Summary
自然やりがいのある行動の中にドーパミンやグルタミン酸高時間分解能のリリースを測定する炭素繊維電極と酵素バイオ センサー技術を使用して固定電位電流記録の使用の詳細を説明しますメスのハムスター。
Abstract
急速な時間スケールでの伝達物質の放出を測定する機能により、特定の動作または操作にリンクする神経伝達のパターン基になる機構と回路の解明で強力なツールです。マイクロダイアリシス法は、脳に興味のほぼすべての検体を測定する何十年も使用されています、この手法時間的解像度に限界があります。また、高速循環ボルタンメトリーは一時的に正確な非常に敏感です。ただし、技術的に困難な本法は興味の analyte の electroactivity に依存しているので、nonelectroactive 物質 (例えば、神経伝達物質グルタミン酸) を検出する可能性がなくなります。固定ポテンシャルをアンペロメトリーと時空間精度ゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質を測定する酵素バイオ センサーを組み合わせたターンキー システムの使用の詳細を説明します。これらの 2 つの強力な技術の組み合わせ、比較的簡単に強壮剤や一過性の神経伝達の測定により、複数の神経伝達物質の同時録音が可能します。本稿の目的は、ドーパミンやグルタミン酸神経伝達体内表示の究極の目標をハムスターの (すなわち、性行動) 当然のことながらやりがいのある動作を使用して測定のプロセスを示すため、その他の行動および実験パラダイムを調べるためこのアッセイの技術的可能性は。
Introduction
目を覚まし行動中の動物の伝達物質の放出を測定する機能により、神経伝達の両方を生み出す機構と回路を調査するための強力なツールの時空間パターンの特定の動作をリンクする研究者自然リアルタイムでオペラント行動。歴史的に、脳1の細胞外の環境の両方の電気的反応性、非反応性の物質を測定するマイクロダイアリシスを採用されています。この技法は、先端が中空の半透膜2の小さいシャフトから成るマイクロダイアリシス プローブを細胞外液に類似のイオン組成の水溶液の連続的な流れを使用します。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、によってその後の分析のための間隔で収集される前に受動の拡散によって半透膜が出来る神経伝達物質または興味の他の検体プローブの挿入後、分析化学技術を区切るには、一般に利用を識別して異種混合物3のコンポーネントを定量化します。
マイクロダイアリシス興味の事実上すべての検体を測定する使用することができます敏感な手法ですが、時間の分解能は低く、およそ万分1,2分の最大サンプリング レート。高速スキャン サイクリックボルタンメトリー (FSCV)、電気活性種の酸化還元電位に依存する技術の発明は、細胞外液に興味の analyte の瞬時濃度近く解明できます。簡単に言うと (ロビンソンらを参照してください。4広範なレビューのため)、速い時間スケール4三角波ファッションに電圧を上下させる電極を適用します。電圧は、適切な範囲で、目的の化合物が繰り返し酸化して縮小しました。この酸化し削減微小交流電流を作成する電子の動きになります。スキャン レート酸化マイクロ秒単位で発生している化合物の還元とサブ秒スケールの場所を取る。現在の結果からのプローブによって作成された現在の背景を引く、現在プロットの各化合物に固有対の電圧を生成できます 1 つ。電圧振動のタイム スケールが知られているので、これらのデータは、現在のプロットを時間の関数として計算する使用できます。したがって、各酸化で転送された電子の数と還元反応が4を知られている限りは、化合物の相対濃度が決定されるかもしれない。
この化学的特異性と高い時間分解能 FSCV体内の化学成分の濃度変化を検出するための強力な技術を確認します。ただし、これらのマニホールドの利点にもかかわらず技術的なノウハウと高価な機器、セットアップにこのテクニックが必要。さらに、この手法を使用して、nonelectroactive 神経伝達物質 (例えばグルタミン酸) を測定できません。幸いなことに、これらの発明の商品化と同様、電気化学5の分野で技術の進歩は目を覚まし行動中の動物の非ゲルロボットの神経伝達物質を測定する比較的単純なアプローチを導入しています時間精度、テクニックを損なうことがなく酵素バイオ センサー技術として知られています。この手法は、あるゲルロボット過酸化水素応用可能性5 によって生成されたアンペロ メトリック酸化電流として検出される 2 枚の基板に関心の nonelectroactive 神経伝達物質の酵素的変換を使用してください。.市販バイオ センサー プローブ選択的に競争力のある内因性接しないの貢献を減らすことによって興味の検体を測定 (図 1参照)。グルタミン酸、場合共通 interferent アスコルビン酸 (AA) の貢献は競争力のある減測定電流に共同非ゲルロボット AA に変換するセンサーの活性酵素表面に AA オキシダーゼのローカライズdihydroascorbate と水。さらに、酵素層の下に存在負荷電ナフィオン膜は内因性アニオン性化合物を除外します。
この同じバイオ実験のセットアップは、FSCV のようにゲルロボットの神経伝達物質を測定できますが、代わりにそれは固定電位記録6を採用しています。FSCV で、振動電圧とは対照的で固定電位記録電圧は抑えている酸化還元で興味の analyte の潜在的です。このアプローチのターンキーの性質が化学物質の欠如を上回る圧倒的に 1 神経伝達物質に向かって傾斜する脳領域の同じ酸化還元電位、あるかもしれない複数の神経伝達物質として FSCV より少ない化学選択的ですが、特異性。
ほぼリアルタイムでゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質解放を測定し、特定の行動イベントにリンクする機能では、収束の伝達物質の放出を検討する機会を提供します。この原稿は、目を覚まし行動ハムスターにおける自然な報酬への応答でドーパミンやグルタミン酸の神経伝達を尋問するこのシステムの使用を詳しく説明します。本稿の目的は、性的行動その他の行動および実験パラダイムを調べるため実現の可能性を示すことを目標に、雌ハムスターの中にこの伝達物質の放出を測定するプロセスを詳しく説明することです。
ハムスターが電気化学的録音で使用するための理想的なモデル
歴史的に、ラットとマウスのモデルは、性行動の研究で採用されています。これらの齧歯動物種は耳がぴくぴくを追跡し、最終的にマウント女性7男性を誘惑するホッピング、ダーツなど多数の女性の勧誘行動を含む動的交尾シーケンスに従事します。(膣の浸透の有無にかかわらず) 男性による取付けは続きます、ほんの数秒、アクティブな勧誘行動を再開する前に、数秒間だけ中に女性を彼女の性的行動の姿勢で (前彎と呼ばれる) も行っています。この動作、不動の短い期間と散在している活動の高レベルの構成のパターンは動物の行動の神経伝達を測定する問題です。まず、神経活動とは無関係なアンペロ メトリックの録音で運動の成果物もあります。第二に、歩行が脳の特定領域の特定の神経伝達物質のリリースに関連付けられます。たとえば、ドーパミン放出は、背側と腹側線条体8、の9、マイクロダイアリシス ドーパミン精神刺激を次の測定のための基礎を形作った発見自発運動に結合されて管理10。Mos の女性-典型的な勧誘行動神経伝達の変化を総称して最後だけ性行動の明示的なコンポーネントに帰することは困難、t 齧歯動物の歩行活動の高レベルを含む、10 分性行動テストの大部分によって表されます分です。
女性の性行動の神経化学的プロファイルを分析するには、この演習は、性行動に伴う最小限の自発運動がある種を求めた。ハムスター (ん) の交尾のシーケンスは通常のラット及びマウス11見て勧誘行動の不足のため神経の録音に最適です。結果として、雌ハムスターが入力し、セッション12をテスト 10 分から 9 分の上向きの前弯姿勢を維持します。生体内で女性余分な歩行運動の欠如と男性と性的な相互作用のコンポーネントと関連付けることができる電気化学的録音が得られます。
ハムスター交尾発作
試験室に男性の刺激の動物の紹介の後、男性は最初彼女 (図 2A) をマウントする前に女性の性器調査 (AI) で従事します。マウントする男性に、女性は前弯で彼女は背中のアーチし、取付の男性は彼女の膣への陰茎のアクセスを得ることができますので、彼女の尾を偏向として知られている受容性姿勢を仮定しなければなりません。男性は両方の足 (図 2B) と彼女の後半部を握りしめる女性をマウントし、陰茎あたって (図 2C) を得るために試みに突っ込み始めます。男性は射精を最終的に達成する前に回数を intromit し同様 (挿入) することがなく女性がマウントされます。マウントと射精につながる intromissions のこのシーケンスは、「交尾試合」と呼ばれます。男性は、単一セッション内で複数交尾一続きがあります。
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Protocol
ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い、公認された機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ミネソタの大学のここで説明したすべての手順 13.
1 です動物とカニューレ装着手術
約 55 日齢で一般的な動物業者から- 取得シリアのハムスター。
。 注: は動物の年齢は、さまざまな実験パラダイムの制約により異なりますが、性的行動のそれはすべてほぼ同じ時代の性的に成熟した動物を得ることが重要です 。
- 家動物制御温度 (22 ° C) および (10 h 13:00 h でライトを暗い続いて 14 h 光) の照明環境、食料と水使用可能な 自由 を除く実験の期間中にします
。 メモ: ハムスターの季節再現、以来この 14:10 明暗サイクルを模倣の自然繁殖の条件 。
- 次の研究室に 1 週間の順応、無菌の二国間 ovariectomies と (例えば、ペントバルビ タール)、全身麻酔下で頭蓋内脳定位固定装置深くすべての残を実行し、管理適切な制度上の承認術後の鎮痛剤と抗生物質の治療は前述した 14 , 15
。 注: 性的行動の研究、ovariectomies は動物が一様に誘導され、性的感受性実験のタイムラインに従って外因性ホルモンと性ホルモンの主要な内因性のソースを削除する必要です。- ドーパミンやグルタミン酸作動性のプローブ注入用インプラント ガイド カニューレ (0.7 mm 径のてんかん 図 3)関心の領域に (例えば、この演習は、右側坐核 (NAc) を対象とした) 15 段階的詳細他の場所で説明するよう
。 注: 動物ごとの 1 つのグルタミン酸やドーパミン プローブの単一センサー録画から提示されたデータが、このシステムにより単一動物; 最大 4 センサーの同時記録にしたがって、必要な実験的なデザインや成果に応じて 1-4 カニューレを埋め込むことが。- 脳定位固定装置アトラスを使用して興味の領域のインプラントの座標を決定する (例えば、Morin によって ゴールデン ハムスター脳 & 木)、センサーでは延びて脳組織のカニューレから下方 1 mm のことに留意 。
- カニューレはてんかんを下げた後目的の背腹軸位置、歯科アクリル、ステンレス鋼骨ねじとプラスチック製のヘッドで保護から構築されたキャップを使用して頭蓋骨に貼ってマウント ( 図 3;詳細については、 15 を参照してください).
- 炭素繊維のテスト、対側半球に参照電極 (350 μ m 径、全長 7.5 mm) を挿入します
。 注: 特定の場所またはカニューレからの距離は必要ないです。参照電極は便利です対側半球にどこでも置かれるかもしれない 。
- ドーパミンやグルタミン酸作動性のプローブ注入用インプラント ガイド カニューレ (0.7 mm 径のてんかん 図 3)関心の領域に (例えば、この演習は、右側坐核 (NAc) を対象とした) 15 段階的詳細他の場所で説明するよう
2。バイオ センサーと炭素繊維のテスト
- 次の手術からの回復の 1 週、性的感受性を誘発するホルモン プライミング療法を管理します。
- 綿実油の 0.1 mL 安息香酸エストラジ オールの 10 μ g を皮下注入 (sc) は、約 48 時間、性行男性 11 に向けて性的感受性を誘導するために、テスト前に 24 h 。
- プロゲステロン綿実油、サウスカロライナ、性的感受性 11 を誘導する男性の導入前に 4 h の 0.1 mL の注入 500 μ g.
- 齧歯動物の社会的行動は、白色光と赤色光のテスト条件 16 , 17 の変質に彼らの毎日のサイクルの暗期の開始時にすべての動物をテスト, 18.
- 酵素バイオ センサー グルタミン酸はテストのため、センサー調整 体外 ( 図 4) 15 , を前述のように使用する前に 19.
- 確認校正ソリューション 20 ミリリットル ガラスのテストの日に新鮮なの遠心チューブ。検体ソリューション超純粋な H 2 O の mL の 10 にチューブを軽く反転による L-グルタミン酸の 7.4 mg を解散します。176.1 mg AA 10 mL の超純水 H 2 o. を溶解することにより interferent のソリューションを作る 基本的な実験室のリング スタンドのベースに磁性攪拌器を置くことによって校正用
- をセット。磁性攪拌器、上にジャケット 20 mL ビーカーを置き、中 2 芯クランプを使ってその場でクランプします。
- 追加電磁攪拌バーと 100 mM リン酸 20 mL は緩衝生理食塩水 (PBS) ジャケットのビーカーに。37 に緩衝液を熱循環水浴にジャケットのビーカーを接続 ° C
注: 酵素バイオ センサー校正で実行されなければなりません体温温度による酵素活性の影響を受けるので 。
- 追加電磁攪拌バーと 100 mM リン酸 20 mL は緩衝生理食塩水 (PBS) ジャケットのビーカーに。37 に緩衝液を熱循環水浴にジャケットのビーカーを接続 ° C
- ジャケット ビーカーの上にセンサー校正ホルダーを配置し、場所に直角クランプを使用して固定、上に 4 チャンネルのキャリブレーション プリアンプを設定します。レコード調整データにデータ調節/集録デバイスにプリアンプを接続します 。
- テスト グルタミン酸 (またはその他市販バイオ センサー プローブ など ブドウ糖のための興味の他の検体) 各酵素バイオ センサーの感度は実験的録音の前に頂上に校正ホルダーにプローブを配置することによって、ジャケットのビーカーは、センシングの空洞と緩衝溶液に塩化銀 (AgCl) の参照線の一部水没します。
- 4 チャンネルのキャリブレーション プリアンプのポートにテストされている (4) までの各センサーを接続する前に、無料ダウンロード可能なソフトウェアを利用したコンピューターのインターフェイスに新しい記録を開始します。安定した基準に到達するセンサーを許可します 。
- センサーが安定したベースラインに達する試料注射の追加を開始します。緩衝液をピペット チップを紹介するのに校正ホルダーの穴を使用します。レコーディング ソフトウェアでクイック キー注釈ツールを使用して、注入が行われたときに注釈を付けます。
緩衝液に試料溶液の
- を作る 10 μ M 追加分注 40 によってグルタミン酸の μ L。センサー追加間安定するを待ちます。Interferent AA 溶液 (50 μ L 注入量濃度で 250 μ M の変更のために) から単一の注入を追加する前に試料溶液 3 注射を追加します
。 注: 校正変換が可能 (手順 2.12 で酵素実験記録中に見られる) 電流信号の変化のグルタミン酸濃度の変化に必要な場合。段階的な命令の参照 15 を参照してください。この実習で使用されるドーパミン作動性プローブは、商用プロバイダーによって製造工程で校正されています。酵素の成分が低下する 19 の感度は時間をかけて減少することができますよう、使用時のグルタミン酸プローブを校正する必要がありますです。出荷前に会社が行うキャリブレーションが t としてに沿って十分な炭素繊維電極が劣化を受けないのでここでは、追加処理を薄い炭素繊維 (350 μ m 径) の損傷の可能性が高まっています 。
- を作る 10 μ M 追加分注 40 によってグルタミン酸の μ L。センサー追加間安定するを待ちます。Interferent AA 溶液 (50 μ L 注入量濃度で 250 μ M の変更のために) から単一の注入を追加する前に試料溶液 3 注射を追加します
- 動物から寝具を備えた試験室を行 ' s ホーム ケージ
。 注: これは女性を増加 ' s 精通テスト室、エストラジ オールの処置への応答の女性によって配布された嗅覚の交尾手がかりを性的刺激する男性を公開するだけでなく 。
- 軽くイソフルランまたは誘導室内の揮発性麻酔薬別でプローブの挿入前に動物を麻酔します 。
- ガイド カニューレから閉塞 obdurator を削除し、炭素繊維電極またはガイド シャフト、酵素のプローブを挿入します 。
- プローブの挿入後、試験室で動物を配置します
。 注: この演習で 10 gal ガラス水槽 (24.5 x 48.9 x 29.4 センチメートル) を使用が、正積のラウンド室も使用されるかもしれない 。
- 15 詳細を他の場所で説明した市販のソフトウェア プログラムのビデオ、時間ロック電流信号の記録を開始します 。
- 記録システムにセンサーを接続する: 電気的シールド ケーブル、電気回転を介して電気化学測定装置。ヘッド マウントにピン添付ファイルをねじ込んでセンサー接続を安定させます。必要に応じてラボ フィルムを使用して接続を強化します
。 注: カスタマイズされたコネクタは酵素グルタミン酸センサーは、ポテンシオスタットに直接接続できますが、ポテンシオスタットに炭素繊維電極と参照電極の両方を添付するために必要な 。
- 実験的テストする前に、脳の平衡にセンサーを許可します
。 注: 平衡時間は記録センサーにより異なります (例えば、酵素センサーを必要とする 2-4 h 平衡炭素繊維電極のみ約 30 分を必要としながら)。長時間酵素センサー センサーの両方のタイプは、注入した場合平衡します 。
- センサー平衡の後に、試験室に刺激男性を紹介します 。
- 刺激男性陰茎挿入 (と呼ばれる導入) した最初のマウント、次の実験の目的に応じて追加の 10-30 分のための録音を続行します 。
- 次の行動テスト切断女性 ' s センサー 。
- は、両方のハムスターを試験室から削除します。寝具を外し、70% エタノールを使用して洗浄します
。 注: 炭素繊維の録音に必要な簡単な平衡、ため手順 2.3 2.14 繰り返すことができます同じ日に複数の動物をテストします。対照的に、酵素センサーは、平衡の約 4 時間を必要とするため動物の違いのため可能な限りの被験者間変動を制限を 1 日あたり 1 つだけの動物をテスト ' テスト時における概 。
3。犠牲と灌流
- 至らせるエージェントの女性被験者の麻酔テスト期間の結論に続く深く (例えば、このラボ使用 0.2 mL フェニトインとペントバルビ タール ソリューションの腹腔内投与).
- Transcardially 25 mm PBS、pH 7.6, 4% パラホルムアルデヒド PBS を使用して 20 分固定が続くすべての循環血液を削除する動物を灌流します 。
- 脳を削除し、で後置 〜 50 mL の円錐管は一晩で 4% パラホルムアルデヒド溶液 30 mL。
シリアル セクションに準備ができるまで
- ストア 10% 脳ショ糖 PBS ソリューションです
。 注: 脳に格納する汚染物質の潜在的な成長を避けるために毎週ショ糖ソリューションの変更の 2 週間です 。
- ストア 10% 脳ショ糖 PBS ソリューションです
- シリアル セクション 40 μ m 脳スライスどちらかと注入部を凍結ミクロトームやクライオスタットは 19 を前述します 。
- 市販の接着剤コーティング スライドで連続スライスをマウント (または 20 を参照してください)。少なくとも一晩乾かします 。
- 染付クレシル バイオレット、クリア、スライドを汚し、coverslip 前述した 20 。
- イメージ センサーの解剖学的位置を確認するため明視野顕微鏡を用いたスライドです 。
4。行動コーディング
- ビュー無料商業ダウンロード可能なソフトウェアを使用してビデオに注釈を付けると (材料表 参照) 正確にコード動作電流信号に時間ロックをスローモーションで
。 注意: MATLAB コード分析で使用する (以下 ) 参照してください、開始 および女性のそれぞれの 最後 に注釈を付ける ' s と男性 ' s 動作。- 女性背中の dorsoflexion を開始し、欠陥の彼女の尾を上向きにすると、フレームの注釈 startLordosis。EndLordosis の注釈を付ける女性が終了するとこの姿勢では、女性の試験室で別の場所に再調整する場合に発生します 。 女性は前弯姿勢で、男性が女性に向かって彼の鼻を移動するときに
- 注釈 startAI ' s 肛門性器部、スニッフィング、舐めている、または彼女の会陰の聞き入ったが発生する可能性があります。男性が女性に近いから彼の鼻を削除するとき endAI の注釈を付ける ' s 肛門性器部 。
- 男性に近づく彼の前足は、マウントしようと (例えば 側、ランプ) の向きに関係なくの取付姿勢で女性と startMount の注釈を付ける 。
- StartIntromission を注釈は、女性にマウントされた男性の陰茎のアクセスを得ると成功を突き出す ' s 膣
。 注: にあたっては行動とマウントされた突っ込み男性目に見えて彼の体に向かって上肢を引き出し、彼の骨盤前方を突き、カール彼の尾は、上向きに浸透を示すにあたって、前に発生する区別 (を参照してください <強いクラス ="xfig"> 図 4 C)。- 該当する場合、注釈 射精
。 注: 最後に交尾試合と成功の導入と共に、男性が射精します。足の動きの発生で射精に注釈を付ける従ってあたって 21、中に自分の脚で動きを踏み特性 1 つは実際の排出量を可視化することができるが、男性ハムスターがある 。
- 該当する場合、注釈 射精
- EndIntromission や endMount フレームで同時に注釈を付けるとき男性が彼 2 つ前足を削除、したがって、女性との接触を持たない。視覚化する頻繁にできないのための撤退、同時コード発作を交配全体での一貫性と信頼性を確保するこれらの 2 つの動作します
。 注: 交尾試合、次の成功した射精または女性折れたら次の少なくとも 1 つ をマウント 前弯姿勢です 。
5。データ分析の例
注: ドーパミン固定潜在的な炭素繊維と酵素の録音の使用、nd グルタミン酸、それぞれ、強壮剤や電気化学的放出の一過性のパターンを測定することができます。この演習で無料、商用の集録システムを使用、記録し、変換するソフトウェアがアナログからデジタルに信号を記録 (0.600 V、サンプリング レートをバイアス = 1 Hz).
- の 例のデータの分析のプロトコルの説明 その他のプログラムを使用できますが、定量化トニックおよび MATLAB を使用して記録される電気化学信号に一過性の (一時的な) 変更。
- 提示されたデータの計算 50 点移動平均フィルターを使用した信号の強壮剤。信号の過渡のみ正規化表現を算出した raw データから強壮剤信号。アルゴリズムのさまざまなオプションがあります, ピークを識別するとき (例えば、1 より多くの信号の変化としてピークをラベリング平均上記 SD).
- は、これらのピーク、すなわち 極大の場所を識別、正規化された信号から信号の二乗に設定最小ピーク振幅の MATLAB 関数 peakfinder を使用しています。正規化された信号から検出されたピークの場所は、各ピークの振幅を抽出に使用されました。ピークを検出する機能により、一致、または神経化学的調査の下で相対的なピークの運転可能性があります時間ロックの動作を識別するためです 。
- 行動の注釈 (手順 3 参照) に従って処理されたデータ セグメント; 学生 ' s t-テストが強壮剤神経伝達物質レベル、過渡現象の発生との振幅の違いを評価するために使用されました。中発作を交尾中に前弯と交尾済みの試合前弯のトランジェント。、電気化学的放出の強壮剤パターンへの変更を測定するには、(すなわち、事前交尾試合前弯) 交尾試合前に直接 前弯 位置の中に発生するデータ ポイントはデータ ポイントに交尾試合中に比較しました。t テストを使用して、セッション
- の 例のデータの分析のプロトコルの説明 その他のプログラムを使用できますが、定量化トニックおよび MATLAB を使用して記録される電気化学信号に一過性の (一時的な) 変更。
- 記述されるデータ分析のプロトコルのための生データの準備
注: 上記、MATLAB のコードを使用するために raw データする必要がありますの準備する前に説明したとおり、他のプログラムまたは解析可能性があります同じように実行可能なオプションが、次の方法:- は、注釈と電圧のファイルをエクスポートします。下これを行うに、' ファイル '] タブで、[、' 輸出 ' 機能し、選択、' の注釈 ' タブ、注釈を保存します。下で、' ファイル '] タブで、[、' 輸出 ' 機能、選択、" TSV ' 電圧測定を TSV 拡張子ファイルとして保存するにはタブ 。
- はスプレッドシート プログラムで各ファイルを開き名前を付けて ' xls 形式、xlsx ' ファイルを MATLAB と互換性があるようにします
。 : 注 ' アノテーション ' ファイル、追加あります手動でする必要がありますコメントが 開始 および両方事前交尾試合前弯 (PreMBlordorsis とアノテーションの 終わり を決定するスプレッドシート プログラムで後エクスポートを追加) と交配の試合、前述のとおり、これらの時間のポイントを直接比較できますでステップ 5.1.2 。
- 注釈事前交尾試合前弯 (startPreMBlordosis) の開始をロードシス行動が始まる (startLordosis) も同時に マウント の動作が含まれています、また新しいの開始時に交尾試合場合女性前弯姿勢のままになります 。
- マウント 最初の開始時に事前交尾試合前弯 (endPreMBlordosis) の終わりを注釈します 。
- これは交尾試合の開始を意味、交尾試合 (startMB) の開始、endPreMBlordosis の同時に注釈を付けます 。
- マウント 射精 を含むのいずれか最後に交尾試合 (endMB) の最後に注釈を付ける (4.1.4.1 のステップを参照)、または女性を次 ' 前弯姿勢 (endLordosis) の s 終了 。
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Representative Results
電気化学および行動コーディング上記手法を使用して、この演習は、性行動の生体内で録音中にドーパミンやグルタミン酸の一過性変動・ トニックを特徴付けるし始めています。この方法論の一時的正確な方法によるより正確に性的行動中の神経伝達を特徴付けることができる我々同様、個々 の交尾行動 (例えばあたって、射精) の女性の受信中に対応する過渡変動と交尾の発作中にリリース パターンで特定の変更を対応する強壮剤変更に帰する取り付けの男性。
具体的には、ドーパミンやグルタミン酸の別の動物の NAc のリリース パターンを計測するのに焦点を当てるこの方法論を使用しました。NAc 報酬22の処理に関与する重要な地域であり性的行動23の報酬の面で不可欠な地域として記載されています。
女性が性的行動中に発作 (図 5) の交尾中に NAc コアのドーパミン レベルの強壮剤増加を実証することがわかった。これらの強壮剤の変更は、すべて交尾発作に上記で説明した方法論各交配の試合間の強壮剤の変化を測定でき、強壮剤レベル全体で伝達物質の放出の全体的な変更の時間の同定を増やすため全体セッションです。さらに、この説明の方法論は一過性変化を特定し、一時的可能性が高いこれらの一過性神経伝達物質の変動に関連する動作をマップできます。具体的には、これらの予備的な結果は、発作を交尾中に NAc のドーパミン作動性過渡現象中に発生する膣に挿入 (導入) 男性 (図 6) をお勧めします。さらに、導入のこの連合は特殊な AI などの他の交尾行動を取るに足らないドーパミン作動性応答と。
同様のパターンは、交尾試合 (図 7) 中に背の NAc コアで個々 の intromissions に対応する高速過渡現象とグルタミン酸に関して他の動物で観察されています。このパターンは、NAc シェルまたは他の動物の尾の内側で発生する識別可能な信号がないと、特定の領域です。
図 1: 酵素バイオ センサー技術。
酵素を介した処理 (左画像) を介して神経伝達物質を検出する市販の酵素バイオ センサー プローブの標準加工。グルタミン酸センサーの場合グルタミン酸オキシダーゼで採用されて酵素層 (右の画像) nonelectroactive 神経伝達物質を酸化によって検出されるゲルロボット過酸化水素 (H2O2) に変換するで、プラチナ イリジウム (Pt Ir) 電極。アスコルビン酸 (AA)、同じ電位で酸化は一般的な interferent は、interferent を nonelectroactive 水に変換する酵素の層で AA 酸化酵素添加による除外されます。受動的な選択性膜を介して脳内に存在の他の否定的なゲルロボット接しないが除外されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 試合を交配ハムスターのコンポーネント。
ハムスター交尾試合は、一連の交尾行動は、男性 anogenitally 調査(A)、 (B)をマウントし、あたってを実現しながらの不動前弯姿勢の女性を中にままで構成されています (C)。.注にあたっては行動とマウントする男性は、彼の体に向かって上肢を引っ張るように区別は彼の骨盤を前方に振るし、カール彼の尾は、上向きに浸透を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: スカル キャップ。
ガイド カニューレ、ボーン スクリュー、歯科のアクリルは、炭素繊維や酵素のプローブの挿入を許可するスカル キャップの構造で使用される (15段階の詳細についてを参照してください)。この図では、酵素センサー (ない注入参照電極) とプラスチック製のヘッド マウント センサーの安定性のための右の NAc を単一カニューレ インプラントを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: グルタミン酸センサー校正します。
グルタミン酸に各センサーの感度テストです体外グルタミン酸 (グリーン) 37 ° C で 10 μ m による実験的録音の前に (以来、酵素活性は、温度の影響を受けます)アスコルビン酸 (AA; 赤) またはドーパミン (DA; 青) に応答する各センサーを確認します。このキャリブレーションは、グルタミン酸濃度の変化に実験記録中に見られる電流信号の変化の変換が可能します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 強壮剤は、交配の試合中にドーパミンの増加します。
A.交尾試合前弯信号.対試合前弯信号を premating の様式化された例強壮剤ドーパミン放出を測定するには、アンペロ メトリック交尾試合 (MB) 前に前弯中のドーパミン レベルのレスポンスは MB の間にそれらと比較されました。灰色のボックスは、MB の前に前弯を示します。Blue のボックスは、MB の中に前弯を示します。B. preMB 前弯・前弯 MB の間の平均電圧を比較する 1 つの動物から代表的な定量化。誤差範囲を示す (SEM)、平均値の標準誤差と印は有意差 (p 値 < 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 代表ドーパミン トレースします。
ドーパミンの一過性のリリースは、時間ロック intromissions 背 NAc コアの男性から。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 代表グルタミン酸トレースします。
グルタミン酸トランジェントは拡張の性的経験の間に背の NAc コアで男性から個々 の intromissions に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
比較的簡単ですが、この手法を採用する場合にいくつかの問題が発生します。まず、プローブの固定配置が正確でなければならない: マイクロダイアリシス プローブを取り巻く細胞外の環境のより広い半径でサンプルするとは異なりこの手法のみの直接接触に入って来る物質の計測が可能プローブ。第二に、繊維の幅が狭いため、炭素繊維の記録の場合破損が発生することができますと意図的なケア、プローブを挿入します。グルタミン酸作動性バイオ センサーの場合は、酵素分解は、プローブは 3 週間の保証期間内に使用しない場合に発生します。幸いなことに、これらすべての問題は、アドレス指定可能な適切なケアと細部への注意と除去することができます。
潜在的問題の注意点は固定潜在的な炭素繊維の録音の特異性に発生します。両方神経伝達物質を解放する分野で録音が行われた場合、ノルエピネフリンなどの他のモノアミンとドーパミンの応用の可能性が一致するのでより化学的特異性の欠如は、結果の解釈を制限があります。NAc でこれ主要な問題は、プライマリ カテコールアミン送信機24をされているドーパミンはもたらしません。約 98% の NAc で細胞はドーパミン作動性神経伝達の24に対応中型のとげだらけニューロンなので信号はドーパミンの検出に偏ってし、このターン ・ キーよりアプローチの使用が容易になります。
この酵素バイオ センサーと記録システム固定潜在的な炭素繊維のもう一つの利点は、ゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質ドーパミンやグルタミン酸などで測定できるデュアル プローブ録音することができます実行することです。同時に同じ動物。今回発表されたデータは別の動物での録音から来るが、1 つは両側同じ地域でも複数の脳領域における神経伝達の収束を評価できるように、これらの技術が同時に使用できます。同じ動物内の録音の組み合わせ、または、ここで示すように、動物に記録の比較は、ネットワーク接続の背後にあるメカニズムの解明とシグナル伝達の両方の強力なツールです。
合計では、本稿は、酵素バイオ センサーと 1 つの実験装置を利用した複数のゲルロボットと nonelectroactive の伝達物質を測定する固定電位記録の強力なテクニックを示します。このシステムが一匹で最大 4 個のセンサーから記録する機能を提供しますが、データは複数の動物の間で個別の神経伝達物質の録音から来るをここで紹介する、同時に15。サンプル結果は一括提示は、男性から交尾の刺激の特定のパターンに起因するメスのハムスターの迅速な伝達に洞察力を提供します。さらに、これら実験時間ロック女性の NAc コアでドーパミンやグルタミン酸作動性の過渡応答にあたってこのリリースのやりがいのある個別のプロパティのエンコードに責任があることを示唆している男性から性的な行動。我々 の目標は生体内でドーパミンやグルタミン酸放出と交尾刺激の個々 のコンポーネントに基本回路の関係のより包括的な画像を開発する女性ハムスターの交配パターンを利用男性。これらの神経伝達物質のパターンを特徴付ける機能はのみ、基礎科学の観点から23、報酬行動などの病理学的形式の潜在的な治療上のアプローチの解明にも有益ではないと考えています薬物中毒の25。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、Matlab コードを実行している彼のためのダニエルの Korus 学部と学部アレックス ベッチャー行動実験を実行している彼の援助に感謝したいと思います。このプロジェクトは、R.L.M. に NSF IOS 1256799 によって薬物乱用賞番号 T32DA007234 の下で健康の国民の協会の国立研究所でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free--available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
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