Mesurer les variations In Vivo des neurotransmetteurs extracellulaires pendant naturellement récompenser les comportements chez les femelles Hamsters syriens

Summary

Ce livre présente en détail l’utilisation d’enregistrements ampérométrie potentiel fixe à l’aide d’électrodes de fibre de carbone et de la technologie de biocapteurs enzymatiques pour mesurer la libération de dopamine et du glutamate avec haute résolution temporelle lors de comportement gratifiant naturel dans le hamster femelle.

Abstract

La capacité de mesurer la libération des neurotransmetteurs sur une échelle de temps rapide permet aux patrons de la neurotransmission liés à des comportements spécifiques ou des manipulations ; un outil puissant dans l’élucidation des mécanismes sous-jacents et le circuit. Alors que la technique de la microdialyse a été utilisée pendant des décennies pour mesurer presque n’importe quelle analyte d’intérêt dans le cerveau, cette technique est limitée en résolution temporelle. Alternativement, une numérisation rapide voltampérométrie cyclique est aussi bien dans le temps précis et extrêmement sensible ; Toutefois, comme cette méthode techniquement difficile repose sur l’électroactivité de l’analyte d’intérêt, la possibilité de détecter les substances nonelectroactive (p. ex., le neurotransmetteur glutamate) est éliminée. Ce livre présente en détail l’utilisation d’un système clé en main qui combine l’ampérométrie potentiel fixe et biocapteurs enzymatiques pour mesurer les neurotransmetteurs des polymères électroactifs et nonelectroactive avec la précision temporelle. Le jumelage de ces deux puissantes techniques permettant la mesure de neurotransmission phasique et tonique avec une relative facilité et permet l’enregistrement de plusieurs neurotransmetteurs simultanément. Le but de ce manuscrit est de démontrer le processus de mesure de la dopamine et du glutamate neurotransmission in vivo à l’aide d’un comportement naturellement enrichissant (c.-à-d., comportement sexuel) chez les hamsters femelles, dans le but d’afficher la faisabilité technique de ce test pour l’examen des autres comportements et paradigmes expérimentaux.

Introduction

La capacité de mesurer la libération des neurotransmetteurs chez les animaux de se comporter éveillé permet aux chercheurs de comportements spécifiques avec des modèles spatiaux et temporels de la neurotransmission, un outil puissant pour étudier les mécanismes et circuits qui sous-tend tous les deux un lien naturel et les comportements opérant en temps réel. Historiquement, microdialyse a été utilisée pour mesurer les substances électriquement réactifs et non réactifs dans le milieu extracellulaire du cerveau¹. Cette technique utilise un flux continu d’une solution aqueuse de composition ionique semblable au liquide extracellulaire, au moyen d’une sonde de microdialyse composée d’un petit arbre avec une pointe de membrane semi-perméable fibre creuse². Après l’insertion de la sonde, les neurotransmetteurs ou autres analytes d’intérêt peuvent traverser la membrane semi-perméable par diffusion passive avant sont recueillis à des intervalles pour une analyse ultérieure par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), un chimie analytique technique communément utilisée pour séparer, identifier et quantifier les composants d’un mélange hétérogène de³.

Bien que la microdialyse est une technique sensible qui peut être utilisée pour mesurer pratiquement n’importe quelle analyte d’intérêt, la résolution temporelle est faible, avec des fréquences d’échantillonnage maximale de l’ordre de minutes à quelques dizaines de minutes^1,2. L’invention de la voltampérométrie cyclique de balayage rapide (FSCV), une technique qui s’appuie sur le potentiel d’oxydo-réduction des espèces électroactives, peut élucider près de concentrations instantanées de l’analyte d’intérêt dans le liquide extracellulaire. En bref (voir Robinson et al. ⁴ pour un examen approfondi), une électrode est appliquée pour soulever et abaisser la tension d’une manière vague triangulaire sur une échelle de temps rapide⁴. Lorsque la tension est dans la plage correcte, le composé d’intérêt est à plusieurs reprises oxydé et réduit. Cette oxydation et réduction se traduit par un mouvement d’électrons qui crée un petit courant alternatif. Analyse des taux aura lieu sur l’échelle de seconde avec l’oxydation et de réduction des composés qui se produisent en microsecondes. En soustrayant l’arrière-plan actuel créé par la sonde de courant qui en résulte, on peut générer une tension vs actuelle parcelle unique pour chaque composé. Étant donné que l’échelle de temps des oscillations tension est connue, ces données peuvent servir à calculer une parcelle du courant en fonction du temps. Ainsi, les concentrations relatives de ce composé peuvent être déterminées tant que le nombre d’électrons transférés dans chaque oxydation et la réaction de réduction est connue⁴.

Cette spécificité chimique et une haute résolution temporelle faire FSCV une technique puissante pour la détection de modification chimique concentration in vivo. Cependant, malgré ces multiples avantages, cette technique requiert une grande expertise technique et des équipements coûteux et le programme d’installation. En outre, nonelectroactive neurotransmetteurs (p. ex., glutamate) ne peuvent être mesurées à l’aide de cette technique. Heureusement, les progrès technologiques dans le domaine de l’électrochimie⁵, ainsi que la commercialisation de ces inventions, a introduit une approche relativement simple de mesurer non-polymères électroactifs neurotransmetteurs chez les animaux éveillés de comportement anormal sans compromettre la technique temporelle de précision-a connu comme la technologie des biocapteurs enzymatiques. Cette technique utilise la conversion enzymatique du neurotransmetteur nonelectroactive d’intérêt dans les deux substrats, dont une est électroactifs de peroxyde d’hydrogène qui est détecté comme un courant d’oxydation ampérométrique généré par un potentiel appliqué⁵ . Sondes de biocapteur disponible dans le commerce (voir Figure 1) mesurent sélectivement analytes d’intérêt en competitivement réduisant la contribution des interférences endogènes. Dans le cas de glutamate, la contribution de la commune interferent l’acide ascorbique (AA) est compétitif réduite au courant mesuré en localisant co oxydase AA sur la surface active enzymatique du capteur, conversion AA non-polymères électroactifs déhydroascorbate et l’eau. En outre, une couche de polymère chargée négativement Nafion présente sous la couche de l’enzyme exclut les composés anioniques endogènes.

Ce même montage expérimental de biocapteur peut mesurer électroactifs neurotransmetteurs comme FSCV, mais au lieu de cela, il emploie un enregistrement potentiel fixe⁶. Contrairement à la tension oscillante appliquée dans FSCV, dans un enregistrement potentiel fixe la tension est maintenue à l’oxydo-réduction potentielle pour l’analyte d’intérêt. Bien qu’il soit moins chimiquement sélectif que FSCV car plusieurs neurotransmetteurs peuvent avoir le même potentiel, de redox dans les zones cérébrales qui majoritairement incliner vers un neurotransmetteur, la nature de la clé de cette approche l’emporte sur l’absence de produit chimique spécificité.

La possibilité de mesurer des polymères électroactifs et nonelectroactive libération des neurotransmetteurs en temps quasi réel et liez-le à certains événements comportements fournit l’occasion d’examiner la libération des neurotransmetteurs convergentes. Ce manuscrit détaille l’utilisation de ce système d’interroger la neurotransmission de la dopamine et du glutamate en réponse à la récompense naturelle chez les hamsters se comporter éveillés. Le but du présent document est de détailler le processus de mesure de cette libération des neurotransmetteurs durant le comportement sexuel chez les hamsters femelles, dans le but de démontrer la faisabilité à l’examen des autres comportements et paradigmes expérimentaux.

Les hamsters sont un modèle idéal pour une utilisation dans les enregistrements électrochimiques
Historiquement, modèles de rat et de souris ont été utilisés dans l’étude du comportement sexuel. Ces espèces de rongeurs se livrer à une séquence de copulation dynamique, impliquant de nombreux comportements féminin invitation qui incluent hopping, s’élançant et oreille remuant pour attirer le mâle pour chasser et finalement monter la femelle⁷. Le montage par le mâle (avec ou sans pénétration vaginale) dure seulement quelques secondes, pendant laquelle la femelle s’engage dans sa posture de comportement sexuel (appelée lordose) également seulement pendant quelques secondes avant de reprendre les comportements de sollicitation active. Ce modèle de comportement, composé de niveaux élevés d’activité entrecoupées de courtes périodes d’immobilité, est problématique pour la mesure de la neurotransmission dans le comportement des animaux. Tout d’abord, on peut artefacts de mouvement dans les enregistrements ampérométrique non liés à l’activité neurale. Deuxièmement, la locomotion est associée à la libération de neurotransmetteurs particuliers dans certaines régions du cerveau. Par exemple, la libération de dopamine a été couplée à l’activité locomotrice dans le striatum dorsal et ventral^8,9, une constatation qui ont formé la base pour les mesures de la microdialyse de dopamine après psychostimulant administration,¹⁰. Parce que les comportements de sollicitation femelle typique MOSt rongeurs impliquent des niveaux élevés de l’activité locomotrice et sont représentés par la majeure partie d’un test de comportement sexuel de 10 minutes, ce qui rend difficile d’attribuer les changements dans la neurotransmission aux composantes du comportement sexuel explicites qui collectivement durent seulement minutes.

Pour analyser le profil neurochimique du comportement sexuel féminin, ce laboratoire chercha une espèce dans laquelle il y a une activité locomotrice minimale accompagnant le comportement sexuel. La séquence de copulation chez le hamster syrien (Mesocricetus auratus) est idéale pour les enregistrements neurochimiques en raison de l’absence de comportements de sollicitation généralement vu chez les rats et les souris¹¹. En conséquence, hamsters femelles vont entrer et pour gérer la posture de la lordose pour plus de 9 minutes sur 10 minutes essais session¹². Avec l’absence de mouvements locomoteurs étrangères par la femelle, en vivo électrochimiques enregistrements qui peuvent être associés aux éléments d’interactions sexuelles avec le mâle peuvent être obtenus.

Combats de copulation chez les hamsters
Après l’introduction d’un animal mâle stimulus dans la chambre d’essai, le mâle engagera au départ dans l’enquête d’ano-génitales (IA) de la femelle avant de monter le son (Figure 2A). Afin que le mâle à la monter, la femelle doit assumer une posture sexuelle réceptive appelée lordose, dans laquelle elle arches son dos et dévie vers sa queue, afin que le mâle de montage peut accéder du pénis dans son vagin. Le mâle va monter la femelle, étreignant son arrière-train avec deux pattes (Figure 2B) et commencer à chevauchement pour tenter de gagner l’intromission du pénis (Figure 2C). Le mâle va monter la femelle (sans insertion) ainsi qu’intromit un certain nombre de fois avant d’atteindre finalement l’éjaculation. Cette séquence de montures et intromissions conduisant à l’éjaculation est appelée un « bout de copulation ». Les hommes auront plusieurs épisodes copulateurs dans une seule session.

Protocol

toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Minnesota et sont en conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ¹³ .

1. animaux et chirurgie de canulation

hamsters

1. syrienne d’obtenir auprès d’un fournisseur d’animaux commun environ 55 jours après la naissance.
   Remarque : Bien que l’âge des animaux varient en raison de contraintes de différents paradigmes expérimentaux, pour comportement sexuel il est important d’obtenir des animaux sexuellement matures qui ont tous environ le même âge.
2. Animaux de la maison dans un contrôle de température (22 ° C) et de l’environnement d’éclairage (14 h de lumière suivie de 10 h d’obscurité avec lights out à 13:00 h), avec la nourriture et l’eau disponible ad libitum sauf pendant les périodes d’essai expérimental.
   Remarque : Étant donné que les hamsters reproduisent selon les saisons, ce 14:10 cycle lumière/obscurité imite leurs conditions de reproduction naturel.
3. Après une acclimatation de 1 semaine au laboratoire, effectuer des ovariectomies bilatéraux aseptiques et des canules stéréotaxiques intracrâniennes sous anesthésie générale (p. ex., pentobarbital) et administrer appropriées sur le plan institutionnel-approuvé un traitement analgésique et antibiotique postopératoire décrite précédemment ^{14 , 15}.
   Remarque : Pour l’étude du comportement sexuel, ovariectomies sont nécessaires pour supprimer la principale source endogène des hormones sexuelles, afin que les animaux peuvent être uniformément induites à la réceptivité sexuelle avec hormone exogène, conformément à la chronologie expérimentale.
   1. Pour l’implantation de sonde fois dopaminergique et glutamatergiques, stereotaxically implant guide canules (0,7 mm de diamètre ; la figure 3) dans la zone d’intérêt (par exemple, ce laboratoire ciblé le bon noyau accumbens (NAc)) tel que décrit en détail par ailleurs ¹⁵.
      Remarque : Bien que les données présentées proviennent des enregistrements d’un capteur unique d’une sonde de glutamate ou de la dopamine par animal, ce système permet l’enregistrement simultané de jusqu'à 4 capteurs dans un seul animal ; ainsi, 1-4 canules pourraient être implantées selon résultats et plan expérimental désiré.
      1. Déterminer les coordonnées d’implant de la région d’intérêt à l’aide d’un atlas stéréotaxique (par exemple, Le cerveau le Hamster doré par Morin & bois), gardant présente à l’esprit que le capteur s’étend de 1 mm en dessous de la canule dans les tissus cérébraux.
   2. Après stereotaxically, une canule est abaissée vers l’emplacement souhaité de la dorsale-ventral, il appose sur le crâne à l’aide d’un bouchon construit à partir d’acrylique dentaire, fixé avec des vis en acier inoxydable et une tête en plastique monter ( Figure 3 ; Voir ¹⁵ pour plus de détails).
   3. Pour les tests de fibre de carbone, insérer une électrode de référence (350 μm de diamètre, longueur totale 7,5 mm) dans l’hémisphère controlatéral.
      Nota : Un emplacement spécifique ou la distance de la canule n’est pas exigé ; électrodes de référence peuvent être placés n’importe où dans l’hémisphère controlatéral qui convient.

2. Biocapteur et tests de fibre de carbone

1. après 1 semaine de récupération de la chirurgie, administrer le régime d’amorçage hormone pour induire la réceptivité sexuelle.
   1. Injecter 10 µg de benzoate d’estradiol dans 0,1 mL d’huile de coton par voie sous-cutanée (s.c.), environ 48 h et 24h avant le comportement sexuel des tests, pour induire la réceptivité sexuelle vers le mâle ¹¹.
   2. Injecter 500 µg de progestérone dans 0,1 mL d’huile de coton, s.c., 4 h avant l’introduction du mâle pour induire la réceptivité sexuelle ¹¹.
2. Tester tous les animaux au début de la phase nocturne de leur cycle de tous les jours, comme les comportements sociaux des rongeurs sont sous réserve de modifications en vertu de la lumière blanche et rouge test conditions ^{16 , 17 , 18}.
3. pour tester les biocapteurs enzymatiques glutamate, étalonner les capteurs in vitro ( Figure 4) avant de l’utiliser comme décrit plus haut ^{15 , 19}.
   1. faire le calibrage des solutions fraîches sur la journée d’essais en verre 20 mL centrifuger les tubes. Pour la solution d’analyte, dissoudre 7,4 mg d’acide L-glutamique dans 10 mL d’ultra purs H ₂ O en retournant doucement le tube. Faire la solution interferent en dissolvant 176,1 mg AA dans 10 mL d’ultra purs H ₂ O.
   2. Mis en place pour l’étalonnage en plaçant un agitateur magnétique sur la base d’un stand d’anneau de laboratoire de base. Placer un bécher chemisé de 20 mL sur le dessus de l’agitateur magnétique et la bloquer à l’aide d’une pince de 2 broches moyenne.
      1. Ajouter une agitation magnétique bar et 20 mL de 100 mM de phosphate solution saline tamponnée (PBS) dans le bécher chemisé. Connectez le bécher chemisé à un bain d’eau circulant à chauffer la solution tampon à 37 ° C.
         NOTE : Les étalonnages de biocapteurs enzymatiques doivent être effectuées à la température corporelle, étant donné que l’activité enzymatique est influencée par la température.
   3. Placer le support de calibrage capteur sur le becher chemisé et définissez un préampli 4 canaux d’étalonnage sur le dessus, en fixant à l’aide d’une pince à angle droit. Connecter l’appareil à un appareil de climatisation et d’acquisition de données pour les données d’étalonnage record.
   4. Tester la sensibilité de chaque biocapteurs enzymatiques au glutamate (ou autres analytes d’intérêt pour les autres disponibles dans le commerce de biocapteur sondes par exemple, glucose) avant l’enregistrement expérimental en plaçant la sonde dans le support de calibrage au sommet d’une bécher chemisé, submergeant la cavité de télédétection et d’une partie de la référence de chlorure d’argent (AgCl) câblage dans la solution tampon.
      1. Avant de connecter chaque capteur (jusqu'à 4) mis à l’essai à un port sur un préampli 4 canaux d’étalonnage, initier un nouvel enregistrement sur l’interface de l’ordinateur utilisant le logiciel d’acquisition téléchargeables gratuitement. Laisser les capteurs atteindre un niveau de référence stable.
   5. Commencer à ajouter les injections d’analyte lorsque les capteurs ont atteint un niveau de référence stable. Utilisez le trou dans le support de calibrage pour introduire un embout de la pipette dans la solution tampon. Utilisez l’outil d’annotation clé rapide dans le logiciel d’enregistrement pour annoter quand une injection est faite.
      1. Ajouts µM 10 faire du glutamate par pipetage 40 μL de la solution d’analyte dans la solution tampon. Attendez que le capteur se stabiliser entre les ajouts. Ajouter 3 injections de solution d’analyte avant d’ajouter une seule injection de la solution de AA interferent (volume d’injection μL 50 250 μM changement de concentration).
         Remarque : L’étalonnage permet la conversion des modifications du signal ampérométrique (vu lors de l’enregistrement expérimental enzymatique à l’étape 2.12) aux variations de concentration de glutamate, si vous le souhaitez. Voir référence ¹⁵ pour les instructions par étapes. Les sondes dopaminergique utilisés par ce laboratoire sont étalonnés au cours du processus de fabrication par le fournisseur commercial. Glutamate sondes doivent être étalonnés au moment de l’utilisation que leur sensibilité peut diminuer au fil du temps, car les composants enzymatiques dégradent ¹⁹. Parce que la fibre de carbone électrodes ne subissent pas de dégradation, le calibrage effectué par la société avant expédition est suffisant le long comme tVoici une probabilité accrue d’endommager la fibre de carbone léger (350 μm de diamètre) grâce à une gestion supplémentaire.
4. La ligne de la chambre d’essai avec literie provenant de l’animal ' cage maison de s.
   Remarque : Ceci augmente la femelle ' chambre de familiarité de s dans les essais, ainsi que l’expose le mâle pour stimuler sexuellement les signaux olfactifs de l’accouplements qui ont été distribués par la femelle dans la réponse au traitement estradiol.
5. Légèrement anesthésier les animaux avant l’insertion de la sonde par isoflurane ou un autre anesthésique volatil dans une chambre à induction.
6. Supprimer l’obdurator occlusive de la canule guide et insérez la fibre de carbone électrode ou sonde enzymatique par l’intermédiaire de la tige guide.
7. Après l’insertion de la sonde, placer l’animal dans la chambre d’essai.
   Remarque : Ce laboratoire utilise un aquarium en verre 10-gal (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), mais chambres rondes de superficie égale peuvent également être employées.
8. Commencer à enregistrer le signal vidéo et verrouillé en temps ampérométrique dans un logiciel disponible dans le commerce, décrit en détail ailleurs ¹⁵.
9. Connecter le capteur pour le système d’enregistrement : le potentiostat via un câble électrique blindé et un pivotement électrique. Stabiliser le raccordement des capteurs en vissant un accessoire de broche sur la tête de montage. Renforcer la connexion à l’aide de film de laboratoire si nécessaire.
   Remarque : Un connecteur personnalisé est nécessaire pour fixer la fibre de carbone électrode et électrode de référence pour le potentiostat, tandis que les capteurs enzymatiques glutamate peuvent être connectés directement à la potentiostat.
10. Permettre au capteur s’équilibrer dans le cerveau avant l’essai expérimental.
    NOTE : Temps d’établissement diffèrent selon le capteur de l’enregistrement (par exemple, capteurs enzymatiques nécessitent l’équilibration du 2-4 h, tandis que les électrodes de carbone-fibre exigent seulement environ 30 min). Si les deux types de capteurs sont implantées, équilibrer pendant la longue période de capteur enzymatique.
11. Après équilibration de capteur, introduire un mâle de stimulation dans la chambre d’essai.
12. Après le premier montage avec insertion du pénis (appelée intromission) par le mâle de la relance, continuer l’enregistrement pour un 10-30 min supplémentaire, selon les objectifs expérimentaux.
13. Suite à des tests comportementaux, débranchez la femelle ' capteur s.
14. Supprimer les deux hamsters de la chambre d’essai. Enlever la litière et nettoyer la chambre à l’aide d’éthanol à 70 %.
    Remarque : En raison de l’équilibration bref requise pour les enregistrements de la fibre de carbone, étapes 2.3-2.14 peuvent être répétées pour tester plusieurs animaux dans la même journée. En revanche, comme les capteurs enzymatiques nécessitent environ 4 h de l’équilibration, ne tester qu’un seul animal par jour afin de limiter la variation inter-sujet possible en raison des différences chez les animaux ' circadienne temps lors des tests.

3. Sacrifice et la Perfusion

1. l’issue de la période d’essai, profondément anesthésier le cobaye femelle avec un agent euthanizing (par exemple, ce laboratoire utilise une injection intrapéritonéale de 0,2 mL de solution de phénytoïne et pentobarbital) .
2. Transcardially perfuse l’animal avec 25 mM PBS, pH 7,6, pour enlever tout le sang circulant, suivi d’une fixation de 20 min à l’aide de 4 % paraformaldéhyde-PBS.
3. Enlever le cerveau et postfix en ~ 30 mL de la solution de paraformaldéhyde à 4 % dans un tube conique de 50 mL du jour au lendemain. Solution de saccharose-PBS
   1. magasin du cerveau dans un 10 % jusqu’au moment de la section série.
      NOTE : Cerveaux peut-être être conservés jusqu'à 2 semaines, avec des changements de solution de saccharose hebdomadaire pour éviter la croissance potentielle de contaminants.
4. Série section du cerveau à 40 µm fend la région implantée soit avec un microtome à congélation ou cryostat décrite précédemment ¹⁹.
5. Monter en série des tranches sur des lames de revêtement adhésif disponibles dans le commerce (ou voir ²⁰ à faire). Laisser pour sécher, au moins du jour au lendemain.
6. Tacher les diapositives avec un colorant violet de crésyle, clair, et lamelle comme décrit plus haut ²⁰.
7. Les diapositives à l’aide au microscope à fond clair pour confirmer le placement anatomique du capteur d’image.

4. Codage comportemental

1. vue et annoter les vidéos logiciel gratuit téléchargeable sur le marché (voir Table des matières) dans le mouvement lent à précisément les comportements de code verrouillage de temps au signal ampérométrique.
   Remarque : Pour utiliser le code MATLAB dans l’analyse (voir ci-dessous ), annoter le début et à la fin de chacun de la femelle ' s et mâle ' comportements s.
   1. Annoter startLordosis dans le cadre quand la femelle initie une dorsiflexion de son dos et sa queue vers le haut les défauts. Annoter des endLordosis lorsque la femelle met fin à cette posture, qui se produit souvent lorsque la femelle réajuste vers un autre emplacement dans la chambre d’essai.
   2. Annoter startAI quand la femelle est dans la posture de la lordose et le mâle déplace son museau vers la femelle ' la région anogénitale s, où les renifler, lécher ou fouinais de sa région périnéale peut se produire. Annoter des endAI lorsque le mâle supprime son museau de la proximité immédiate de la femelle ' la région anogénitale s.
   3. Annoter startMount quand le mâle s’approche et met ses pattes de devant sur la femelle dans une posture de montage, indépendamment de l’orientation de la tentative de montage (p. ex., côté, rumsteck).
   4. Annoter startIntromission lorsque le chevauchement réussie gagne l’accès du pénis masculin monté à la femelle ' vagin s.
      Remarque : Une intromission est sur le plan comportemental distingue le charriage monté qui se produit avant l’intromission, comme le mâle visiblement tire ses membres supérieurs vers son corps, son bassin vers l’avant les coups et enroule sa queue vers le haut, indiquant la pénétration (voir < classe forte = « xfig » > Figure 4 C).
      1. Le cas échéant, annoter éjaculation.
         Remarque : À la fin d’un combat d’accouplement et en conjonction avec une intromission réussie, le mâle va éjaculer. Bien qu’on ne peut pas visualiser les émissions réelles, des hamsters mâles ont une caractéristique foulant le mouvement avec leur patte pendant une intromission ²¹, ainsi annoter l’éjaculation à l’apparition du mouvement pied.
   5. Annoter endIntromission et endMount en même temps dans le cadre lorsque le mâle a supprimé ses deux pattes avant et donc, n’a aucun contact avec la femelle. En raison de l’incapacité fréquente de visualiser son retrait, simultané code ces deux comportements pour permettre à la cohérence et la fiabilité entre périodes d’accouplement.
      Remarque : Un combat accouplement suit une éjaculation avec succès ou lorsque la femelle rompt la posture de lordose suite au moins un monter.

5. Analyse de données d’exemple

Remarque : l’utilisation de la fibre de carbone fixe-potentiel et enregistrements enzymatiques pour dopamine uneglutamate de ND, respectivement, permet la possibilité de mesurer les toniques et phasiques motifs de libération électrochimique. Ce laboratoire utilise un système d’acquisition libre, commercial et logiciel pour enregistrer et convertir enregistré les signaux de l’analogique au numérique (biaiser 0.600 V, fréquence d’échantillonnage = 1 Hz).

1. Description du protocole de l’analyse de données exemple
   1. bien que d’autres programmes peuvent être utilisés, quantifier les toniques et phasiques (transitoires) modifications du signal électrochimique enregistré à l’aide de MATLAB.
      1. Pour les données présentées, calculer le signal de la tonique à l’aide d’un filtre de moyens mobile 50 points. Une représentation normalisée uniquement transitoire du signal a été calculée en soustrayant le signal tonique de données brutes. Lors de l’identification des pics phasiques, il existe diverses options algorithmiques (p. ex., étiquetage des pics comme des modifications du signal plus que 1 SD au-dessus de la moyenne).
      2. Identifier les emplacements de ces pics, c.-à-d., maxima locaux, du signal normalisé à l’aide de la fonction MATLAB peakfinder avec l’amplitude de crête minimale mis à la racine carrée du signal. L’emplacement des pics détectés à partir du signal normalisé a été utilisé pour extraire l’amplitude de chaque pic. La capacité de détecter des pics permet l’identification de tous les comportements de verrouillage de temps pouvant être coïncidant avec, ou conduire le relatives des pics dans le neurochimiques incriminés.
   2. Segment les données traitées selon les annotations comportementales (voir étape 3), un étudiant ' s t-test a été utilisé pour évaluer les différences dans le niveau de neurotransmetteur tonique, l’apparition de phénomènes transitoires et l’amplitude des transitoires pendant la lordose de combat avant accouplement contre lordose pendant l’accouplement des combats. Pour mesurer les changements à des schémas de tonique de libération électrochimique, les points de données qui se produisent au cours de la position de lordose directement avant un combat d’accouplement (c.-à-d., avant accouplement lordose de combat) ont été comparés à des points de données pendant un combat accouplement session à l’aide d’un t-test
2. Préparation de données brutes pour protocole d’analyse de données décrit
   Remarque : comme indiqué, bien que d’autres programmes ou analyses peuvent être également des options viables, afin d’utiliser le code MATLAB décrit ci-dessus, les données brutes doivent être prêts à la manière suivante :
   1. Exporter les fichiers d’annotation et de tension. Pour ce faire, sous le ' fichier ' onglet, sélectionnez le ' exportation ' fonction et sélectionnez la ' Annotations ' tab pour enregistrer les annotations. Sous le ' fichier ' onglet, sélectionnez le ' exportation ' fonctionner et choisir le " TSV ' tab pour enregistrer les mesures de tension comme un fichier d’extension TSV.
   2. Ouvrir chaque fichier avec un programme de tableur et enregistrez sous ' xls/xlsx ' de rendre les fichiers compatibles avec MATLAB.
      Remarque : Pour le ' Annotation ' fichier, il existe d’autres annotations qui doivent manuellement ajouté postérieur à l’exportation dans un tableur de dicter le début et la fin des deux la lordose bout avant accouplement (annotée comme PreMBlordorsis ) et le combat d’accouplement pour que ces moments peuvent être directement comparés comme mentionné dans l’étape 5.1.2.
   3. Annotez le début de la lordose avant accouplement de combat (startPreMBlordosis) dans le même temps, comme un comportement de lordose commence (startLordosis) qui a également inclut un comportement de monter et aussi, au début d’un nouvel accouplement combat si la femelle reste dans la posture de lordose.
   4. Annoter la fin de la lordose avant accouplement de combat (endPreMBlordosis) lorsque le premier Mont commence.
   5. Annoter le début d’un combat d’accouplement (startMB) au moment même de l’endPreMBlordosis, cela signifie le début d’un combat d’accouplement.
   6. Annoter la fin d’un combat d’accouplement (endMB) aux extrémités de la d’un montage comprenant une éjaculation (voir étape 4.1.4.1), ou à la suite de la femelle ' cessation de s de la posture de la lordose (endLordosis).

Representative Results

En utilisant l’électrochimique et comportementale codage méthode décrite ci-dessus, ce laboratoire a commencé à caractériser tant toniques et phasiques fluctuations de dopamine et de glutamate pendant in vivo des enregistrements du comportement sexuel. En raison de la manière dans le temps précis de cette méthodologie, nous pouvons mieux caractériser la neurotransmission lors de comportement sexuel ; en plus d’attribuer des changements dans les modes de libération changements correspondants de tonique pendant l’accouplement des combats et les fluctuations transitoires correspondantes au cours de la réception de la femelle des comportements copulateurs individuels (p. ex., l’intromission, éjaculation précoce) le mâle de montage.

Plus précisément, nous avons utilisé cette méthode pour se concentrer sur les patrons de la libération de dopamine et de glutamate dans le CNA d’animaux séparés de mesure. Le CNA est une région critique impliqué dans la récompense traitement²² et a été décrit comme une région intégrale dans les aspects de la récompense du comportement sexuel,²³.

Nous avons observé que, au cours de comportement sexuel, les femelles montrent une augmentation de tonique niveaux dopaminergique dans le noyau du CNA pendant l’accouplement des combats (Figure 5). Tandis que ces changements toniques sont affichées pour tous les épisodes d’accouplements, la méthode décrite ci-dessus peut mesurer changements tonique entre chaque bout d’accouplement et ainsi augmenter l’identification temporelle des variations globales à des niveaux de tonique de la libération des neurotransmetteurs dans toute l’ensemble de la session. En outre, cette méthodologie décrite déterminer les variations phasiques et carte temporellement les comportements probablement associés à ces fluctuations de neurotransmetteur phasique. Plus précisément, ces résultats préliminaires suggèrent que pendant les périodes d’accouplement, dopaminergiques transitoires dans le CNA surviennent pendant l’insertion vaginale (intromission) par le mâle (Figure 6). En outre, cette association avec intromission est spécifique, avec réponses dopaminergique négligeable d’autres comportements copulateurs, tels que de l’IA.

Une tendance similaire a été observée chez d’autres animaux en ce qui concerne la libération de glutamate, avec des transitoires rapides qui correspondent à des intromissions individuelles dans le noyau dorsal du CNA au cours d’un combat de copulation (Figure 7). Ce modèle est région spécifique, sans signal discernable au CNA coquille ou médiale noyau caudé d’autres animaux.

Figure 1 : La technologie des biocapteurs enzymatiques.
Fabrication standard de sondes disponibles dans le commerce de biocapteurs enzymatiques qui détectent des neurotransmetteurs par l’intermédiaire de traitement induite par l’enzyme (image de gauche). Dans le cas de capteurs glutamatergiques, oxydase de glutamate est utilisé dans la couche enzymatique (image de droite) pour convertir le neurotransmetteur nonelectroactive polymères électroactifs peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) qui est détecté par oxydation à la électrode de platine-iridium (Ir-Pt). Acide ascorbique (AA), une commune interférant qui est oxydé au même potentiel, est exclue par une addition d’oxydase de AA à la couche enzymatique qui convertit l’interférant en nonelectroactive l’eau. Autres interférants électroactifs négatives présentes dans le cerveau sont exclus par une membrane sélective passive. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Composantes d’un Hamster accouplement Bout.
Chez les hamsters, un combat d’accouplement se compose d’une séquence de comportements copulateurs, durant laquelle la femelle reste dans la posture de lordose immobile tandis que le mâle anogenitally étudie (A), Monte (B)et réalise l’intromission (C). . Remarque une intromission est sur le plan comportemental distingue de montage que l’homme tire ses membres supérieurs vers son corps, son bassin vers l’avant les coups et enroule sa queue vers le haut, ce qui indique de pénétration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Skull Cap Construction.
Guide de canules, vis à OS et acrylique dentaire sont utilisés dans la construction d’une calotte pour permettre l’insertion de la fibre de carbone ou sonde enzymatique (voir¹⁵ pour plus de détails par étapes). Cette statuette représente un implant simple canule au CNA juste un capteur enzymatique (aucune électrode de référence implantés) et la tête de montage en plastique pour la stabilité de la sonde. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Étalonnage de Glutamate biocapteur.
La sensibilité de chaque biodétecteur au glutamate est testée in vitro avant enregistrement expérimental de 10 µm ajouts du glutamate (vert) à 37 ° C (étant donné que l’activité enzymatique est influencée par la température). Chaque capteur est confirmé pour être irrecevable à l’acide ascorbique (AA ; rouge) ou de la dopamine (DA ; bleu). Cet étalonnage permet la conversion des modifications du signal ampérométrique vu pendant l’enregistrement expérimental à l’évolution de la concentration de glutamate.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Tonique augmente en Dopamine lors d’un combat d’accouplement.
A. exemple stylisé de préaccouplement signal lordose combat vs accouplement signal de combat lordose. Pour mesurer la libération de dopamine tonique, les réponses d’ampérométrique à des niveaux de dopamine en lordose avant un épisode d’accouplement (MB) sont comparés à ceux au cours d’un MB. Cases grises indiquent lordose avant un MB. BLboîtes de l’UE indiquent lordose pendant un MB. B. quantification représentative d’un animal en comparant la tension moyenne entre preMB lordose et lordose MB. Barres d’erreur indiquent erreur type de la moyenne (SEM) et astérisque indique une différence significative (p-valeur < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Trace de Dopamine représentant.
Phasique libération de dopamine est verrouillé en temps d’intromissions de mâle dans le noyau dorsal du CNA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Représentant Glutamate Trace.
Transitoires de glutamate correspondent aux intromissions individuelles dans le mâle dans le noyau dorsal du CNA au cours d’une longue expérience sexuelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Bien que relativement simple, certains problèmes peuvent survenir lorsque vous utilisez cette technique. Tout d’abord, le placement stéréotaxique des sondes doit être précis : contrairement à la microdialyse qui échantillonne un rayon plus large du milieu extracellulaire qui entoure la sonde, cette technique ne permet la mesure d’un neurotransmetteur qui entre en contact direct avec la sonde. Deuxièmement, dans le cas de l’enregistrement de la fibre de carbone, en raison de la faible largeur de fibre, rupture peut se produire, et la sonde doit être insérée avec soin délibérée. Dans le cas de biocapteurs glutamatergiques, dégradation enzymatique peut se produire si la sonde n’est pas utilisée dans le délai garanti de 3 semaines. Heureusement, toutes ces questions sont adressables et peuvent être éliminés avec les soins et l’attention au détail.

Une opposition peut être problématique se pose dans la spécificité de la fibre de carbone fixe-potentiel enregistrements. Parce que le potentiel appliqué pour la dopamine coïncide avec les autres monoamines, comme la norépinéphrine, si les enregistrements sont réalisés dans les domaines qui libèrent les deux neurotransmetteurs, que ce manque de spécificité chimique peut limiter l’interprétation des résultats. Au CNA, cela ne pose pas un problème majeur, avec la dopamine étant l' émetteur de catécholamines primaire²⁴. Étant à peu près 98 % des cellules dans le NAc moyennes neurones épineux qui répondent à de la neurotransmission dopaminergique²⁴, le signal est biaisé en faveur de détection de la dopamine et facilite l’utilisation de cette approche plus clé en main.

Un autre avantage de ce biocapteur enzymatique et la fibre de carbone de potentiel fixe système d’enregistrement est que double-sonde enregistrements peuvent être effectuées, de sorte que les polymères électroactifs et nonelectroactive neurotransmetteurs comme la dopamine et du glutamate peuvent être mesurées en le même animal en même temps. Bien que les données présentées ici proviennent des enregistrements chez les animaux séparés, ces techniques peuvent être employées en même temps tels qu’on peut évaluer la convergence de la neurotransmission dans plusieurs régions du cerveau ou dans la même région sur le plan bilatéral. Combinaison d’enregistrements dans le même animal, ou la comparaison des enregistrements à travers des animaux comme indiqué ici, sont les deux outils puissants à élucider les mécanismes à l’origine des connexions de réseau et de signalisation.

En résumé, cet article démontre les techniques puissantes de biocapteurs enzymatiques et enregistrement potentiel fixe pour mesurer plusieurs neurotransmetteurs polymères électroactifs et nonelectroactive utilisant un montage expérimental unique. Bien que les données présentées ici proviennent d’enregistrements individuels neurotransmetteur à travers de multiples animaux, ce système offre la possibilité d’enregistrer jusqu'à 4 capteurs chez un animal en même temps¹⁵. Les résultats de l’échantillon présentés collectivement donnent un aperçu de la neurotransmission rapide chez le hamster femelle due à des modes spécifiques de stimulation copulateur du mâle. En outre, ces expériences démontrent verrouillé en temps de réponses des transitoires dopaminergique et glutamatergique dans le noyau du CNA de la femelle à l’intromission de l’homme, ce qui suggère que cette version pourrait être responsable de l’encodage des propriétés distinctes et gratifiantes de comportement sexuel. Notre objectif est de continuer à utiliser le modèle d’accouplement chez les femelles hamsters syriens à brosser un tableau plus complet de la relation entre in vivo de la dopamine et la libération de glutamate et les circuits sous-jacents aux éléments individuels des stimuli copulatoire de l’homme. Nous croyons que la capacité à caractériser les patrons de ces neurotransmetteurs n’est pas seulement bénéfique d’une science fondamentale perspective²³, mais aussi dans l’élucidation des approches thérapeutiques potentiels pour les formes pathologiques de récompense comportement tel drug addiction²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.