Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos

Summary

Este documento detalla el uso de grabaciones de potencial fijo amperométrico utilizando electrodos de fibra de carbono y la tecnología de biosensores enzimáticos para medir la liberación de dopamina y glutamato con alta resolución temporal durante el comportamiento natural de gratificante en el hamster hembra.

Abstract

La capacidad de medir la liberación de neurotransmisores en una escala de tiempo rápida permite patrones de neurotransmisión vinculados a comportamientos específicos o manipulaciones; una herramienta poderosa en la aclaración de mecanismos y circuitos subyacentes. Mientras que la técnica de microdiálisis se ha utilizado durante décadas para medir casi cualquier analito de interés en el cerebro, esta técnica está limitada en resolución temporal. Por otra parte, voltametría cíclica de barrido rápido es temporal precisa y extremadamente sensible; sin embargo, porque este método técnicamente difícil se basa en la electroactivity del analito de interés, se elimina la posibilidad de detectar sustancias nonelectroactive (por ejemplo, el neurotransmisor glutamato). Este documento detalla el uso de un sistema de llave en mano que combina el potencial fijo Amperometría y enzimática biosensores para medir neurotransmisores electroactivos y nonelectroactive con precisión temporal. El apareamiento de estas dos técnicas de gran alcance permite la medición de neurotransmisión fásica y tónico con relativa facilidad y permite la grabación de múltiples neurotransmisores simultáneamente. El objetivo de este manuscrito es demostrar el proceso de medición de dopamina y glutamato neurotransmisión en vivo mediante un comportamiento naturalmente gratificante (es decir, comportamiento sexual) en hámsteres femeninos, con el objetivo de mostrar la viabilidad técnica de este ensayo para examinar otros comportamientos y paradigmas experimentales.

Introduction

La capacidad de medir la liberación de neurotransmisor en animales comportamiento despiertos permite a los investigadores vincular conductas específicas con patrones espaciales y temporales de la neurotransmisión, una poderosa herramienta para investigar los mecanismos y circuitos subyacentes tanto natural y conductas operante en tiempo real. Históricamente, se ha empleado microdiálisis para medir sustancias eléctricamente reactivas y no reactivas en el medio extracelular del cerebro¹. Esta técnica utiliza un flujo continuo de una solución acuosa de composición iónica similar al líquido extracelular, a través de una sonda de microdiálisis compuesto por un pequeño eje con una punta de una fibra hueca semipermeable membrana². Después de la inserción de la sonda, neurotransmisores u otros analitos de interés pueden cruzar la membrana semipermeable por difusión pasiva antes de ser recogidos a intervalos para posterior análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), un técnica de química analítica utilizada comúnmente para separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla heterogénea³.

Aunque la microdiálisis es una técnica sensible que puede utilizarse para medir cualquier analito de interés, la resolución temporal es baja, con tasas de muestreo máxima del orden de minutos a decenas de minutos^1,2. La invención de la voltametría cíclica de barrido rápido (FSCV), una técnica que se basa en el potencial redox de las especies electroactivas, puede aclarar cerca de instantáneas concentraciones del analito de interés en el líquido extracelular. En breve (ver Robinson et al. ⁴ para una revisión extensa), se aplica un electrodo para subir y bajar la tensión de forma de onda triangular en una escala de tiempo rápido⁴. Cuando la tensión está en el rango correcto, el compuesto de interés varias veces es oxidado y reducido. Esta oxidación y reducción resulta en un movimiento de electrones que genera una pequeña corriente alterna. Analizar las tasas tendrá lugar en la escala de fracciones de segundos con la oxidación y la reducción de compuestos que ocurren en microsegundos. Restando el actual fondo creado por la punta de prueba de la corriente resultante, uno puede generar una tensión vs actual parcela única a cada uno de ellos. Debido a que la escala de tiempo de las oscilaciones de voltaje, estos datos pueden utilizarse para calcular una parcela de la corriente como función del tiempo. Por lo tanto, pueden determinarse las concentraciones relativas de los compuestos como el número de electrones transferidos en cada oxidación y reacción de reducción se conoce⁴.

Esta especificidad química y alta resolución temporal que FSCV una técnica poderosa para la detección del cambio de concentraciones químicas en vivo. Sin embargo, a pesar de estas múltiples ventajas, esta técnica requiere amplios conocimientos técnicos y equipo costoso y configuración. Además, nonelectroactive neurotransmisores (por ejemplo, glutamato) no se puede medir usando esta técnica. Afortunadamente, los avances tecnológicos en el campo de la electroquímica⁵, así como la comercialización de estos inventos, ha introducido un enfoque relativamente sencillo para medir no electroactivos neurotransmisores en animales comportamiento despiertos sin comprometer el temporal precisión, una técnica conocida como tecnología de biosensores enzimáticos. Esta técnica utiliza conversión enzimática del neurotransmisor nonelectroactive de interés en dos substratos, uno de los cuales es el peróxido de hidrógeno electroactivos que es detectado como una oxidación amperométrico actual generada un potencial aplicado⁵ . Biosensor comercialmente disponibles sondas (ver figura 1) medir selectivamente los analitos de interés competitivos reduciendo la contribución de interferentes endógenos. En el caso del glutamato, la contribución del ácido ascórbico interferencias comun (AA) se reduce competitivamente a la corriente medida por localizar Co oxidasa AA en la superficie enzimática activa del sensor, conversión de AA a no electroactivos dihydroascorbate y agua. Además, una capa de polímero Nafion cargada negativamente presente debajo de la capa de enzima excluye compuestos aniónicos endógenos.

Esta misma configuración experimental de biosensor puede medir electroactivos neurotransmisores como en la FSCV, pero en su lugar emplea un potencial fijo grabación⁶. En contraste con la tensión oscilante aplicada en FSCV, en una grabación de potencial fijo el voltaje se mantiene en el redox potencial para el analito de interés. Aunque es menos químicamente selectiva que FSCV como múltiples neurotransmisores pueden tener el mismo potencial, de redox en áreas del cerebro que abrumadoramente sesgan hacia un neurotransmisor, la naturaleza de la llave de este enfoque compensa la falta de química especificidad.

La capacidad de medir electroactivos y nonelectroactive liberación de neurotransmisor en casi en tiempo real y un enlace a eventos específicos de comportamiento proporciona una oportunidad para examinar la liberación de neurotransmisor convergentes. Este manuscrito detalla el uso de este sistema para interrogar la neurotransmisión de dopamina y glutamato en respuesta a la natural recompensa en hámsters comportamiento despiertos. El objetivo de este artículo es detallar el proceso de medición esta liberación de neurotransmisores durante el comportamiento sexual en hámsteres femeninos, con el objetivo de demostrar su viabilidad para examinar otros comportamientos y paradigmas experimentales.

Hámsters son un modelo ideal para su uso en grabaciones de electroquímicas
Históricamente, se han empleado modelos de ratas y ratones en el estudio del comportamiento sexual. Estos roedores participan en una secuencia copulatoria dinámica, que involucra numerosos comportamientos de solicitud femenina que incluyen saltos entrando y oído ondulación para atraer al macho a perseguir y finalmente montar la hembra⁷. El montaje por el hombre (con o sin penetración vaginal) dura sólo unos segundos, durante el cual la hembra se dedica a su postura comportamiento sexual (denominada lordosis) también sólo durante unos segundos antes de volver a comportamientos de solicitud activa. Este patrón de comportamiento, compuesto por altos niveles de actividad intercalados con breves períodos de inmovilidad, es problemático para la medición de la neurotransmisión en comportamiento de animales. En primer lugar, puede haber artefactos de movimiento en las grabaciones de amperométricos que se relaciona con la actividad de los nervios. En segundo lugar, la locomoción se asocia con la liberación de neurotransmisores especialmente en ciertas regiones del cerebro. Por ejemplo, la liberación de dopamina se han unido a la actividad locomotriz en el estriado dorsal y ventral^8,9, un hallazgo que formó la base para las mediciones de microdiálisis de dopamina después de psicoestimulantes administración¹⁰. Porque los comportamientos de la mujer típica solicitud en mosroedores de t implican altos niveles de actividad locomotora y son representados por la mayor parte de una prueba del comportamiento sexual de 10 minutos, esto hace difícil atribuir los cambios en la neurotransmisión a los componentes explícitos de comportamiento sexual que colectivamente sólo minutos.

Para analizar el perfil neuroquímico del comportamiento sexual femenino, este laboratorio buscó una especie en que existe mínima actividad locomotriz que acompañan el comportamiento sexual. La secuencia de copulación en hamsters sirios (Mesocricetus auratus) es ideal para grabaciones neuroquímicas debido a la falta de comportamientos solicitud típicamente visto en ratas y ratones¹¹. Como consecuencia, hamsters hembra entrará y mantener la postura de lordosis para más de 9 minutos a 10 minutos de prueba sesión¹². Con la falta de extraños movimientos locomotores por la mujer, en vivo pueden obtenerse grabaciones electroquímicas que pueden estar asociadas con los componentes de las interacciones sexuales con el varón.

Combates consistieron en hamsters
Después de la introducción de un animal macho de estímulo en la cámara de prueba, el hombre inicialmente participarán en investigación de anogenital (IA) de la hembra antes de montar su (elfigura 2A). En orden para el macho de Monte, la mujer debe asumir una postura sexual receptiva conocida como lordosis, en la que arquea su espalda y su cola se desvía para que el hombre de montaje puede acceder pene a su vagina. El macho montará mujer, juntando su trasero con ambas patas (figura 2B) y comenzar a empujar en un intento por ganar la intromisión del pene (figura 2C). El macho Monte a la hembra (sin inserción), y se intromit varias veces antes de alcanzar finalmente la eyaculación. Esta secuencia de Montes y de intromisiones a la eyaculación se denomina una "pelea de copula". Los machos tendrá varios combates consistieron en una sola sesión.

Protocol

todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Minnesota y están de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio ¹³ .

1. animales y cirugía de la canulación

hámsters

1. Siria obtener un proveedor de animales comunes en aproximadamente 55 días de edad.
   Nota: Aunque la edad de los animales varía debido a las limitaciones de los diversos paradigmas experimentales, para el comportamiento sexual es importante obtener animales sexualmente maduros que son aproximadamente la misma edad.
2. Animales de la casa en un controlado temperatura (22 ° C) y el medio ambiente iluminación (14 h de luz seguido por 10 h oscuro con luces apagadas a las 13:00 h), con comida y agua disponible ad libitum excepto durante los períodos de pruebas experimentales de.
   Nota: Ya que los hámsteres se reproducen estacionalmente, este 14:10 ciclo luz/oscuridad imita sus condiciones de cría natural.
3. Después de una aclimatación de 1 semana para el laboratorio, realizar ovariectomies bilaterales asépticas y canulaciones estereotáctica intracraneales bajo anestesia general (p. ej., pentobarbital) y administrar apropiadas institucionalmente aprobaron tratamiento analgésico y antibiótico postoperatorio como describió anteriormente ^{14 , 15}.
   Nota: Para el estudio del comportamiento sexual, ovariectomies son necesarias para eliminar la principal fuente endógena de las hormonas sexuales para que los animales pueden ser uniformemente inducidos a receptividad sexual con hormona exógena según la línea de tiempo experimental.
   1. Para la implantación de sonda dopaminérgica y glutamatérgica, stereotaxically implante cánulas guía (0,7 mm de diámetro; figura 3) en el área de interés (por ejemplo, este laboratorio dirigido al derecha Núcleo accumbens (NAc)) como se describe con detalle paso a paso en otros lugares ¹⁵.
      Nota: Aunque los datos presentados son de grabaciones solo sensor de una sonda de glutamato o dopamina por animal, este sistema permite la grabación simultánea de hasta 4 sensores en un solo animal; por lo tanto, podrían implantarse ámpulas de 1-4 dependiendo de los resultados y el diseño experimental deseado.
      1. Determinar las coordenadas del implante de la región de interés utilizando un atlas estereotáctica (por ejemplo, El cerebro de hámster dorado por Morin & madera), teniendo en cuenta que el sensor extiende 1 mm por debajo de la cánula en el tejido de cerebro.
   2. Después de una cánula stereotaxically se baja hasta la posición deseada de la dorsal-ventral, péguela en el cráneo con un tapón construido de acrílico dental, asegurado con tornillos de hueso de acero inoxidable y una cabeza de plástico de montaje ( figura 3 ; Ver ¹⁵ para más detalles).
   3. Para pruebas de fibra de carbono, insertar un electrodo de referencia (350 μm de diámetro, 7,5 mm de longitud total) en el hemisferio contralateral.
      Nota: Una ubicación específica o la distancia de la cánula no es necesario; electrodos de referencia pueden colocarse en cualquier lugar en el hemisferio contralateral que es conveniente.

2. Biosensor y pruebas de fibra de carbono

1. después de 1 semana de recuperación de la cirugía, administrar el régimen de cebado de hormona para inducir la receptividad sexual.
   1. Inyectar 10 μg de benzoato de estradiol en 0,1 mL de aceite de semilla de algodón por vía subcutánea (s.c.), aproximadamente 48 h y 24 h antes de la conducta sexual de prueba, para inducir la receptividad sexual hacia los hombres ¹¹.
   2. Inyectar 500 μg de la progesterona en 0,1 mL de aceite de semilla de algodón, s.c., 4 h antes de la introducción del macho para inducir la receptividad sexual ¹¹.
2. Prueba de todos los animales al inicio de la fase oscura de su ciclo diario, como comportamientos sociales de roedores están sujetos a alteración bajo luz blanca y luz roja prueba condiciones ^{16 , 17 , 18}.
3. para biosensor enzimático glutamato probar, calibrar los sensores en vitro ( figura 4) antes de su uso como se describió anteriormente ^{15 , 19}. tubos de centrífuga
   1. hacer la calibración soluciones frescas en el día de la prueba en vidrio de 20 mL. Para la solución de analito, disolver 7,4 mg de ácido L-glutámico en 10 mL de ultra pura de H ₂ O invirtiendo suavemente el tubo. Hacer la solución de interferencias por disolución 176,1 mg AA en 10 mL de ultra pura H ₂ O.
   2. Configuración de la calibración mediante la colocación de un agitador magnético en la base de un soporte de anillo de laboratorio básicos. Coloque un vaso de precipitados con camisa de 20 mL en la parte superior del agitador magnético y sujete en su lugar utilizando una abrazadera de 2 dientes mediana. Bar
      1. Agregar una agitación magnética y 20 mL de fosfato 100 mM con tampón salino (PBS) en el vaso de la camisa. Conectarse la camisa de la taza de un baño de agua circulante para calentar la solución tampón a 37 ° C.
         Nota: El calibrado de biosensores enzimáticos debe realizarse a la temperatura corporal ya que la actividad enzimática está influenciada por la temperatura.
   3. Coloque el soporte de calibración de sensor encima de la camisa de la taza y ajustar un preamplificador de 4 canales de calibración en la parte superior, asegurando en su lugar usando una abrazadera de ángulo recto. Conectar el preamplificador a un dispositivo de acondicionamiento y adquisición de datos para registro de calibración de los datos.
   4. Prueba de la sensibilidad de cada biosensor enzimático a glutamato (u otros analitos de interés para otros biosensores comercialmente disponibles sondas p. ej., glucosa) antes de la grabación experimental mediante la colocación de la sonda en el soporte de calibración en la cima de una vaso encamisado, sumergiendo la detección cavidad y una parte del cable de referencia de cloruro de plata (AgCl) en la solución tampón.
      1. Antes de conectar cada sensor (hasta 4) sometido a un puerto de un preamplificador de 4 canales de calibración, iniciar una nueva grabación en la interfaz de la computadora utilizando software de adquisición para descargar gratis. Permiten los sensores alcanzar una estable base.
   5. Comenzar a agregar las inyecciones de analito cuando los sensores han alcanzado una base estable. Utilice el orificio en el soporte de calibración para introducir una punta de pipeta en la solución tampón. Utilice la herramienta de anotación clave rápido en el software de grabación para anotar cuando se realiza una inyección.
      1. 10 hacer adiciones de μm de glutamato por pipeteo 40 μL de la solución de analito en la solución tampón. Espere a que el sensor se estabilice entre adiciones. Añadir 3 inyecciones de solución del analito antes de agregar una sola inyección de la solución de AA interferencias (50 μL volumen de inyección de 250 μM cambio en concentración).
         Nota: La calibración permite la conversión de los cambios en la señal amperométrica (visto durante la grabación experimental enzimática en paso 2.12) a los cambios en la concentración de glutamato, si lo desea. Ver referencia ¹⁵ para la instrucción paso a paso. Las sondas de dopaminérgicos utilizadas por este laboratorio son calibradas durante el proceso de fabricación por el proveedor comercial. Sondas de glutamato deben calibrarse en el tiempo de uso como su sensibilidad puede disminuir con el tiempo como los componentes enzimáticos degradarán ¹⁹. Porque los electrodos de fibra de carbono no sufren degradación, la calibración realizada por la empresa antes de su envío es suficiente por como tAquí está un aumento de la probabilidad de dañar la fina fibra de carbono (350 μm de diámetro) a través de la manipulación adicional.
4. Línea de la cámara de prueba con ropa de cama de los animales ' jaula casa s.
   Nota: Esto aumenta la hembra ' familiaridad de s con las pruebas de cámara, así como expone el varón sexualmente estimulantes señales olfativas de acoplamiento que se distribuyeron por la hembra en la respuesta al tratamiento estradiol.
5. Ligeramente anestesiar a los animales antes de la inserción de la sonda por isoflurano u otro anestésico volátil en una cámara de inducción.
6. Obdurator oclusiva Retire la cánula guía e Inserte la sonda enzimática a través del eje de guía o electrodo de fibra de carbono.
7. Después de la inserción de la sonda, coloque el animal en la cámara de prueba.
   Nota: Este laboratorio utiliza un acuario 10 gal cristal (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), pero también pueden emplearse cámaras redondas de igual área.
8. Comienza la grabación de la señal amperométrica video y tiempo-bloqueada en un programa de software comercialmente disponible, describe en detalle en otra parte ¹⁵.
9. Conectar el sensor al sistema de grabación: el potenciostato a través de un cable eléctrico blindado y un giratorio eléctrico. Estabilizar la conexión del sensor atornillando un accesorio de pin en el Monte de cabeza. Reforzar la conexión usando la película de laboratorio si es necesario.
   Nota: Es necesario un conector personalizado para sujetar el electrodo de fibra de carbono y el electrodo de referencia al potenciostato, mientras que los sensores enzimáticos glutamato pueden ser conectados directamente con el potenciostato.
10. Permitir que el sensor se equilibren en el cerebro antes de la prueba experimental.
    Nota: Tiempos de equilibrio difieren dependiendo del sensor de grabación (p. ej., sensores enzimáticos requieren equilibrar 2-4 h, mientras que electrodos de fibra de carbono sólo requieren unos 30 min). Si ambos tipos de sensores se implantan, equilibre durante el tiempo de sensor enzimático.
11. Después de equilibrar sensor, introducir un macho de estímulo en la cámara de prueba.
12. Tras el primer montaje con la inserción del pene (llamado intromisiones) por el macho de estímulo, continuar grabando para un adicional 10-30 min, dependiendo de los objetivos experimentales.
13. Después de pruebas de comportamiento, desconecte la hembra ' sensor s.
14. Retire ambos hámsteres de la cámara de pruebas. Retire la ropa de cama y limpie la cámara con etanol al 70%.
    Nota: Debido a la breve equilibrado necesario para registros de fibra de carbono, se pueden repetir pasos 2.3-2.14 a varios animales de prueba en el mismo día. Por el contrario, ya que los sensores enzimáticos requieren aproximadamente 4 h de equilibrio, prueba sólo un animal por día para limitar la posible variación entre sujeto debido a diferencias en los animales ' tiempo circadiano prueba.

3. Sacrificio y perfusión

1. tras la conclusión del período de prueba, anestesiar profundamente el tema de la prueba femenina con un agente euthanizing (p. ej., este laboratorio utiliza una inyección intraperitoneal de 0,2 mL de solución de fenitoína y pentobarbital) .
2. Transcardially perfusión el animal con 25 mM PBS, pH 7,6, para quitar toda la sangre circulante, seguida por una fijación de 20 min con paraformaldehído al 4%-PBS.
3. Quitar el cerebro y postfix en ~ 30 mL de la solución de paraformaldehído al 4% en un tubo cónico de 50 mL durante la noche.
   1. Tienda el cerebro en un 10% solución de sucrosa-PBS hasta que se vaya a la sección serial.
      Nota: Cerebros pueden almacenarse para 2 semanas, con cambios semanales de solución de sacarosa para evitar el crecimiento potencial de los contaminantes.
4. Sección serie del cerebro en μm 40 rebanadas a través de la región implantada ya sea con un micrótomo de congelación o el criostato como describió anteriormente ¹⁹.
5. Monte rebanadas en serie en portaobjetos recubiertos con adhesivos disponibles comercialmente (o ver ²⁰ a hacer). Deje que se seque al menos durante la noche.
6. Las diapositivas con el tinte violeta de cresilo, claro, la mancha y cubreobjetos como describieron anteriormente ²⁰.
7. Las diapositivas usando microscopía de campo brillante para confirmar la colocación anatómica del sensor de la imagen.

4. Codificación del comportamiento

1. ver y anotar los vídeos utilizando el software comercial descargable gratis (véase Tabla de materiales) en cámara lenta para precisamente comportamientos de código tiempo-bloqueada la señal amperométrica.
   Nota: Para utilizar el código MATLAB en el análisis (ver abajo ), anotar el Inicio y final de cada uno de la hembra ' s y hombre ' comportamientos de s.
   1. Anotar startLordosis en el marco cuando la mujer inicia un dorsoflexion de su espalda y su cola hacia arriba los defectos. Anotar endLordosis cuando la mujer termina esta postura, que a menudo ocurre cuando la mujer se reajusta a otra ubicación en la cámara de prueba.
   2. Anotar startAI cuando la mujer está en la postura de lordosis y el macho mueve su hocico hacia la hembra ' región anogenital de s, donde se produzcan oliendo, lamiendo y acariciando de la región perineal. Anotar endAI cuando el hombre elimina su hocico de proximidad a la hembra ' región anogenital de s.
   3. Anotar startMount cuando el hombre se acerca y pone sus patas delanteras sobre la mujer en una postura de montaje, independientemente de la orientación de la tentativa de Monte (p. ej., lado, cadera).
   4. Anotar startIntromission cuando empuje acertado gana el acceso del pene masculino montado a la hembra ' vagina s.
      Nota: Una intromisión es comportamiento distinguible de empuje montada que ocurre antes de intromisión, el hombre visiblemente tira sus miembros superiores hacia su cuerpo, empuja su pelvis hacia adelante y enrosca su cola hacia arriba, indicando penetración (vea < fuerte clase = "xfig" > Figura 4 C).
      1. En su caso, anotar la eyaculación.
         Nota: Al final de un combate de acoplamiento y en junto con una intromission acertado, el macho a eyacular. Aunque uno es incapaz de visualizar la emisión real, hámsteres masculinos tienen una característica pisando el movimiento con sus patas traseras durante un ²¹ de intromisiones, así anotar la eyaculación en la ocurrencia del movimiento pie.
   5. Anotar endIntromission y endMount simultáneamente en el marco cuando el macho ha eliminado las dos patas delanteras y por lo tanto, no tiene contacto con la hembra. Debido a la frecuente incapacidad de visualizar su retirada, simultánea código estos dos comportamientos para permitir la consistencia y confiabilidad a través de apareamiento combates.
      Nota: Una pelea de apareamiento sigue una eyaculación exitosa o cuando la mujer rompe la postura de lordosis tras al menos un Monte.

5. Análisis de datos de ejemplo

Nota: el uso de fibra de carbono potencial fijado y grabaciones enzimáticas de dopamina aglutamato de ND, respectivamente, permite la posibilidad de medir tónica y fásicos patrones de liberación electroquímica. Este laboratorio utiliza un sistema de adquisición gratuita, comercial y graba software para grabar y convertir señales de analógico a digital (diagonal 0.600 V, frecuencia de muestreo = 1 Hz).

1. Descripción del Protocolo de análisis de datos de ejemplo
   1. aunque pueden utilizar otros programas, cuantificar la tónica y fásicas (transitorias) cambios en la señal electroquímica grabada usando MATLAB.
      1. De los datos presentados, calcular la señal de la tónica mediante un filtro de media móvil de 50 puntos. Una representación normalizada sólo transitorios de la señal se calculó restando la señal de la tónica de los datos en bruto. Identificar picos fásicas, hay varias opciones algorítmicas (p. ej., etiquetado picos como cambios en la señal de más de 1 SD por encima de la media).
      2. Identificar las ubicaciones de estos picos, es decir, máximos locales, de la señal normalizada usando la función MATLAB peakfinder con la amplitud de pico mínimo a la raíz cuadrada de la media de la señal. La ubicación de los picos de la señal normalizada se utilizó para extraer la amplitud de cada pico. La capacidad para detectar picos permite la identificación de cualquier comportamientos tiempo-bloqueada puede ser coincidiendo con o conducir el pico relativo en neuroquímicas bajo investigación.
   2. Segmento de los datos procesados según las anotaciones de comportamiento (ver paso 3), un estudiante ' s t-test se utilizó para evaluar las diferencias en el nivel del neurotransmisor de tónica, la ocurrencia de transitorios y la amplitud de transitorios durante el apareamiento la lordosis pelea versus lordosis durante el apareamiento los combates. Para medir los cambios en patrones de tónico de liberación electroquímico, los puntos de datos que se producen durante la posición de Lordosis directamente antes de una pelea de apareamiento (es decir, pre-acoplamiento lordosis de pelea) se compararon con los puntos de datos durante una pelea de acoplamiento sesión usando un t-test
2. Preparación de datos para el protocolo de análisis de datos se describe
   Nota: como se indicó, aunque otros programas o el análisis pueden igualmente ser opciones viables, para utilizar el código MATLAB descrito anteriormente, los datos en bruto deben ser preparados en la siguiente manera:
   1. exportar los archivos de anotación y la tensión. Para ello, en el ' archivo ' ficha, seleccione el ' exportación ' function y seleccione el ' anotaciones ' ficha para guardar las anotaciones. Bajo el ' archivo ' ficha, seleccione el ' exportación ' la función y elija el " TSV ' ficha para guardar las mediciones de voltaje como un archivo de extensión TSV.
   2. Abrir cada archivo con un programa de hoja de cálculo y guardar como ' xls/xlsx ' hacer compatible con MATLAB con los archivos.
      Nota: Para la ' anotación ' archivo, hay más anotaciones que deben manualmente añadido después de la exportación en un programa de hoja de cálculo que determinan el Inicio y final de ambos la lordosis pelea el apareamiento (anotado como PreMBlordorsis ) y la pelea de apareamiento para que estos puntos de tiempo pueden ser comparados directamente como se ha mencionado en el paso 5.1.2.
   3. Anotar el comienzo de la lordosis de combate pre-acoplamiento (startPreMBlordosis) al mismo tiempo como un comportamiento de lordosis empieza (startLordosis) que también incluye un comportamiento de Monte y también en el inicio de un nuevo acoplamiento pelea si la hembra permanece en la postura de lordosis.
   4. Anotar al final de la lordosis de combate pre-acoplamiento (endPreMBlordosis) cuando el primer Monte.
   5. Anotar el comienzo de una pelea de apareamiento (startMB) en el momento mismo de la endPreMBlordosis, como lo que significa el comienzo de un combate de contacto.
   6. Anotar al final de un combate apareamiento (endMB) o al final de un montaje que incluye una eyaculación (ver paso 4.1.4.1), o después de la mujer ' terminación de s de la postura de lordosis (endLordosis).

Representative Results

Usando el electroquímico y conductual codificación metodología descrita anteriormente, este laboratorio ha comenzado a caracterizar las fluctuaciones fásicas de dopamina y glutamato y tónico durante grabaciones en vivo de comportamiento sexual. Debido a la manera temporal precisa de esta metodología, con mayor precisión podemos caracterizar la neurotransmisión durante el comportamiento sexual; así como atribuir cambios específicos en los patrones de liberación a los correspondientes cambios de tónica durante combates de acoplamiento y las fluctuaciones transitorias correspondientes durante la recepción de la hembra de comportamientos individuales copulatoria (p. ej., intromisiones, eyaculación) del varón de montaje.

Específicamente, se utilizó esta metodología para centrarse en la medición de los patrones de liberación de dopamina y glutamato en el NAc de distintos animales. El NAc es una región crítica en recompensa procesamiento²² y ha sido descrito como una región integral en los aspectos de recompensa del comportamiento sexual²³.

Observamos que durante el comportamiento sexual, las hembras demostraron un aumento de tónico en los niveles dopaminérgicos en el núcleo de NAc durante el apareamiento combates (figura 5). Mientras que estos cambios de tónica se muestra para todos los combates de apareamiento, la metodología descrita puede medir los cambios de tónica entre cada pelea de apareamiento y aumentar así la identificación temporal de cambios globales a nivel tónico de la liberación de neurotransmisor a través de toda la sesión. Además, esta metodología descrita puede identificar cambios fásicos y mapa temporal los comportamientos probablemente asociados con estas fluctuaciones fásicas del neurotransmisor. Específicamente, estos resultados preliminares sugieren que durante combates de apareamiento, dopaminérgicas transitorios en el NAc se presentan durante la inserción vaginal (intromisión) por el macho (figura 6). Además, esta asociación con intromisiones es específica, con las respuestas dopaminérgicas insignificante a otros comportamientos copulador, como el AI.

Un patrón similar se ha observado en otros animales con respecto a la liberación de glutamato, con oscilaciones rápidas que corresponden a intromisiones individuales en el núcleo dorsal de NAc durante un combate copulador (figura 7). Este patrón es específica, con ninguna señal discernible que ocurre en el shell de NAc o medial caudado de otros animales de la región.

Figura 1 : Tecnología de biosensores enzimáticos.
Fabricación estándar de sondas de biosensor enzimático comercialmente disponibles que detectan neurotransmisores vía mediada por la enzima proceso (imagen izquierda). En el caso de sensores glutamatérgica, glutamato oxidasa trabaja en la capa enzimática (imagen derecha) para convertir el neurotransmisor nonelectroactive electroactivos el peróxido de hidrógeno (H₂O₂) que se detecta por la oxidación en el electrodo de platino-iridio (Pt-Ir). Ácido ascórbico (AA), un interferente común que es oxidado en el mismo potencial, se excluye a través de una adición de oxidasa de AA a la capa enzimática que convierte el interferente al agua nonelectroactive. Excluyen a otros negativos electroactivos interferentes presentes en el cerebro a través de una membrana selectiva pasiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Componentes de un Hamster apareamiento pelea.
En hámsteres, una pelea de apareamiento consiste en una secuencia de comportamientos copulador, durante los cuales la hembra permanece en la postura de lordosis inmóvil mientras que el macho anogenitally investiga (A), (B)se monta y logra intromisiones (C). . Una intromisión es comportamiento distinguible de montaje como el hombre tira sus extremidades superiores hacia su cuerpo, empuja su pelvis hacia adelante y enrosca su cola hacia arriba, lo que indica la penetración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Cráneo construcción.
Cánulas guía, tornillos de hueso y acrílico dental se utilizan en la construcción de un casquillo del cráneo para permitir la inserción de la sonda enzimática o fibra de carbono (ver¹⁵ para los detalles paso a paso). Esta figura muestra un implante de una cánula sobre el derecha NAc de un sensor enzimático (sin electrodo de referencia implantado) y Monte cabeza plástica para la estabilidad del sensor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Calibración de glutamato Biosensor.
La sensibilidad de cada biosensor glutamato es probado en vitro antes de grabación experimental de 10 μm adiciones del glutamato (verde) a 37 ° C (ya que la actividad enzimática está influenciada por la temperatura). Cada sensor se confirma que no responden al ácido ascórbico (AA, rojo) o dopamina (DA, azul). Esta calibración permite la conversión de los cambios en la señal amperométrica durante la grabación experimental a los cambios en la concentración de glutamato.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Tónico aumenta dopamina durante una pelea por el apareamiento.
A. ejemplo estilizado de premating señal de lordosis de pelea vs señal de lordosis de pelea. de acoplamiento Para medir la liberación de dopamina de la tónica, la respuesta amperométrica a los niveles de dopamina durante lordosis antes de una pelea de apareamiento (MB) se compararon con los durante un MB. Cuadros grises indican lordosis antes un MB. BLcajas UE indican lordosis durante un MB. B. cuantificación representativa de un animal comparando la tensión media entre lordosis preMB y lordosis MB. Barras de error indican el error estándar de la media (SEM), y el asterisco indica diferencia significativa (p-valor < 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Rastro de dopamina representante.
Liberación fásica de dopamina es tiempo-bloqueada a intromisiones del varón en el núcleo dorsal de la NAc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Rastro de glutamato representante.
Transitorios de glutamato corresponden a intromisiones individuales del hombre en el núcleo dorsal de NAc durante una experiencia sexual extendida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aunque relativamente sencilla, algunos temas pueden surgir al utilizar esta técnica. En primer lugar, la colocación estereotáctica de las puntas de prueba debe ser precisa: a diferencia de microdialysis que muestras un radio más amplio del medio extracelular que rodea a la sonda, esta técnica sólo permite la medición de un neurotransmisor que entra en contacto directo con la sonda. En segundo lugar, en el caso de la grabación de la fibra de carbono, debido a la anchura pequeña de la fibra, puede ocurrir una falla, y la sonda debe insertarse con cuidado deliberado. En el caso de los biosensores glutamatérgica, degradación enzimática puede ocurrir si la sonda no se utiliza dentro del plazo garantizado de 3 semanas. Afortunadamente, todos estos temas son direccionables y pueden ser eliminados con cuidado y atención al detalle.

Una advertencia potencialmente problemática se presenta en la especificidad de las grabaciones de fibra de carbono potencial fijado. Porque el potencial aplicado de dopamina coincide con otras monoaminas, como la norepinefrina, si las grabaciones se realizan en las zonas que secretan dos neurotransmisores, que esta falta de especificidad química puede limitar la interpretación de los resultados. En el NAc esto no plantea un problema importante, con la dopamina es la catecolamina principal transmisor²⁴. Debido a que aproximadamente 98% de las células en la NAc son medio neuronas espinosas que responden a de neurotransmisión dopaminérgica²⁴, la señal está sesgada hacia la detección de la dopamina y facilita el uso de este enfoque más llave.

Otro beneficio de este biosensor enzimático y fibra de carbono potencial fijado el sistema de grabación es que se pueden realizar grabaciones de doble sonda, de modo que electroactivos y nonelectroactive neurotransmisores como la dopamina y el glutamato pueden medirse en el mismo animal al mismo tiempo. Aunque los datos presentados aquí provienen de grabaciones en distintos animales, estas técnicas se pueden emplear al mismo tiempo que uno puede evaluar la convergencia de la neurotransmisión en varias regiones del cerebro o en la misma región bilateralmente. Combinación de grabaciones en el mismo animal, o comparación de grabaciones a través de animales como se muestra aquí, son dos poderosas herramientas en elucidar los mecanismos detrás de las conexiones de red y señalización.

En suma, este artículo demuestra las técnicas potentes de biosensores enzimáticos y grabación de potencial fijo para medir múltiples neurotransmisores electroactivos y nonelectroactive utilizando una sola configuración experimental. Aunque los datos presentados aquí provienen de grabaciones de los neurotransmisores a través de múltiples animales, este sistema proporciona la capacidad de grabar hasta 4 sensores en un animal al mismo tiempo¹⁵. Los resultados de la muestra presentados colectivamente proporcionan la penetración en la neurotransmisión rápida en el hámster hembra resultante de patrones específicos de estimulación copulatoria del macho. Además, estos experimentos demuestran respuestas tiempo-bloqueada de transitorios dopaminérgica y glutamatérgica en la base de la NAc de la mujer a intromisiones del varón, lo que sugiere que esta versión puede ser responsable de codificación distintas propiedades adictivas de comportamiento sexual. Nuestro objetivo es continuar utilizando el patrón de apareamiento en hámsteres sirios femenino para desarrollar una visión más comprensiva de la relación de la dopamina en vivo y la liberación de glutamato y los circuitos subyacentes a los componentes individuales de los estímulos copulatoria del varón. Creemos que la capacidad para caracterizar los patrones de estos neurotransmisores no sólo es beneficiosa de una ciencia básica perspectiva²³, sino también en la aclaración de posibles abordajes terapéuticos de formas patológicas de comportamiento recompensa tal como la droga adicción²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.