Mäta In Vivo förändringar i extracellulär signalsubstanser under naturligt belönande beteenden i kvinnliga syriska hamstrar

Summary

Detta dokument beskriver användningen av fast-potential amperometrisk inspelningar med kolfiber elektroder och enzymatisk biosensor teknik för att mäta frisättningen av dopamin och glutamat med hög temporal upplösning under naturliga givande beteende i den kvinnliga hamster.

Abstract

Förmågan att mäta neurotransmitterfrigöraren på en snabb tidsskala tillåter mönster av neurotransmission kopplas till specifika beteenden eller manipulationer; ett kraftfullt verktyg i belysa underliggande mekanismer och kretsar. Medan tekniken med mikrodialys har använts i årtionden för att mäta nästan varje analyt sevärdheter i hjärnan, är denna teknik begränsad i temporal upplösning. Alternativt, snabb scan cyklisk voltametri är både temporally precisa och extremt känslig; eftersom denna tekniskt svår metod förlitar sig på electroactivity av analyten sevärdheter, elimineras dock möjlighet att upptäcka nonelectroactive ämnen (t.ex., signalsubstansen glutamat). Detta dokument beskriver användning av en turn-key system som kombinerar fast-potential amperometry och enzymatiska biosensing att mäta både elektroaktiva och nonelectroactive signalsubstanser med tidsmässiga precision. Hopkoppling av dessa två kraftfulla tekniker möjliggör mätning av både tonic och phasic neurotransmission med relativ lätthet, och tillåter inspelning av flera signalsubstanser samtidigt. Syftet med detta manuskript är att Visa processen att mäta dopamin och glutamat neurotransmission i vivo med ett naturligt givande beteende (dvs, sexuellt beteende) i kvinnliga hamstrar, med slutmålet att visa den teknisk genomförbarhet av denna analys för att undersöka andra beteenden och experimentella paradigm.

Introduction

Förmågan att mäta neurotransmitterfrigöraren i vaken beter sig djur tillåter forskare att koppla specifika beteenden med rumsliga och tidsmässiga mönster av neurotransmission-ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismer och kretsar underliggande både naturliga och operant beteenden i realtid. Mikrodialys har historiskt sett varit anställd att mäta både elektriskt reaktiva och reaktiva ämnen i den extracellulära miljön av hjärnan¹. Denna teknik använder ett kontinuerligt flöde av en vattenlösning av liknande Joniska sammansättning till den extracellulära vätskan, genom en mikrodialys sonden består av en liten axel med en spets av en semipermeable ihålig fiber membran². Efter införande av sonden, neurotransmittorer eller andra analyter kan korsa semipermeable membranet genom passiv diffusion innan samlas mellanrum för efterföljande analys av högpresterande vätskekromatografi (HPLC), en Analytisk kemi teknik som ofta används för att separera, identifiera och kvantifiera komponenter i en heterogen blandning³.

Även om mikrodialys är en känslig teknik som kan användas för att mäta valfri analyten sevärdheter, är den temporal upplösningen låg, med maximal samplingsfrekvens storleksordningen minuter till tiotals minuter^1,2. Uppfinningen av snabb scan cyklisk voltametri (FSCV), en teknik som bygger på redoxpotential elektroaktiva arter, kan belysa nära momentana koncentrationer av analyten av intresse i den extracellulära vätskan. I korthet (se Robinson et al. ⁴ för en omfattande översyn), en elektrod används för att höja och sänka spänningen i en triangulär våg mode på en snabb tid skala⁴. När spänningen är i rätt intervall, sammansatta av intresse upprepade gånger oxideras och reduceras. Denna oxidation och reduktion resulterar i en rörelse av elektroner som skapar en liten växelström. Skanna priser äga rum på under en sekund skala med oxidation och reduktion av föreningar som förekommer i mikrosekunder. Genom att subtrahera bakgrunden nuvarande skapad av sonden från den resulterande nuvarande, kan man generera en spänning vs. aktuella handlingen unik till varje förening. Eftersom tidsskalan för spänning svängningarna är känt, kan uppgifterna användas för att beräkna en tomt på nuvarande som funktion av tiden. De relativa koncentrationerna av substansen kan således bestämmas så länge som antalet elektroner överförs i varje oxidation och reduktionsreaktion kallas⁴.

Denna kemiska specificitet och hög temporal upplösning gör FSCV en kraftfull teknik för att upptäcka kemiska koncentrationer i vivoförändras. Men trots dessa grenrör fördelar kräver denna teknik omfattande teknisk kompetens och dyr utrustning och installation. Vidare kan inte nonelectroactive signalsubstanser (t.ex., glutamat) mätas med denna teknik. Lyckligtvis, tekniska framstegen i fältet i elektrokemi⁵, liksom kommersialisering av dessa uppfinningar, har infört en relativt enkel metod att mäta icke-elektroaktiva signalsubstanser i vaken beter sig djur utan att kompromissa med tidsmässiga precision-en teknik som kallas enzymatisk biosensor teknik. Denna teknik använder enzymatisk omvandling av nonelectroactive signalsubstansen sevärdheter till två substrat, varav en är elektroaktiva väteperoxid som identifieras som en amperometrisk oxidation nuvarande genereras av en tillämpad potential⁵ . Kommersiellt tillgängliga biosensor sonder mäta (se figur 1) selektivt analyter konkurrenskraftigt minska bidraget av endogena interferents. Glutamat, är bidrag till den gemensamma interferens askorbinsyra (AA) konkurrenskraftigt sänkas till den uppmätta nuvarande med samtidig lokalisera AA oxidas på sensorn, konvertera AA till icke-elektroaktiva aktiva enzymatisk yta dihydroascorbate och vatten. Dessutom utesluter ett negativt laddade Nafion polymerskikt närvarande under enzym lager endogen anjon föreningar.

Detta samma biosensor experimentella inställning kan mäta elektroaktiva signalsubstanser som i FSCV, men i stället det sysselsätter en fast-potential inspelning⁶. I motsats till den oscillerande spänning tillämpas i FSCV, i en fast-potential inspelning hålls spänningen redox potential för analyten sevärdheter. Även om det är mindre kemiskt selektiv än FSCV eftersom flera signalsubstanser kan ha samma redox potential, i hjärnområden som överväldigande skevar mot en signalsubstans, uppväger nyckelfärdiga arten av detta tillvägagångssätt avsaknaden av kemiska specificitet.

Möjligheten att mäta både elektroaktiva och nonelectroactive neurotransmitterfrigöraren i nära realtid och länka till specifika beteendemässiga händelser ger en möjlighet att undersöka konvergerande neurotransmitterfrigöraren. Detta manuskript Detaljer användningen av detta system att förhöra både dopamin och glutamat neurotransmission svar på naturlig belöning i vaken beter sig hamstrar. Syftet med denna uppsats är att beskriva processen med att mäta denna neurotransmitterfrigöraren under sexuellt beteende i kvinnliga hamstrar, med målet att påvisa dess genomförbarhet för att pröva andra beteenden och experimentella paradigm.

Hamstrar är en idealmodell för användning i elektrokemiska recordings
Råttor och möss-modeller har historiskt sett varit anställd i studien av sexuellt beteende. Dessa gnagare engagera sig i en dynamisk copulatory sekvens, som involverar många kvinnliga värvning beteenden som inkluderar hopping, rusa, och örat vickar för att locka hanen att jaga och slutligen montera den kvinnliga⁷. Montering av hanen (med eller utan vaginal penetration) varar bara några sekunder, under vilken honan bedriver sin sexuella beteende hållning (kallas Lordos) också endast för några sekunder innan återuppta aktivt värvningsförsök beteenden. Detta mönster av beteende, sammansatt av hög aktivitet varvat med korta perioder av orörlighet, är problematiskt för att mäta neurotransmission i beter sig djur. För det första kan det finnas rörelse artefakter i amperometrisk inspelningar som är orelaterade till neural aktivitet. Andra är locomotion associerade med frisättningen av vissa signalsubstanser i vissa regioner av hjärnan. Till exempel har frisättning av dopamin varit kopplad till rörelseaktivitet i rygg- och ventrala striatum^8,9, ett konstaterande som utgjorde grunden för mikrodialys mätningar av dopamin efter psykostimulantia administration¹⁰. Eftersom de kvinnliga-typiska värvning beteenden i most gnagare involverar höga nivåer av rörelseaktivitet, och representeras av huvuddelen av ett test med 10 minuters i sexuellt beteende, detta gör det svårt att tillskriva explicit komponenterna i sexuellt beteende som kollektivt senaste endast förändringar i neurotransmission minuter.

För att analysera den neurokemiska profilen av kvinnliga sexuella beteende, denna lab uppsökt en art där det finns minimal rörelseaktivitet åtföljer sexuellt beteende. Copulatory sekvensen i syriska hamstrar (Mesocricetus auratus) är idealisk för neurokemiska inspelningar på grund av värvning beteenden typiskt sett råttor och möss¹¹. Följaktligen kommer kvinnliga hamstrar ange och underhålla Lordos kroppshållning för uppemot 9 minuter ur 10 minuters test session¹². Med bristen på ovidkommande rörelseapparaten rörelser av den kvinnliga, i vivo kan elektrokemiska inspelningar som kan förknippas med komponenter av sexuella interaktioner med hanen erhållas.

Copulatory skjutningarna i hamstrar
Efter införandet av en manlig stimulans djur in i testing kammaren, kommer hanen inledningsvis delta i anogenital undersökning (AI) av honan innan montering hennes (figur 2A). För män att montera, måste honan anta en mottaglig sexuella hållning kallas Lordos, där hon bågar ryggen och avleder sin svans så att montering hanen kan få penis tillgång till hennes vagina. Hanen kommer att montera honan, knäpper fast hennes bakkvartsparter med båda tassar (figur 2B), och börja stötande i ett försök att vinna penis tillträde (figur 2C). Hanen kommer att montera kvinnligt (utan insättning) samt intromit ett antal gånger innan att så småningom uppnå utlösning. Denna sekvens av fästen och intromissioner leder till utlösning kallas en ”copulatory släng”. Män kommer att ha flera copulatory anfall inom en enda session.

Protocol

alla förfaranden beskrivs här godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av The University of Minnesota, och i enlighet med The Guide för skötsel och användning av försöksdjur ¹³ .

1. djur och kanylering kirurgi

1. Hämta syriska hamstrar från en gemensam djur leverantör till cirka 55 dagar ålder.
   Obs: Även om ålder på djur varierar på grund av begränsningar av olika experimentella paradigm för sexuellt beteende är det viktigt att få könsmogna djur som är alla ungefär samma ålder.
2. Hus djur i en kontrollerad temperatur (22 ° C) och belysning (14 h ljus följt av 10 h mörk med ljus ut vid 13:00 h) miljö, med mat och vatten tillgängliga ad libitum utom under perioder av experimentell provning.
   Obs: Eftersom hamstrar säsongsmässigt reproducera, denna 14:10 ljus/mörk cykel härmar deras naturliga uppfödningsförhållanden.
3. Efter en 1-veckas acklimatisering till laboratoriet, utför aseptisk bilaterala ovariectomies och intrakraniella stereotaxic kanyleringar under narkos (t.ex., pentobarbital) och administrera lämpligt institutionellt-godkänd postoperativa smärtstillande och antibiotika behandling beskrivs som tidigare ^{14 , 15}.
   Anmärkning: För studien av sexuellt beteende, ovariectomies är nödvändigt att ta bort den viktigaste endogena källan till sexuella hormoner så att djuren kan induceras jämnt till sexuell mottaglighet med exogena hormon i enlighet med experimentella tidslinjen.
   1. För både dopaminerga och glutamaterga sonden implantation, stereotaxically implantat guide kanyler (0,7 mm diameter; figur 3) in i området av intresse (t.ex., denna lab riktade rätt kärnan accumbens (NAc)) som beskrivs i stegvis information någon annanstans ¹⁵.
      Obs: Även om uppgifterna är från enda sensor inspelningar av en glutamat eller dopamin sonden per djur, detta system möjliggör samtidig inspelning av upp till 4 sensorer i ett enda djur; Således kunde 1-4 kanyler implanteras beroende på önskad experimentell design och utfall.
      1. Bestämma implantatet koordinaterna för regionen i intresse med hjälp av en stereotaxic atlas (t.ex., Gyllene Hamster hjärnan av Morin & trä), att hålla i åtanke att sensorn sträcker sig 1 mm nedanför kanylen i hjärnvävnad.
   2. Efter en kanyl är stereotaxically sänkt till önskad dorsal-ventrala plats, fästa den på skallen använder badmössa tillverkad av dental akryl, säkrade med rostfritt stål benskruvar och en plast huvud montera ( figur 3 ; Se ¹⁵ för mer information).
   3. För kolfiber testning, infoga en referenselektrod (350 μm diameter, 7.5 mm Totallängd) i den kontralaterala hemisfären.
      Obs: En särskild plats eller avstånd från kanylen krävs inte; referenselektroder kan placeras var som helst i den kontralaterala hemisfären som är bekväm.

2. Biosensor och kolfiber testning

1. efter 1 vecka att återhämta sig från operation, administrera den hormon priming regimen för att inducera sexuell mottaglighet.
   1. Injicera 10 µg av estradiol bensoat i 0,1 mL av bomullsfröolja subkutant (s.c.), cirka 48 h och 24 h före den sexuella beteende tester, för att inducera sexuell mottaglighet mot manliga ¹¹.
   2. Injicera 500 µg av progesteron i 0,1 mL av bomullsfröolja, s.c., 4 h före införandet av manlign att inducera sexuell mottaglighet ¹¹.
2. Testa alla djur i början av den mörka fasen av sin dagliga cykeln, som sociala beteenden av gnagare kan ändras under vitt ljus och rött ljus testa villkorar ^{16 , 17 , 18}.
3. för enzymatisk biosensor glutamat testning, kalibrera den sensorer i vitro ( figur 4) före användning som beskrivs tidigare ^{15 , 19}.
   1. göra kalibreringen lösningar färska dag provande i 20 mL glas Centrifugera rören. För analyten lösningen, lös 7,4 mg L-glutaminsyra i 10 mL av ultrarena H ₂ O genom att försiktigt vända tuben. Göra interferens lösning genom att lösa 176,1 mg AA i 10 mL ultrarent H ₂ O.
   2. Ställ in för kalibrering genom att placera en magnetomrörare på basen av baslaboratoriet ring ställning. Placera en mantlade 20 mL-bägare ovanpå magnetomröraren och klämma på plats med en medellång 2-stift-klämma.
      1. Lägg till magnetiska uppståndelse bar och 20 mL av 100 mM fosfat buffrad saltlösning (PBS) till den mantlade bägaren. Anslut mantlade bägaren till badkar cirkulerande vatten att värma buffertlösningen till 37 ° C.
         Obs: Enzymatisk biosensor kalibreringar utföras vid kroppstemperatur eftersom enzymatisk aktivitet påverkas av temperatur.
   3. Placera hållaren sensor kalibrering ovanpå mantlade bägaren och ange en 4-kanals kalibrering förförstärkare ovanpå, säkra på plats med en rät vinkel klämma. Anslut förförstärkare till en anordning för luftkonditionering och förvärvet av uppgifter till rekord kalibreringsdata.
   4. Testa känsligheten av varje enzymatisk biosensor till glutamat (eller andra analyter för andra kommersiellt tillgängliga biosensor sonder t.ex., glukos) innan experimentella inspelningen genom att placera sonden i kalibrering hållaren ovanpå en mantlade bägare, dränka fjärranalys kaviteten och någon del av silverklorid (Granulatfyllda) referensen tråd i buffertlösningen.
      1. Innan du ansluter varje sensor (upp till 4) testas till en port på en 4-kanals kalibrering förförstärkare, initiera en ny inspelning på datorgränssnitt utnyttja gratis nedladdningsbara förvärv programvara. Tillåta sensorerna för att nå en stabil baslinje.
   5. Börja lägga till analyten injektionerna när sensorerna har nått en stabil baslinje. Använd hålet i kalibrering innehavaren för att introducera en pipettspetsen till buffertlösningen. Använda verktyget snabb nyckel anteckning i inspelningsprogrammet för att kommentera när en injektion görs.
      1. Göra 10 µM tillägg av glutamat genom pipettering 40 μl av analyten lösningen in buffertlösningen. Vänta för att sensorn ska stabilisera mellan tillägg. Lägga till 3 injektioner av analyten lösning innan du lägger till en enda injektion från interferens AA lösning (50 μL injektionsvolym för 250 μM förändring i koncentrationen).
         Obs: Kalibrering möjliggör konvertering av förändringarna i amperometrisk signalen (uppträder under enzymatisk experimentella inspelningen i steg 2.12) till förändringar i glutamat koncentration, om så önskas. Se referens ¹⁵ för stegvis instruktion. De dopaminerga sonder används av övningen är kalibrerade under tillverkningsprocessen av kommersiell leverantör. Glutamat sonder måste kalibreras vid tidpunkten för användning som deras känslighet kan minska över tiden som de enzymatiska komponenterna försämra ¹⁹. Eftersom kolfiber elektroderna inte undergår nedbrytning, är kalibreringen utförs av bolaget före leveransen tillräckligt längs som tHär är en ökad sannolikhet för skada den tunna kolfiber (350 μm diameter) genom ytterligare hantering.
4. Linje provkammaren med sängkläder från djuret ' s buren.
   Obs: Detta ökar kvinnligt ' s förtrogenhet med testning avdelningen, liksom utsätter män att sexuellt stimulera lukt parning ledtrådar som distribuerades av honan i svar på estradiol behandlingen.
5. Lätt söva djuren före införandet av sonden antingen isofluran eller ett annat flyktigt bedövningsmedel i en induktion kammare.
6. Bort den ocklusiva använde från guide kanylen och sätt antingen i kolfiber elektrod eller enzymatisk sonden genom guide axeln.
7. Efter sonden införande, placera djuret i testning kammaren.
   Obs: Denna labb använder en 10-gal glas akvarium (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), men runda avdelningar med lika stor yta kan också anställas.
8. Börja inspelning av video- och tid-låst amperometrisk signalen i en kommersiellt tillgängliga program, beskrivs i detalj på annan plats ¹⁵.
9. Ansluta sensorn till inspelningssystemet: potentiostaten via ett elektriskt skärmad kabel och en elektrisk svivel. Stabilisera sensorn genom att skruva en pin fastsättning på huvudet fästet. Förstärka anslutningen använder lab film om nödvändigt.
   Obs: En anpassad koppling behövs att fästa både kolfiber elektrod och referenselektrod till potentiostaten, medan enzymatisk glutamat sensorer kan anslutas direkt till potentiostaten.
10. Tillåter sensorn temperera i hjärnan före experimentell provning.
    Obs: Jämviktstiden gånger varierar beroende inspelning sensorn (t.ex., enzymatisk sensorer kräver 2-4 h Jämviktstiden, medan kolfiber elektroder kräver endast ca 30 min). Om båda typerna av sensorer implanteras, temperera den enzymatiska sensorn längre.
11. Efter sensor Jämviktstiden, införa en stimulus hane i testning kammaren.
12. Efter första fästet med penis införande (kallas tillträde) av stimulans hanen, fortsätta inspelning för en ytterligare 10-30 min, beroende på de experimentella mål.
13. Efter beteendevetenskapliga tester, koppla bort honan ' s sensor.
14. Ta bort båda hamstrar från testning kammaren. Ta bort sängkläder och rengör kammaren med 70% etanol.
    Obs: På grund av den korta Jämviktstiden krävs för kolfiber inspelningar, steg 2,3-2.14 kan upprepas för att testa flera djur i samma dag. Däremot eftersom de enzymatiska sensorerna kräver ca 4 h av Jämviktstiden, testa bara ett djur per dag att begränsa möjlig mellan föremål variation på grund av skillnader i djuren ' dygnsrytm tid på testning.

3. Offer och Perfusion

1. efter ingåendet av testperioden, djupt söva kvinnliga testpersonen med en euthanizing agent (t.ex., denna lab använder en intraperitoneal injektion av 0,2 mL lösning för fenytoin och pentobarbital) .
2. Transcardially BEGJUTA djuret med 25 mM PBS, pH 7,6, ta bort alla cirkulerande blod, följt av en 20 min fixering med 4% PARAFORMALDEHYD-PBS.
3. Ta bort hjärnan och postfix i ~ 30 mL 4% PARAFORMALDEHYD lösningen i en 50 mL konisk slang över natten.
   1. Store hjärnan i en 10% sackaros-PBS lösning tills det att seriell avsnitt.
      Obs: Hjärnor kan förvaras upp till 2 veckor, med veckovisa sackaros lösning ändringarna för att undvika potentiell tillväxt på föroreningar.
4. Seriell avsnitt hjärnan i 40 µm skivor genom regionen implanterade med antingen en frysning mikrotom eller kryostaten beskrivs som tidigare ¹⁹.
5. Montera skivor seriellt på kommersiellt tillgängliga lim-belagd diabilder (eller se ²⁰ att göra). Låt torka, åtminstone över natten.
6. Fläcken bilderna med tolyloxi violett färgämne, tydlig, och täckglas som tidigare beskrivits ²⁰.
7. Bild bilder med ljusa fält Mikroskop till bekräfta anatomiska placeringen av sensorn.

4. Beteendemässiga kodning

1. Visa och kommentera videoklipp med hjälp av gratis kommersiellt nedladdningsbar programvara (se Tabell för material) i slow motion till just kod beteenden tid-låst till signalen amperometrisk.
   Obs: Att använda MATLAB koden i analysen (se nedanför ), anteckna den Starta och i slutet av varje av kvinnligt ' s och hane ' s beteenden.
   1. Anteckna startLordosis i ramen när honan initierar en dorsoflexion av ryggen och defekter sin svans uppåt. Kommentera endLordosis när honan avslutas denna hållning, som ofta uppstår när honan readjusts till en annan plats i testning kammaren.
   2. Kommentera startAI när honan är i Lordos hållning och hanen flyttar sin nos mot kvinnligt ' s anogenital regionen, där sniffning, Slicka eller nuzzling henne perineal region kan förekomma. Kommentera endAI när hanen tar bort sin nos från närheten av honan ' s anogenital regionen.
   3. Kommentera startMount när hanen närmar sig och lägger sin framtassarna på honan i en montering hållning, oavsett orientering av mount försök (t.ex., sida, gumpen).
   4. Kommentera startIntromission när framgångsrika stötande får den monterad manlig penis tillgången till kvinnligt ' s slidan.
      Obs: En tillträde är behaviorally kan särskiljas från den monterade stötande som inträffar före tillträde, som manlign synbart drar sina armar mot kroppen, kastar sin bäckenet framåt och lockar sin svans uppåt, som anger penetration (se < stark klass = ”xfig” > figur 4 C).
      1. i förekommande fall, kommentera utlösning.
         Obs: I slutet av en parning skjutningen och i samband med en framgångsrik tillträde, kommer manlign ejakulat. Även om man är oförmögen att visualisera det faktiska utsläppet, manliga hamstrar har en karakteristisk trampa rörelse med sin hind fot under en tillträde ²¹, alltså kommentera utlösningen på förekomsten av foten rörelsen.
   5. Kommentera endIntromission och endMount samtidigt i ramen när hanen har flyttat sin främre två tassar och således inte har någon kontakt med honan. På grund av den täta oförmågan att visualisera hans tillbakadragande, samtidiga kod dessa två beteenden för att enhetlighet och tillförlitlighet över parning skjutningarna.
      Obs: En parning bout antingen följer en framgångsrik utlösning eller är när honan bryter Lordos kroppshållning efter minst en montera.

5. Exempel dataanalys

Obs: användningen av fast-potential kolfiber och enzymatisk inspelningar för dopamin ennd Glutamat, möjliggör respektive, förmågan att mäta både tonic och phasic mönster av elektrokemisk ut. Denna labb använder en gratis, kommersiella förvärv system och programvara för att spela in och konvertera inspelade signaler från analog till digital (bias 0,600 V, samplingsfrekvens = 1 Hz).

1. Beskrivning av exempel data analys protokoll
   1. även om andra program kan användas, kvantifiera tonic och phasic (övergående) förändringar i den inspelade elektrokemiska signalen med hjälp av MATLAB.
      1. För presenterade data, beräkna tonic signalen med ett 50 punkters glidande genomsnitt filter. En övergående-bara normaliserade representation av signalen beräknades genom att subtrahera tonic signalen från rådata. När identifiera phasic toppar, finns det olika alternativ för algoritmisk (t.ex. märkning toppar som förändringar i signalen mer än 1 SD över medelvärdet).
      2. Identifiera platserna för dessa toppar, dvs, lokala maxima, från normaliserade signalen med en MATLAB-funktion peakfinder med den minsta maximal amplituden ställa att kvadratiska medelvärdet av signalen. Platsen för toppar upptäckt från normaliserade signalen användes för att extrahera amplituden från varje topp. Förmågan att upptäcka toppar möjliggör identifiering av eventuella tid-låst beteenden som kan vara sammanföll med, eller köra den relativa toppen i den neurokemiska under utredning.
   2. Segmentet bearbetade data i enlighet med de beteendemässiga anteckningar (se steg 3), Student ' s t-test användes för att utvärdera skillnader i nivån tonic signalsubstans, förekomsten av transienter och amplituden av transienter under före häckningen bout Lordos kontra Lordos under parning anfall. För att mäta förändringar i tonic konsumtionsmönstren av elektrokemisk ut, jämfördes datapunkterna som inträffar under Lordos positionen direkt före en parning anfallen (dvs, före häckningen bout Lordos) med datapunkter under en parning bout session med en t-test.
2. Beredning av rådata för beskrivs data analys protokoll
   Obs: som sagt, även om andra program eller analyser kan vara lika lönsamt alternativ, rådata för att kunna använda MATLAB koden ovan, måste förberedas i följande sätt:
   1. Exportera filerna annotering och spänning. Att göra detta, under den ' fil ', Välj den ' Export ' funktionen och välja den ' anteckningar ' fliken Spara anteckningarna. Under den ' fil ', Välj den ' Export '-funktionen och välja den " TSV ' fliken Spara spänning mätningarna som en TSV fil.
   2. Öppna varje fil med ett kalkylprogram och Spara som ' xls/xlsx ' att göra filerna kompatibla med MATLAB.
      Obs: För den ' anteckning ' fil, det finns ytterligare anteckningar som måste manuellt lagts till efter export i ett kalkylprogram diktera i start och slut av båda före häckningen bout Lordos (annotated som PreMBlordorsis ) och parning skjutningen så att dessa tidpunkter kan jämföras direkt som nämns i steg 5.1.2.
   3. Kommentera början av före häckningen bout Lordos (startPreMBlordosis) samtidigt som en svankrygg beteende börjar (startLordosis) som också innehåller en montera beteende och även i början av en ny parning bout om honan förblir i Lordos hållning.
   4. Kommentera slutet av före häckningen bout Lordos (endPreMBlordosis) när den första monteringen börjar.
   5. Kommentera i början av en parning släng (startMB) på samma gång av endPreMBlordosis, som betyder början på en parning bout.
   6. Kommentera i slutet av en parning släng (endMB) antingen i slutet av en montera som innehåller en utlösning (se steg 4.1.4.1), eller efter kvinnligt ' s upphörande Lordos kroppshållning (endLordosis).

Representative Results

Med hjälp av elektrokemiska och beteendemässiga kodning metoder som beskrivs ovan, har denna lab börjat att karakterisera både tonic och phasic fluktuationer i både dopamin och glutamat under i vivo inspelningar av sexuellt beteende. På grund av det temporally-exakt sättet av denna metod, kan vi mer noggrant karakterisera neurotransmission under sexuellt beteende; samt specifika förändringar i release mönster tillskriver under parning anfall, och motsvarande övergående fluktuationer i motsvarande tonic ändringar under honans mottagandet av enskilda copulatory beteenden (t.ex., tillträde, utlösning) från montering hanen.

Specifikt, använde vi denna metod för att fokusera på att mäta release mönster av dopamin och glutamat i NAc separat djur. NAc är en kritisk region inblandad i belöning bearbetning²² och har beskrivits som en integrerad region i belöning aspekter av sexuellt beteende²³.

Vi observerade att honor under sexuellt beteende, visar en ökning med tonic av dopaminerga nivåer i NAc kärna under parning anfall (figur 5). Medan förändringarna tonic är kan visas för alla parning skjutningarna, den metod som beskrivs ovan mäta tonic förändringar mellan varje parning bout, och därmed öka temporal identifiering av övergripande ändringar tonic nivåer av neurotransmitterfrigöraren i hela hela sessionen. Vidare kan beskrivs metoden lokalisera phasic förändringar och temporally karta de beteenden som sannolikt associerade med dessa phasic signalsubstansen svängningar. I synnerhet tyder dessa preliminära resultat på att under parning skjutningarna, dopaminerga transienter i NAc uppstår under vaginal införande (tillträde) av hanen (figur 6). Den här associeringen med tillträde är dessutom specifika, med försumbar dopaminerga Svaren till andra copulatory beteenden, såsom AI.

Ett liknande mönster har observerats i andra djur när det gäller glutamat release, med snabba transienter som motsvarar enskilda intromissioner i dorsala NAc kärna under en copulatory släng (figur 7). Detta mönster är regionen specifika, med inga märkbara signal som förekommer i NAc shell eller mediala caudatus av andra djur.

Figur 1 : Enzymatisk Biosensor teknik.
Standard tillverkning av kommersiellt tillgängliga enzymatisk biosensor sonder som upptäcker signalsubstanser via enzym-medierad bearbetning (vänstra bilden). När det gäller glutamatergic sensorer, är glutamat oxidas anställd i enzymatisk lagret (höger bild) att konvertera nonelectroactive signalsubstansen till elektroaktiva väteperoxid (H₂O₂) som identifieras genom oxidation vid den platina-iridium (Pt-Ir) elektrod. Askorbinsyra (AA), en gemensam interferent som oxideras på samma potential, utesluts via ett tillägg av AA oxidas på enzymatisk lager som omvandlar interferent till nonelectroactive vatten. Andra negativa elektroaktiva interferents finns i hjärnan är undantagna via en passiv selektiv membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Komponenter i en Hamster parning Bout.
I hamstrar består en parning bout av en sekvens av copulatory beteenden, under vilken honan förblir i orörliga Lordos hållning medan de manliga anogenitally undersöker (A), fästen (B)och uppnår tillträde (C). . Observera en tillträde är behaviorally urskiljbar från montering som hanen drar sina armar mot kroppen, sticker hans bäcken fram och lockar hans svans uppåt, som anger penetration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Skalle Cap konstruktion.
Guide kanyler, benskruvar och dental akryl används i byggandet av en kalott för att tillåta införandet av kolfiber eller enzymatisk sond (se¹⁵ för stegvis Detaljer). Denna siffra skildrar ett enda kanyl implantat över den högra NAc för en enzymatisk sensor (ingen implanterade referenselektrod) och plast huvud fäste för sensor stabilitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Glutamat Biosensor kalibrering.
Känsligheten för varje biosensor till glutamat är testade i vitro innan experimentella inspelning av 10 µm tillägg av glutamat (grön) vid 37 ° C (eftersom enzymatisk aktivitet påverkas av temperatur). Varje sensor bekräftas vara icke-lyhörd för askorbinsyra (AA; röd) eller dopamin (DA; blå). Denna kalibrering möjliggör omvandlingen av förändringar i amperometrisk signalen sett under experimentella inspelning till förändringar i glutamat koncentrationen.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : Tonic ökar i dopamin under en parning Bout.
A. Stylized exempel på premating bout Lordos signal vs. parning bout Lordos signal. För att mäta frisättning av dopamin tonic, jämfördes amperometrisk svaren på dopaminnivåer under Lordos innan en parning släng (MB) de under en MB. Gråa rutor anger Lordos innan en MB. BlUE rutorna ange Lordos under en MB. B. representativ kvantifiering från ett djur jämföra medelvärdet för spänning mellan henricbjorkman Lordos och MB Lordos. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM), och asterisken indikerar signifikant skillnad (p-värde < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 : Representant dopamin Trace.
Phasic frisättningen av dopamin är tid-låst till intromissioner från manlign i dorsala NAc kärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7 : Representant glutamat Trace.
Glutamat transienter motsvarar enskilda intromissioner från manlign i dorsala NAc kärna under en utökad sexuell upplevelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Även om det är relativt enkelt, kan vissa problem uppstå när sysselsätter denna teknik. Första stereotaxic placeringen av sonderna måste vara exakt: till skillnad från mikrodialys som prover en större radie av den extracellulära miljön kring sonden, denna teknik endast tillåter mätning av en signalsubstans som kommer i direkt kontakt med sond. Andra när det gäller kolfiber inspelningen, på grund av små bredden av fiber, brott kan uppstå, och sonden måste införas med avsiktlig omsorg. När det gäller glutamatergic biosensorer, kan enzymatiska nedbrytningen uppstå om sonden inte används inom den garanterade tid 3-veckor. Lyckligtvis, alla dessa frågor är adresserbara och kan elimineras med vederbörlig omsorg och uppmärksamhet på Detaljer.

En potentiellt problematiska varning uppstår i specificitet fast-potential kolfiber inspelningar. Eftersom tillämpad potentialen för dopamin sammanfaller med andra monoaminer, såsom noradrenalin, om inspelningarna görs i områden som frigör både signalsubstanser, än denna brist på kemiska specificitet kan begränsa tolkningen av resultaten. I NAc utgör detta inte ett stort problem, med dopamin är den primära katekolamin sändare²⁴. Eftersom ungefär 98% av cellerna i NAc är medellång taggig nervceller som svarar till dopaminerg neurotransmission²⁴, signalen är partisk mot upptäckt av dopamin och underlättar användningen av detta mer nyckelfärdiga tillvägagångssätt.

En annan fördel med denna enzymatiska biosensor och fast-potential kolfiber inspelning system är att dual-probe inspelningar kan utföras, så att både elektroaktiva och nonelectroactive signalsubstanser som dopamin och glutamat kan mätas i samma djur samtidigt. Trots de data som presenteras här kommer från inspelningar i separata djur, kan dessa tekniker användas samtidigt så att man kan utvärdera konvergens av neurotransmission i flera regioner i hjärnan eller i samma region bilateralt. Kombination av inspelningar inom samma djur eller jämförelse av inspelningar över djur som visas här, är båda kraftfulla verktyg i klarlägga mekanismerna bakom nätverksanslutningar och signalering.

Sammanfattningsvis visar detta papper kraftfulla tekniker för enzymatisk biosensing och fast-potential inspelning att mäta flera elektroaktiva och nonelectroactive signalsubstanser som utnyttjar en enda experiment. Även om data som presenteras här kommer från enskilda signalsubstansen inspelningar över flera djur, detta system ger möjlighet att spela in från upp till 4 sensorer i ett djur samtidigt¹⁵. Provresultaten presenteras gemensamt ge inblick i snabba neurotransmission i kvinnliga hamster som resulterar från särskilda mönster av copulatory stimulering från hanen. Ytterligare, dessa experiment Visa tid-låst Svaren av dopaminerga och glutamaterga transienter i NAc kärnan av kvinnligt till tillträde från hanen, vilket tyder på att denna utgåva kan vara ansvarig för kodning distinkta givande egenskaper sexuellt beteende. Vårt mål är att fortsätta utnyttja parning mönstret i kvinnliga syriska hamstrar att utveckla en mer heltäckande bild av relationen mellan in-vivo dopamin och glutamat release och den underliggande kretsen till enskilda komponenter i copulatory stimuli från manlign. Vi tror att förmågan att karakterisera mönster av dessa signalsubstanser inte är bara fördelaktigt från en grundläggande vetenskap perspektiv²³, men även att belysa potentiella terapeutiska metoder för patologiska former av belöning beteende sådan som drug addiction²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.