen, identifizieren und quantifizieren Komponenten in eine heterogene Mischung³.

Obwohl Mikrodialyse eine sensible Technik, die verwendet werden ist, um praktisch jede Analyten von Interesse zu messen, ist die zeitliche Auflösung gering, mit maximalen Sampling-Raten in der Größenordnung von bis zu zehn Minuten^1,2Minuten. Die Erfindung des schnellen Scan zyklischer Voltammetrie (FSCV), eine Technik, die stützt sich auf das Redoxpotential elektroaktive Spezies, kann in der Nähe von momentanen Konzentration des Analyten von Interesse in der extrazellulären Flüssigkeit aufzuklären. In Kürze (siehe Robinson Et Al. ⁴ für eine umfassende Überprüfung), eine Elektrode wird angewendet, um heben und senken die Spannung in einem Dreieckswelle Mode auf eine schnelle Zeit Skala⁴. Wenn die Spannung in den richtigen Bereich ist, wird die Verbindung von Interesse immer wieder oxidiert und reduziert. Diese Oxidation und Reduktion führt zu einer Bewegung der Elektronen, die eine kleinen Wechselstrom erzeugt. Scannen Sie Preise statt auf der Skala von unter einer Sekunde mit Oxidation und Reduktion von Verbindungen, die in Mikrosekunden. Durch Subtraktion Hintergrund aktuelle von der Sonde aus der resultierende Strom erzeugt, kann man eine Spannung vs. aktuelle Plot einzigartig für jede Verbindung erzeugen. Da die Zeitskala der Spannung Schwingungen bekannt ist, können diese Daten verwendet werden, um eine Darstellung des Stromes als Funktion der Zeit zu berechnen. Also, können die relative Konzentration der Verbindung ermittelt werden, solange die Anzahl der Elektronen bei jeder Oxidation übertragen und Reduktion man^{4 bezeichnet}.

Diese chemische Spezifität und hoher zeitlicher Auflösung machen FSCV ein leistungsfähiges Verfahren zur Erkennung von chemischen Konzentrationen in Vivoändern. Trotz dieser vielfältigen Vorteile erfordert diese Technik jedoch umfangreiches Fachwissen und teure Ausrüstung und Einrichtung. Darüber hinaus können nicht Nonelectroactive Neurotransmitter (z.B. Glutamat) mit dieser Technik gemessen werden. Technologische Fortschritte auf dem Gebiet der Elektrochemie⁵sowie Kommerzialisierung dieser Erfindungen hat glücklicherweise einen relativ einfachen Ansatz nicht elektroaktive Neurotransmitter im wach Verhalten Tiere messen eingeführt ohne zeitliche Präzision-a Technik bekannt als enzymatische Biosensor-Technologie. Diese Technik verwendet enzymatische Umwandlung des Neurotransmitters Nonelectroactive von Interesse in beiden Substrate elektroaktive Wasserstoffperoxid dazu gehört, das als eine amperometrischen Oxidation aktuelle erzeugt durch eine angewandte Potential^{5 erkannt wird} . Handelsübliche Biosensor-Sonden messen (siehe Abbildung 1) selektiv Analyten von Interesse von wettbewerbsfähigen Verringerung des Beitrags der endogenen Interferents. Im Falle von Glutamat der Beitrag der gemeinsamen interferent Ascorbinsäure (AA) konkurrierend der gemessene Strom sinkt auf durch Co Lokalisierung AA Oxidase auf die aktive enzymatische Oberfläche des Sensors nicht elektroaktive AA umwandeln Dihydroascorbate und Wasser. Darüber hinaus schließt eine negativ geladene Nafion Polymerschicht unter der Enzym-Schicht endogene anionische Verbindungen.

Diese gleichen Biosensor Versuchsaufbau kann elektroaktive Neurotransmitter wie in FSCV messen, aber es setzt stattdessen eine feste Potenzial Aufnahme⁶. Im Gegensatz zu der oszillierende Spannung in FSCV wird in eine feste-Potential-Aufnahme die Spannung auf den Redox Potenzial für den Analyten von Interesse gehalten. Zwar weniger chemisch selektive als FSCV, da mehrere Neurotransmitter die gleichen Redoxpotential in Hirnarealen haben können, die überwiegend in Richtung eines Neurotransmitters verzerren, überwiegt die schlüsselfertige Natur dieses Ansatzes das Fehlen von chemischen Spezifität.

Die Fähigkeit, elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter-Freisetzung in nahezu in Echtzeit zu messen und verknüpfen es mit bestimmten Verhaltens Ereignissen bietet Gelegenheit, konvergierenden Neurotransmitter-Freisetzung zu untersuchen. Dieses Manuskript erläutert die Verwendung dieses Systems, Dopamin und Glutamat Neurotransmission in Reaktion auf natürliche Belohnung in wach Verhalten Hamster zu befragen. Das Ziel dieses Papiers ist es, ausführlich den Prozess der Messung dieser Neurotransmitter-Freisetzung während Sexualverhalten in weiblichen Hamster, mit dem Ziel, die Machbarkeit für die Prüfung anderer Verhaltensweisen und experimentelle Paradigmen zu demonstrieren.

Hamster sind ein ideales Modell für den Einsatz in elektrochemischen Aufnahmen
Historisch gesehen, sind Ratten und Mäuse-Modelle in der Studie des Sexualverhaltens eingesetzt worden. Diese Nagetierarten engagieren sich in einer dynamischen Abfolge copulator, an denen zahlreiche weibliche Aufforderung Verhaltensweisen, die zählen-hopping, stechen und Ohr wackeln um das Männchen zu jagen und letztlich die weibliche⁷montieren zu verleiten. Die Montage durch das Männchen (mit oder ohne vaginale Penetration) dauert nur wenige Sekunden, in denen das Weibchen in ihrem Sexualverhalten Haltung (genannt Lordose) auch nur für ein paar Sekunden vor der Wiederaufnahme der aktiven Aufforderung Verhaltensweisen greift. Dieses Verhaltensmuster, bestehend aus hoher Aktivität, durchsetzt mit kurzen Perioden der Unbeweglichkeit, ist problematisch für die Messung von Neurotransmission im Verhalten der Tiere. Erstens kann der amperometrischen Aufnahmen, die nicht im Zusammenhang mit neuronalen Aktivität sind Bewegungsartefakte sein. Zweitens ist die Fortbewegung mit der Freisetzung von bestimmten Neurotransmittern in bestimmten Gehirnregionen verbunden. Zum Beispiel ist Dopamin-Freisetzung lokomotorischen Tätigkeit in den dorsalen und ventralen Striatum^8,9, Feststellung gekuppelt, die die Grundlage für die Mikrodialyse Messungen von Dopamin nach Psychostimulans gebildet Verwaltung-¹⁰. Weil die weiblich-typischen Aufforderung Verhaltensweisen in Most Nagetiere hoher lokomotorische Aktivität beinhalten und sind durch die Masse eines 10-minütigen Sexualverhalten Tests vertreten, dies macht es schwierig, die explizite Komponenten des Sexualverhaltens Veränderungen der Neurotransmission zuschreiben, die gemeinsam nur dauern Minuten.

Um die neurochemischen Profil des weiblichen Sexualverhaltens zu analysieren, diese Übungseinheit suchte eine Spezies gibt es minimale lokomotorischen Tätigkeit begleitende Sexualverhalten. Die copulator-Sequenz in syrischen Hamster (Mesocricetus Auratus) ist ideal für neurochemischen Aufnahmen Mangels Aufforderung Verhaltensweisen in der Regel bei Ratten und Mäusen¹¹gesehen. Infolgedessen werden weibliche Hamster eingeben und verwalten die Lordose-Haltung für bis zu 9 Minuten aus einen 10-minütigen Sitzung¹²testen. Mit dem Mangel an fremde lokomotorischen Bewegungen durch das weibliche, in Vivo erhalten Sie elektrochemische Aufnahmen, die Komponenten des sexuellen Interaktionen mit den männlichen zugeordnet werden können.

Copulator Kämpfe im Hamster
Nach der Einführung eines männlichen Reiz Tieres in der Prüfkammer wird das Männchen zunächst anogenitalen Untersuchung (AI) der Frau vor der Montage ihrer (Abb. 2A) führen. In Reihenfolge für das Männchen zu montieren muss das Weibchen übernehmen eine rezeptive sexuelle Haltung bekannt als Lordose, in denen sie wölbt sich ihr Rücken und ihr Schweif ablenkt, so dass die Montage männlichen Penis zu ihrer Vagina zugreifen kann. Das Männchen wird das Weibchen, umklammert ihre Hinterhand mit beiden Pfoten (Abbildung 2B), montieren und beginnen, in einem Versuch zu Penis eindringen (Abbildung 2C) stieß. Das Männchen wird montieren Sie das Weibchen (ohne Aufnahme) sowie etliche Male bevor Sie erreichen schließlich Ejakulation geleiten. Diese Abfolge von Halterungen und haftet führt die Ejakulation wird einen "copulator Kampf" bezeichnet. Männchen haben mehrere copulator Kämpfe innerhalb einer einzigen Sitzung.

Protocol

alle hier beschriebene Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Minnesota genehmigt und stehen im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹³ .

1. Tiere und Kanülierung Chirurgie

1. erhalten syrischen Hamster aus einer gemeinsamen Tier in ca. 55 Tage alt.
   Hinweis: Obwohl das Alter der Tiere wegen Einschränkungen der verschiedenen experimentellen Paradigmen variieren, für sexuelles Verhalten ist es wichtig, geschlechtsreifen Tiere zu erhalten, die alle etwa im gleichen Alter sind.
2. Haus-Tiere in einer kontrollierten Temperatur (22 ° C) und Beleuchtung (14 h Licht, gefolgt von 10 h dunkel mit Licht aus um 13:00 Uhr) Umgebung, mit Futter und Wasser zur Verfügung Ad Libitum außer während der Perioden der experimentellen Erprobung.
   Hinweis: Da Hamster saisonal zu reproduzieren, das 14:10 hell/dunkel-Zyklus imitiert ihre natürliche Aufzuchtbedingungen.
3. Nach einem 1-wöchigen Akklimatisierung an das Labor, aseptische bilaterale Ovariectomies und intrakranielle stereotaktischen Hohlräumen unter Vollnarkose (z. B. Pentobarbital) durchführen und verwalten geeigneten institutionell genehmigt postoperative analgetische und antibiotische Behandlung wie oben beschrieben ^{14 , 15}.
   Hinweis: Für die Studie des Sexualverhaltens sind Ovariectomies notwendig, um die endogene Hauptquelle von Sexualhormonen zu entfernen, so dass die Tiere gleichmäßig auf sexuelle Empfänglichkeit mit exogene Hormon in Übereinstimmung mit der experimentellen Timeline induziert werden können.
   1. Für die dopaminerge und glutamatergen Sonde Implantation, stereotaxically Implantat Reiseführer Kanülen (0,7 mm Durchmesser; Abbildung 3) in den Bereich des Interesses (z.B. dieser Übungseinheit gezielt dem richtigen Nucleus Accumbens (NAc)) wie an anderer Stelle schrittweise detailliert beschrieben ¹⁵.
      Hinweis: Obwohl die präsentierten Daten aus einzelnen Sensor Aufnahmen von einem Glutamat oder Dopamin Sonde pro Tier sind, ermöglicht dieses System für die gleichzeitige Aufnahme von bis zu 4 Sensoren in ein einziges Tier; So konnte 1-4 Kanülen implantiert werden, je nach gewünschten Versuchsdesign und Ergebnisse.
      1. Die Implantat-Koordinaten der Region mit einer stereotaktischen Atlas bestimmen (z.B., The Golden Hamster Brain von Morin & Holz), halten, beachten Sie, dass der Sensor 1 mm unterhalb der Kanüle in Hirngewebe hineinragt.
   2. Nach eine Kanüle stereotaxically an die gewünschte Stelle dorsal-Ventral gesenkt wird, bringt es an den Schädel mit einer Kappe aus dental Acryl, gesichert mit Edelstahl-Knochenschrauben und einen Kopf aus Plastik konstruiert montieren ( Abbildung 3 ; ¹⁵ für weitere Details siehe).
   3. Zu Testzwecken Kohlefaser, legen Sie eine Referenzelektrode (350 μm Durchmesser, 7,5 mm Gesamtlänge) in der kontralateralen Hemisphäre.
      Hinweis: Eine bestimmte Position oder Entfernung der Kanüle ist nicht erforderlich; Referenzelektroden können überall platziert werden, in der kontralateralen Hemisphäre, die am besten passt.

2. Biosensor und Kohlefaser Tests

1. nach 1 Woche der Erholung von der Operation, verwalten die Hormon Priming Therapie um sexuelle Empfänglichkeit zu induzieren.
   1. 10 µg Estradiol Benzoat in 0,1 mL Baumwollsaatöl subkutan zu injizieren (s.c.), ca. 48 h und 24 h vor das sexuelle Verhalten testen, um sexuelle Empfänglichkeit gegenüber den männlichen ¹¹ induzieren.
   2. Injizieren 500 µg Progesteron in 0,1 mL Baumwollsaatöl, s.c., 4 h vor der Einführung der männlichen sexuellen Empfänglichkeit ¹¹ induzieren.
2. Alle Tiere zu Beginn der dunklen Phase ihres täglichen Zyklus zu testen, wie soziale Verhaltensweisen von Nagetieren sind freibleibend unter weißem Licht und Rotlicht Prüfung Bedingungen ^{16 , 17 , 18}.
3. zu Testzwecken enzymatische Biosensor Glutamat, die Sensoren kalibrieren in Vitro ( Abbildung 4) vor der Verwendung als zuvor beschrieben, ^{15 , 19}.
   1. machen die Kalibrierung Lösungen frisch am Tag der Prüfung in 20 mL Glas Zentrifugieren Röhren. Lösen Sie für die Lösung des Analyten 7,4 mg L-Glutaminsäure in 10 mL ultra-reinen H ₂ O durch das Rohr vorsichtig umdrehen auf. Machen die interferent Lösung durch auflösen 176,1 mg AA in 10 mL von hochreinem H ₂ O.
   2. Einrichtung für die Kalibrierung indem ein Magnetrührer auf der Basis einer grundlegenden Labor Ring Stand. Legen Sie einen doppelwandigen 20-mL-Becherglas auf den Magnetrührer und Klemmen an Ihrem Platz mit einer mittleren 2-Stift-Klemme.
      1. Add ein magnetisches rühren Bar und 20 mL 100 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den doppelwandigen Becher. Verbinden Sie den doppelwandigen Becher mit zirkulierenden Wasserbad zu erhitzen die Pufferlösung bis 37 ° c
         Hinweis: Die enzymatische Biosensor-Kalibrierungen durchzuführen bei Körpertemperatur da die enzymatische Aktivität durch die Temperatur beeinflusst wird.
   3. Kalibrierung Sensorhalter auf den doppelwandigen Becher, und legen Sie einen Kalibrierung der 4-Kanal-Vorverstärker an der Spitze, mit einer rechtwinkligen Schelle sichern. Der Vorverstärker mit einem Daten Klimaanlage und Erwerb Gerät zur Aufzeichnung Kalibrierdaten verbinden.
   4. Testen, die Empfindlichkeit der einzelnen enzymatischen Biosensor Glutamat (oder anderen Analyten von Interesse für andere handelsübliche Biosensor Sonden z.B. Glukose) bevor die experimentelle Aufnahme durch die Platzierung der Sonde in die Kalibrierung Halterung oben auf eine Doppelwandige Becher, Eintauchen der Fernerkundung Hohlraum und ein Teil des Drahtes Silberchlorid (AgCl) Referenz in der Pufferlösung.
      1. Vor dem Anschluss jeder Sensor (bis zu 4) getestet mit einem Anschluss an eine Kalibrierung der 4-Kanal-Vorverstärker, initiieren eine neue Aufnahme auf der Computer-Schnittstelle frei herunterladbare Datenerfassungs-Software nutzen. Ermöglichen die Sensoren, eine stabile Basislinie zu erreichen.
   5. Beginnen die Analyten Injektionen hinzufügen, wenn die Sensoren eine stabile Basislinie erreicht haben. Verwenden Sie das Loch im Halter Kalibrierung Pufferlösung eine Pipettenspitze vorzustellen. Verwenden Sie das Werkzeug schnell wichtige Anmerkung in der Aufzeichnungssoftware, um zu kommentieren, wenn eine Injektion erfolgt.
      1. Machen 10 µM Zusätze von Glutamat durch Pipettieren 40 μL der Analyt-Lösung in der Pufferlösung. Warten Sie, bis des Sensors zwischen Ergänzungen zu stabilisieren. 3 Injektionen von Analyten Lösung hinzufügen, bevor Sie Hinzufügen einer einzigen Injektion von interferent AA-Lösung (50 μL-Injektionsvolumen für 250 μM Änderung der Konzentration).
         Hinweis: Die Kalibrierung ermöglicht für die Umstellung der Veränderungen in der amperometrischen Signal (gesehen während der enzymatischen experimentelle Aufnahme im Schritt 2.12) auf Glutamat Konzentrationsänderungen, falls gewünscht. Siehe Referenz ¹⁵ für schrittweise Anleitung. Die dopaminergen Sonden von diesem Labor verwendet werden während des Herstellungsprozesses von gewerblichen Anbieters kalibriert. Glutamat-Sonden müssen zum Zeitpunkt der Verwendung kalibriert werden, da ihre Sensibilität im Laufe der Zeit abnehmen kann, wie die enzymatischen Komponenten ¹⁹ verschlechtern. Da Kohlefaser-Elektroden nicht Abbau unterzogen werden, reicht die Kalibrierung durchgeführt von der Firma vor der Auslieferung entlang als tHier ist eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Beschädigung der dünnen Carbon-Faser (350 μm Durchmesser) durch zusätzliche Handhabung.
4. Linie die Prüfkammer mit Einstreu entnommen das Tier ' Hause Käfig s.
   Hinweis: Dadurch erhöht sich das Weibchen ' s Vertrautheit mit der Prüfung Kammer sowie setzt das Männchen sexuell stimulierende olfaktorischen Paarung Signale, die vom Weibchen in Reaktion auf die Behandlung von Estradiol verteilt wurden.
5. Leicht betäuben der Tiere vor dem Einsetzen der Sonde durch Isoflurane oder anderen flüchtigen Betäubung in einer Induktion Kammer.
6. Okklusiven Obdurator aus Leitfaden Kanüle entfernen und Einfügen der Kohlefaser-Elektrode oder enzymatischen Sonde durch Führungswelle.
7. Nach dem Einsetzen der Sonde, legen Sie das Tier in der Prüfkammer.
   Hinweis: Dieser Übungseinheit verwendet eine 10-gal Glas Aquarium (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), aber Runde Handelskammern flächentreue können auch eingesetzt werden.
8. Begin Aufzeichnung Video- und mal gesperrt amperometrischen Signal in eine handelsübliche Software-Programm, an anderer Stelle ausführlich beschrieben ¹⁵.
9. Schließen Sie den Sensor an das Aufnahmesystem: Potentiostaten über eine elektrisch abgeschirmte Kabel und eine elektrische Schwenk. Stabilisieren Sie den Sensoranschluss durch Aufschrauben einer Pin-Anlage auf dem Kopf montieren. Verstärken die Verbindung mittels Labor Film ggf..
   Hinweis: Ein maßgeschneiderte Connector musste beimessen Kohlefaser-Elektrode und Bezugselektrode Potentiostaten, während die enzymatische Glutamat-Sensoren direkt an die Potentiostaten angeschlossen werden können.
10. Ermöglichen den Sensor im Gehirn vor der experimentellen Prüfung equilibrate.
    Hinweis: Gleichgewichtherstellung Zeiten unterscheiden sich je nach Aufnahme-Sensor (z.B. enzymatische Sensoren benötigen 2-4 h Gleichgewichtherstellung, während Kohlefaser-Elektroden nur ca. 30 min benötigen). Wenn beide Arten von Sensoren implantiert werden, die enzymatische Sensor länger equilibrate.
11. Nach Sensor Gleichgewichtherstellung vorstellen ein Stimulus-Männchen in der Prüfkammer.
12. Im Anschluss an die erste Montage mit penile Einfügung (genannt eindringen) durch das Reiz-Männchen weiter Aufnahme für eine zusätzliche 10-30 min, abhängig von den experimentellen Zielen.
13. Verhaltens Prüfung, trennen Sie das Weibchen ' s Sensor.
14. Entfernen Sie beide Hamster aus der Prüfkammer. Die Einstreu zu entfernen und reinigen Sie die Kammer mit 70 % Ethanol.
    Hinweis: Aufgrund der kurzen Gleichgewichtherstellung für Kohlefaser-Aufnahmen erforderlich, können Schritte 2,3-2.14 wiederholt werden, um mehrere Tiere am selben Tag zu testen. Im Gegensatz dazu da die enzymatischen Sensoren ca. 4 h Gleichgewichtherstellung erforderlich, nur ein Tier pro Tag beschränkt möglich Inter unterliegt Schwankungen aufgrund von Unterschieden bei den Tieren testen ' circadiane Zeit getestet.

3. Opfer und Perfusion

1. nach Abschluss der Testphase tief betäuben den weiblichen Probanden mit einem euthanizing Mittel (z.B., dieses Lab verwendet eine intraperitoneale Injektion von 0,2 mL Phenytoin und Pentobarbital Lösung) .
2. Transcardially Durchspülen des Tieres mit 25 mM PBS, pH 7.6, entfernen alle zirkulierenden Blut, gefolgt von einer 20 min Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd-PBS.
3. Das Gehirn zu entfernen und postfix in ~ 30 mL der Lösung 4 % Paraformaldehyd in einem 50 mL konische Röhrchen über Nacht.
   1. Store das Gehirn in einer 10 % Saccharose-PBS-Lösung bis zu seriellen Abschnitt.
      Hinweis: Gehirne können bis zu 2 Wochen, mit wöchentlichen Saccharose Lösung Änderungen an Wachstumspotenzial von Verunreinigungen zu vermeiden gelagert werden.
4. Serielle Abschnitt des Gehirns in 40 µm durchschneidet der implantierten Region entweder mit einem eiskalten Mikrotom oder Kryostat wie oben beschrieben ¹⁹.
5. Scheiben seriell auf handelsüblichen Klebstoff beschichtete Folien montieren (oder ²⁰ zu sehen). Mindestens über Nacht trocknen lassen.
6. Die Folien mit Cresyl violetten Farbstoff, klar, färben und Deckglas wie oben beschrieben ²⁰.
7. Bild der Folien mit Hellfeld-Mikroskopie, um die anatomische Position des Sensors zu bestätigen.

4. Verhaltens Coding

1. Ansicht und beschriften Sie die Videos, die mit freier Software kommerziell zum herunterladen (siehe Tabelle der Materialien) in Zeitlupe zu genau Code Verhaltensweisen Zeit gesperrt, um das Signal der amperometrischen.
   Hinweis: Um die MATLAB-Code in der Analyse zu verwenden (siehe unten (), beschriften, start und Ende eines jeden der weiblichen ' s und männlich ' s Verhaltensweisen.
   1. Kommentieren StartLordosis im Rahmen wenn das Weibchen eine Dorsoflexion ihres Rückens initiiert und ihr Schweif nach oben Defekte. EndLordosis mit Anmerkungen zu versehen, wenn das Weibchen diese Haltung, die oft Auftritt beendet, wenn das Weibchen an einen anderen Speicherort in der Prüfkammer readjusts.
   2. StartAI beschriften, wenn das Weibchen in der Lordose-Haltung und das Männchen seine Schnauze gegen das Weibchen zieht ' s Anogenital Region, wo schnüffeln, lecken oder kuschelte ihr perinealen Region auftreten. EndAI beschriften, wenn das Männchen seine Schnauze aus unmittelbarer Nähe das Weibchen entfernt ' s Anogenital Region.
   3. StartMount mit Anmerkungen zu versehen, wenn das Männchen nähert sich und seine Vorderpfoten auf das Weibchen in einer Montage Haltung, unabhängig von der Ausrichtung des Mount Versuchs (z.B., Seite, Bürzel legt).
   4. StartIntromission beschriften, wenn erfolgreiche stoßen die montierten männlichen Penis auf das Weibchen zugreift ' s Vagina.
      Hinweis: Ein Eindringen ist verhaltensorientierte unterscheidbar von der montierten stoßen, die vor dem Eindringen, tritt auf, während das Männchen sichtbar seine Arme in Richtung seines Körpers zieht, sein Becken nach vorne stößt und Schwanze nach oben locken, zeigt eindringen (siehe < starke Klasse = "Xfig" > Abbildung 4 C).
      1. Gegebenenfalls kommentieren Ejakulation.
         Hinweis: Am Ende eines Paarung Kampf und in Verbindung mit einer erfolgreichen Eindringen, wird das Männchen ejakulieren. Obwohl man nicht in der Lage, die tatsächliche Emission zu visualisieren ist, männliche Hamster haben ein Merkmal treten Bewegung mit dem hinteren Fuß während einer eindringen ²¹, damit die Ejakulation beim Auftreten von der Fußbewegung beschriften.
   5. EndIntromission und EndMount gleichzeitig in den Rahmen zu beschriften, wenn das Männchen seine beiden Vorderpfoten entfernt hat und somit keinen Kontakt mit dem weiblichen hat. Aufgrund der häufigen Unfähigkeit zu visualisieren der Rücktritt, gleichzeitige code diese beiden Verhaltensweisen, um Konsistenz und Zuverlässigkeit zu ermöglichen, über Paarung Kämpfe.
      Hinweis: Ein Paarung Kampf folgt eine erfolgreichen Ejakulation oder ist, wenn das Weibchen die Lordose Haltung nach mindestens ein mount bricht.

5. Beispiel-Daten-Analyse

Hinweis: die Verwendung von Kohlefaser behoben-Potenzial und enzymatische Aufnahmen für Dopamin einNd Glutamat, ermöglicht bzw. die Fähigkeit, tonischen und phasischen Muster elektrochemische Release zu messen. Dieses Labor verwendet eine freie, kommerzielle Erfassungssystem und Software aufnehmen und konvertieren aufgezeichnet Signale von Analog auf Digital (bias 0,600 V, Sampling-Rate = 1 Hz).

1. Beschreibung der Beispiel-Daten-Analyse-Protokoll
   1. Obwohl andere Programme verwendet werden können, zu quantifizieren, tonischen und phasischen (transiente) Änderungen im aufgezeichneten elektrochemische Signal mit MATLAB.
      1. Für die dargestellten Daten berechnen das Tonikum-Signal mit einem beweglichen durchschnittliche Filter 50 Punkten. Eine nur vorübergehende normalisierte Darstellung des Signals wurde durch Subtraktion der Tonika-Signal aus den Rohdaten berechnet. Beim Identifizieren von phasischer Gipfeln gibt es verschiedene algorithmische Optionen (z.B. Beschriftung Spitzen als Änderungen im Signal mehr als 1 SD über dem Mittelwert).
      2. Identifizieren die Standorte dieser Gipfel, d. h., lokale Maxima, aus dem normalisierten Signal legen Sie mithilfe der MATLAB-Funktion Peakfinder mit der minimalen Peak Amplitude auf Root-Mean-Square des Signals. Die Lage der Gipfel aus dem normalisierten Signal erkannt wurde verwendet, um die Amplitude von jeder Gipfel zu extrahieren. Die Fähigkeit zu Gipfel erkennen ermöglicht die Identifikation jedes Mal gesperrt Verhalten, die zeitgleich mit oder fahren die relativen Höhepunkt in der neurochemischen untersucht werden kann.
   2. Segment der verarbeiteten Daten gemäß der behavioralen Anmerkungen (siehe Schritt 3), ein Schüler ' s t-Test wurde verwendet, um Unterschiede in der Tonika-Neurotransmitter-Ebene, das Auftreten von Transienten und die Amplitude der bewerten Transienten während der Pre-Paarung Kampf Lordose versus Lordose während der Paarung Kämpfe. Um Änderungen an tonische Muster des elektrochemischen Release zu messen, wurden die Datenpunkte, die während der Lordose-Position direkt vor einer Paarung Kampf (d. h. vorab Paarung Kampf Lordose) der Datenpunkte während eines Anfalls Paarung im Vergleich zu Sitzung mit einem t-Test
2. Vorbereitung der Rohdaten für die beschriebenen Daten-Analyse-Protokoll
   Hinweis: wie gesagt, auch wenn andere Programme oder Analysen gleichermaßen praktikable Möglichkeiten sind, um den MATLAB-Code oben beschrieben, verwenden die Rohdaten müssen bereit sein wie folgt:
   1. die Annotation und Spannung-Dateien exportieren. Dazu, unter die ' Datei ' Registerkarte, wählen Sie die ' Export ' funktionieren, und wählen Sie die ' Anmerkungen ' Registerkarte, um die Anmerkungen zu speichern. Unter der ' Datei ' Registerkarte, wählen Sie die ' Export ' Funktion und wählen Sie den " TSV ' Registerkarte, um die Spannungsmessungen als einer TSV-Datei-Erweiterung speichern.
   2. Jede Datei mit einem Tabellenkalkulationsprogramm öffnen und speichern Sie als ' Xls/Xlsx ' Dateien mit MATLAB kompatibel machen.
      Hinweis: Für die ' Annotation ' Datei, gibt es zusätzliche Anmerkungen, die manuell müssen nach der Ausfuhr in ein Tabellenkalkulationsprogramm diktieren beginnen und Ende sowohl die Pre-Paarung Kampf Lordose (kommentiert als PreMBlordorsis hinzugefügt ) und der Paarung Kampf, so dass diese Zeitpunkte direkt verglichen werden können, wie bereits erwähnt in Schritt 5.1.2.
   3. Beschriften Beginn des Pre-Paarung Kampf Lordose (StartPreMBlordosis) zur gleichen Zeit eine Lordose Verhalten beginnt (StartLordosis), die auch beinhaltet eine mount Verhalten, und auch zum Jahresbeginn eine neue Paarung Kampf, wenn das Weibchen in der Lordose-Haltung bleibt.
   4. Ende der Pre-Paarung Kampf Lordose (EndPreMBlordosis) kommentieren, wenn das erste mount beginnt.
   5. Beschriften zum Jahresbeginn eine Paarung Kampf (StartMB) zur gleichen Zeit von der EndPreMBlordosis, dies bedeutet Beginn der Paarungszeit Bout.
   6. Anmerkungen zum Jahresende eine Paarung Kampf (EndMB) Ende entweder ein montieren, die eine Ejakulation enthält (siehe Punkt 4.1.4.1), oder das Weibchen nach ' s Beendigung der Lordose Haltung (EndLordosis).

Representative Results

Mit der elektrochemischen und Verhaltensstörungen Codierung oben beschriebenen Methodik, hat dieser Übungseinheit begonnen, tonischen und phasischen Schwankungen von Dopamin und Glutamat bei in-Vivo -Aufnahmen des Sexualverhaltens zu charakterisieren. Durch die zeitlich genaue Art dieser Methodik können wir genauer Neurotransmission während sexuelles Verhalten charakterisieren; sowie zuschreiben bestimmte Änderungen in Release-Muster mit entsprechenden tonischen Veränderungen während der Paarung Kämpfe und entsprechenden vorübergehende Schwankungen während des Weibchens Erhalt der einzelnen copulator Verhaltensweisen(z. B.eindringen, Ejakulation) von der Montage, männlich.

Insbesondere haben wir diese Methode um zu konzentrieren sich auf die Freigabe-Muster von Dopamin und Glutamat in der NAc von eigenen Tieren zu messen. NAK ist eine kritische Region Belohnung Verarbeitung²² beteiligt und wurde als integraler Region in die Belohnung Aspekte des sexuellen Verhaltens²³beschrieben.

Wir beobachteten, dass während Sexualverhalten, Weibchen einen Tonikum Anstieg der dopaminergen Ebenen in der NAc-Kern zeigen während der Paarung Kämpfe (Abbildung 5). Während diese tonische Änderungen sind kann für alle Paarung Kämpfe gezeigt die oben beschriebenen Methodik messen Tonikum Änderungen zwischen jeder Paarung Bout und erhöhen somit die zeitliche Identifikation von Veränderungen zur Tonika Ebenen der Freisetzung von Neurotransmittern in der gesamten die gesamte Sitzung. Darüber hinaus kann dieser beschriebenen Methode lokalisieren phasisch Änderungen und zeitlich wahrscheinlich mit diese phasisch Neurotransmitter Schwankungen verknüpften Verhalten abbilden. Diese vorläufigen Ergebnisse zufolge insbesondere während der Paarung Kämpfe, dopaminergen Transienten in der NAc entstehen beim vaginalen einführen (Eindringen) durch das Männchen (Abbildung 6). Darüber hinaus ist diese Assoziation mit eindringen, mit vernachlässigbar dopaminerger Reaktionen auf andere copulator Verhaltensweisen, z. B. die AI.

Ein ähnliches Muster wurde in anderen Tieren hinsichtlich Glutamat-Freisetzung, mit schnellen Transienten beobachtet, die einzelnen haftet im dorsalen NAc Kern während eines copulator Kampfes (Abbildung 7) entsprechen. Dieses Muster ist Region spezifisch, ohne erkennbare Signal in die NAc-Shell oder Medial caudatus von anderen Tieren auftreten.

Abbildung 1 : Enzymatische Biosensorik.
Standard-Herstellung von handelsüblichen enzymatische Biosensor-Sonden, die Neurotransmitter über die Enzym-vermittelten Verarbeitung (linkes Bild) zu erkennen. Bei glutamatergen Sensoren, Glutamat-Oxidase wird eingesetzt in der enzymatischen Schicht (rechtes Bild) Nonelectroactive Neurotransmitter zu elektroaktive Wasserstoffperoxid (H₂O₂) zu konvertieren, das durch Oxidation erkannt wird bei der Platin-Iridium (Pt-Ir) Elektrode. Ascorbinsäure (AA), eine gemeinsame Interferent, die auf dem gleichen Potential oxidiert wird ist über eine Ergänzung von AA-Oxidase auf der Ebene der enzymatischen ausgeschlossen, die der Interferent in Nonelectroactive Wasser umwandelt. Andere negative elektroaktive Interferents im Gehirn sind über eine passive selektive Membran ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Komponenten ein Hamster Paarung Bout.
Hamster bestehend aus ein Paarung Kampf aus einer Folge von copulator Verhaltensweisen, bei denen das Weibchen in der immobile Lordose-Haltung bleibt, während die männlichen Anogenitally untersucht (A), Halterungen (B)und Eindringen erreicht (C). . Beachten Sie, dass ein Eindringen ist verhaltensorientierte unterscheidbar von der Montage, wie das Männchen seine Arme in Richtung seines Körpers zieht, stößt sein Becken nach vorne und locken Schwanze nach oben, zeigt eindringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Skull Cap Konstruktion.
Reiseführer Kanülen, Knochenschrauben und zahnärztliche Acryl werden in den Bau von einem Käppchen verwendet, um Einfügung von Kohlefaser oder enzymatischen Sonde zu ermöglichen (siehe¹⁵ schrittweise Einzelheiten). Diese Abbildung zeigt eine einzelnes Kanüle Implantat über die richtige NAc für eine enzymatische Sensor (keine implantierten Bezugselektrode) und Kunststoff-Kopf-Halterung für Sensor Stabilität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Glutamat Biosensor Kalibrierung.
Die Empfindlichkeit der einzelnen Biosensor zu Glutamat ist getestet in Vitro vor experimentelle Aufnahme von 10 µm Zusätze von Glutamat (grün) bei 37 ° C (da die enzymatische Aktivität durch die Temperatur beeinflusst wird). Jeder Sensor wird bestätigt, um Ascorbinsäure (AA; rot) oder Dopamin (DA; blau) nicht mehr reagiert werden. Diese Kalibrierung ermöglicht die Umwandlung von Änderungen in der amperometrischen Signal während experimentelle Aufnahme zu Veränderungen in der Glutamat-Konzentration zu sehen.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Tonic erhöht Dopamin während eines Anfalls Paarung.
A. Beispielder stilisierter Kampf Lordose Signal vs. Paarung Kampf Lordose Signal. premating Tonic-Dopamin-Freisetzung zu messen, wurden die konduktometrische Antworten auf Dopamin-Spiegel während der Lordose vor einer Paarung Kampf (MB) während ein MB verglichen. Graue Felder zeigen Lordose vor einem MB. BLUE-Boxen geben Lordose bei einem MB. B. repräsentative Quantifizierung von einem Tier die mittlere Spannung zwischen PreMB Lordose und MB Lordose zu vergleichen. Fehlerbalken zeigen Standardfehler des Mittelwertes (SEM) und Sternchen zeigt signifikanten Unterschied (p-Wert < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Vertreter Dopamin Spur.
Phasisch Freisetzung von Dopamin soll mal gesperrt haftet aus das Männchen in den dorsalen NAc-Kern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : Vertreter Glutamat Spur.
Glutamat Transienten entsprechen einzelnen haftet aus das Männchen im dorsalen NAc Kern während einer längeren sexuellen Erfahrung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Obwohl relativ einfach, können einige Probleme entstehen, wenn diese Technik beschäftigt. Erstens muss die stereotaktischen Platzierung der Sonden präzise sein: im Gegensatz zu Mikrodialyse, die einen größeren Radius das extrazelluläre Milieu rund um die Sonde zu Proben, ermöglicht diese Technik nur die Messung eines Neurotransmitters, die direkt in Berührung kommt mit der Sonde. Zweitens bei der Kohlefaser-Aufnahme durch die geringe Breite der Faser, Bruch auftreten kann, und die Sonde muss mit bewusste Sorgfalt eingesetzt werden. Im Falle von glutamatergen Biosensoren kann enzymatischen Abbau auftreten, wenn die Sonde nicht innerhalb der garantierten Zeitrahmen von 3 Wochen verwendet wird. Glücklicherweise alle diese Fragen sind adressierbare und mit Sorgfalt und Liebe zum Detail beseitigt werden können.

Eine potenziell problematische Einschränkung entsteht in der Besonderheit der fest-Potential Kohlefaser-Aufnahmen. Weil das angewandte Potenzial für Dopamin mit anderen Monoamine wie Noradrenalin, zusammenfällt, wenn die Aufnahmen in den Bereichen vorgenommen werden, die beide Neurotransmitter freisetzen kann als dieser Mangel chemische Spezifität der Interpretation der Ergebnisse einschränken. In der NAK stellt dies ein großes Problem mit Dopamin wird die primäre Katecholamin Sender²⁴nicht dar. Da etwa 98 % der Zellen in NAc mittelgroßen bedornten Neuronen, die auf dopaminergen Neurotransmission²⁴reagieren sind, das Signal ist voreingenommen gegenüber Erkennung von Dopamin und erleichtert die Verwendung von dieser Turnkey-Ansatz.

Ein weiterer Vorteil dieser enzymatischen Biosensor und fixiert-Potential Kohlefaser-recording-System ist, dass Dual-Sonde Aufnahmen durchgeführt werden können, so dass elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter wie Dopamin und Glutamat in gemessen werden kann das gleiche Tier gleichzeitig. Obwohl die hier vorgestellten Daten aus Aufnahmen in separaten Tiere kommen, können diese Techniken gleichzeitig eingesetzt werden, so dass man die Konvergenz der Neurotransmission in mehreren Hirnregionen oder in der gleichen Region bilateral beurteilen kann. Kombination von Aufnahmen innerhalb der selben Tier oder Vergleich der Aufnahmen über Tiere wie hier gezeigt sind beide mächtige Werkzeuge in der Aufklärung der Mechanismen hinter Netzwerkverbindungen und Signaltechnik.

Zusammenfassend lässt sich sagen zeigt dieses Papier die leistungsstarke Techniken der enzymatischen Biosensoren und fixiert-Potential Aufnahme mehrere elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter, die unter Verwendung einer einzigen Versuchsaufbau zu messen. Obwohl die Daten hier stammen aus einzelnen Neurotransmitter Aufnahmen über mehrere Tiere vorgestellt, dieses System bietet die Möglichkeit, aus bis zu 4 Sensoren in ein Tier aufnehmen gleichzeitig¹⁵. Die Probenergebnisse präsentiert gemeinsam geben Einblick in schnellen Neurotransmission in der weiblichen Hamster aus bestimmten Mustern der copulator Stimulation durch das Männchen. Darüber hinaus zeigen diese Experimente mal gesperrt Antworten der dopaminergen und glutamatergen Transienten in der NAc-Kern des Weibchens Eindringen von Male, was darauf hindeutet, dass diese Version für verschiedene lohnende Eigenschaften der Codierung verantwortlich sein können sexuelles Verhalten. Unser Ziel ist es weiterhin unter Verwendung der Paarung Musters in weiblichen syrischen Hamster, ein umfassenderes Bild des Verhältnisses von in Vivo Dopamin und Glutamat-Freisetzung und die zugrunde liegenden Schaltung auf einzelne Komponenten der copulator Reize zu entwickeln von den Männchen. Wir glauben, dass die Fähigkeit, die Muster dieser Neurotransmitter prägen nicht nur von einer Grundlagenforschung Perspektive²³, sondern auch mögliche therapeutische Ansätze für pathologische Formen der belohnen solche Aufklärung nützt als Drogensucht²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.