Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

Summary

Este documento detalha a utilização do potencial fixo amperométrico gravações usando eletrodos de fibra de carbono e tecnologia enzimática biosensor para medir a liberação de dopamina e glutamato com alta resolução temporal durante o comportamento natural de gratificante na hamster fêmea.

Abstract

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em uma escala de tempo rápida permite que os padrões de neurotransmissão para ser ligado a comportamentos específicos ou manipulações; uma poderosa ferramenta na elucidação de mecanismos e circuitos subjacentes. Enquanto a técnica do microdialysis tem sido usada há décadas para medir praticamente qualquer analito de interesse no cérebro, esta técnica é limitada em resolução temporal. Alternativamente, voltametria cíclica de varredura rápida é temporalmente precisos e extremamente sensível; no entanto, porque esse método tecnicamente difícil depende do electroactivity do analito de interesse, é eliminada a possibilidade de detectar substâncias nonelectroactive (por exemplo, o glutamato neurotransmissor). Este documento detalha o uso de um sistema turn-key que combina potencial fixo amperometry e biosensing enzimático para medir os neurotransmissores tanto eletroativos e nonelectroactive com precisão temporal. O emparelhamento destas duas poderosas técnicas permite a medição de tônico e neurotransmissão fásicos com relativa facilidade e permite a gravação de vários neurotransmissores simultaneamente. O objetivo deste manuscrito é demonstrar o processo de medição de dopamina e glutamato neurotransmissão no vivo usando um comportamento naturalmente gratificante (ou seja, comportamento sexual) em hamsters femininos, com o objetivo de exibir a viabilidade técnica deste teste para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.

Introduction

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em animais comportamento acordados permite que os pesquisadores de vincular comportamentos específicos com padrões espaciais e temporais da neurotransmissão-uma poderosa ferramenta para investigar os mecanismos e circuitos subjacentes a ambos naturais e comportamentos operante em tempo real. Historicamente, o microdialysis tem sido empregado para medir substâncias eletricamente reativas e não reactivas no meio extracelular do cérebro¹. Esta técnica usa um fluxo contínuo de uma solução aquosa de composição iônica semelhante ao fluido extracelular, através de uma sonda de microdialysis composta de uma haste pequena com uma dica de uma membrana de fibra oca semipermeable². Após a inserção da sonda, neurotransmissores ou outros analitos de interesse podem atravessar a membrana semipermeável por difusão passiva, antes de ser coletados em intervalos para posterior análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), um técnica de química analítica, comumente utilizada para separar, identificar e quantificar os componentes em uma mistura heterogênea de³.

Embora microdialysis é uma técnica sensível que pode ser usada para medir praticamente qualquer substância de interesse, a resolução temporal é baixa, com taxas de amostragem máxima da ordem de dezenas de minutos^1,2minutos. A invenção de varredura rápida voltametria cíclica (FSCV), uma técnica que se baseia no potencial redox de espécies eletroativos, pode elucidar perto instantâneas concentrações do analito de interesse no fluido extracelular. Em breve (ver Robinson et al ⁴ para uma extensa revisão), um eletrodo é aplicado para levantar e abaixar a tensão de forma de onda triangular em um rápido tempo de escala⁴. Quando a tensão está no intervalo correto, o composto de interesse repetidamente é oxidado e reduzido. Esta oxidação e redução resulta em um movimento de elétrons que cria uma pequena corrente alternada. Varredura de taxas terá lugar na escala de subsegundos com oxidação e redução de compostos ocorrem em microssegundos. Subtraindo-se o plano de fundo atual criado pela sonda de corrente resultante, pode-se gerar uma tensão vs atual trama original para cada composto. Desde que a escala de tempo das oscilações da tensão é conhecida, esses dados podem ser usados para calcular uma parcela da corrente em função do tempo. Assim, a concentração relativa do composto pode ser determinada, enquanto o número de elétrons transferidos em cada oxidação e reação de redução é conhecida⁴.

Esta especificidade química e alta resolução temporal fazem FSCV uma técnica poderosa para a detecção de alteração química concentrações na vivo. No entanto, apesar dessas vantagens múltiplas, esta técnica requer vastos conhecimentos técnicos e equipamentos caros e instalação. Além disso, nonelectroactive neurotransmissores (e.g., glutamato) não podem ser medidos usando esta técnica. Felizmente, os avanços tecnológicos no campo da eletroquímica⁵, bem como a comercialização destas invenções, introduziu uma abordagem relativamente simples para medir os neurotransmissores não-eletroativos em animais comportamento acordados sem comprometer a técnica de precisão, um temporal conhecida como tecnologia biosensor enzimática. Esta técnica usa conversão enzimática do neurotransmissor nonelectroactive de interesse em dois substratos, um dos quais é eletroativos de peróxido de hidrogênio que é detectado como uma oxidação amperométrico atual gerada por um potencial aplicado⁵ . Biosensor comercialmente disponíveis sondas seletivamente (ver Figura 1) medem analitos de interesse, competitivamente, reduzindo a contribuição de interferentes endógenos. No caso de glutamato, a contribuição do ácido ascórbico interferent comuns (AA) é reduzida competitivamente à corrente medida pelo co localizando oxidase de AA na superfície do sensor, conversão de AA para não-eletroativos enzimática ativa dihydroascorbate e água. Além disso, uma camada de polímero Nafion carregada negativamente presente sob a camada de enzima exclui compostos aniônicos endógenos.

Esta mesma configuração experimental biosensor pode medir eletroativos neurotransmissores como FSCV, mas em vez disso, ele emprega um potencial fixo gravação⁶. Em contraste com a tensão oscilante aplicada em FSCV, na gravação de um potencial fixo a tensão é mantida no redox potencial para o analito de interesse. Embora seja menos quimicamente seletiva do que FSCV como vários neurotransmissores podem ter o mesmo potencial, de redox em áreas do cérebro que esmagadoramente inclinação para um neurotransmissor, a natureza da curva-chave desta abordagem supera a falta de química especificidade.

A capacidade de medir tanto eletroativos e nonelectroactive lançamento do neurotransmissor em tempo quase real e vinculá-lo a eventos comportamentais específicos fornece uma oportunidade para examinar a liberação de neurotransmissor convergentes. Este manuscrito detalha o uso deste sistema para interrogar a neurotransmissão tanto dopamina e glutamato em resposta a recompensa natural em hamsters comportamento acordados. O objetivo deste trabalho é a detalhar o processo de medição esta liberação de neurotransmissor durante o comportamento sexual em hamsters femininos, com o objetivo de demonstrar a sua viabilidade para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.

Os hamsters são um modelo ideal para uso em gravações de eletroquímicas
Historicamente, os modelos de ratos e camundongos têm sido empregados no estudo do comportamento sexual. Estas espécies de roedores se envolver em uma sequência de imperatividade dinâmica, envolvendo inúmeros comportamentos de solicitação feminino que incluem lupulagem, arremessam e orelha mexer para atrair o macho de perseguir e, finalmente, montar o feminino⁷. A montagem pelo macho (com ou sem penetração vaginal) dura apenas alguns segundos, durante o qual a fêmea se engaja na sua postura de comportamento sexual (denominada lordose) também só por alguns segundos antes de retomar comportamentos ativo solicitação. Este padrão de comportamento, composto por altos níveis de atividade intercalados com breves períodos de imobilidade, é problemático para medir a neurotransmissão em comportamento de animais. Primeiro, pode haver artefatos de movimento em amperométrico gravações que estão relacionadas com a atividade neural. Em segundo lugar, a locomoção é associada com a liberação de neurotransmissores particulares em certas regiões do cérebro. Por exemplo, liberação de dopamina tem sido acoplada a atividade locomotora do striatum dorsal e ventral^8,9, uma descoberta que formou a base para medições microdialysis de dopamina após psicoestimulantes Administração¹⁰. Porque os comportamentos de solicitação fêmea-típico em mosroedores de t envolvem altos níveis de atividade locomotora e são representados pela maior parte de um teste de comportamento sexual de 10 minutos, isso dificulta a alterações na neurotransmissão, atribuímos aos componentes explícitos de comportamento sexual que coletivamente durar apenas minutos.

Para analisar o perfil neuroquímico do comportamento sexual feminino, este laboratório procurou uma espécie em que há atividade locomotora mínima que acompanha o comportamento sexual. A sequência copulador no hamster sírio (Mesocricetus auratus) é ideal para gravações neuroquímicas devido à falta de comportamentos de solicitação normalmente visto em ratos e camundongos¹¹. Como consequência, os hamsters fêmeas entrará e manter a postura de lordose para mais de 9 minutos a 10 minutos de sessão¹²de teste. Com a falta de estranhos movimentos de locomoção pelo sexo feminino, na vivo gravações eletroquímicas que podem ser associadas a componentes de interações sexuais com o macho podem ser obtidas.

Copuladores lutas em hamsters
Após a introdução de um animal de estímulo masculino na câmara de teste, o macho irá inicialmente envolver anogenitais investigação (AI) da fêmea antes de montá-la (Figura 2). Em ordem para montar o macho, a fêmea deve assumir uma postura sexual receptiva, conhecida como lordose, no qual ela arcos de volta e desvia a cauda para que o macho de montagem pode ganhar acesso do pênis para a vagina dela. O macho vai montar a fêmea, abraçando seu traseiro com as duas patas (Figura 2B) e começar a empurrar na tentativa de ganhar penetração peniana (Figura 2C). O macho irá montar a fêmea (sem inserção), bem como intromit um número de vezes antes de finalmente conseguir a ejaculação. Esta sequência de montagens e intromissões levando a ejaculação é denominada um tal"imperatividade". Os machos terá várias lutas copulativo dentro de uma única sessão.

Protocol

todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da The University of Minnesota e estão em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório ¹³ .

1. animais e canulação cirurgia

1. obter Syrian hamster de um fornecedor de animais comuns com aproximadamente 55 dias de idade.
   Nota: Embora a idade dos animais variam devido às limitações de vários paradigmas experimentais, para o comportamento sexual é importante obter animais sexualmente maduros que são todos aproximadamente a mesma idade.
2. Animais de casa em um controlado de temperatura (22 ° C) e ambiente de iluminação (14 h luz seguido por 10 h escuro com luzes apagadas às 13:00 h), com comida e água disponível ad libitum exceto durante os períodos de teste experimental.
   Nota: Devido a que os hamsters reproduzem sazonalmente, este 14:10 ciclo claro/escuro imita as suas condições de reprodução natural.
3. Após uma aclimatação de 1 semana para o laboratório, realizar ovariectomies bilaterais assépticos e intracranianas cânulas estereotáxicos sob anestesia geral (por exemplo, pentobarbital) e administrar apropriados institucionalmente aprovaram tratamento pós-operatório de analgésicos e antibióticos conforme descrito anteriormente, ^{14 , 15}.
   Nota: Para o estudo do comportamento sexual, ovariectomies são necessárias para remover a principal fonte endógena de hormônios sexuais, para que os animais podem ser uniformemente induzidos a receptividade sexual com hormônio exógeno em conformidade com a linha do tempo experimental.
   1. Para implantação de sonda tanto dopaminérgico e glutamatérgico, stereotaxically implante guia cânulas (0,7 mm de diâmetro; a Figura 3) para a área de interesse (por exemplo, este laboratório alvo certo núcleo accumbens (NAc)) conforme descrito em detalhes passo a passo em outro lugar ¹⁵.
      Nota: Embora os dados apresentados são de gravações de sensor único de uma sonda de glutamato ou dopamina por animal, este sistema permite a gravação simultânea de até 4 sensores em um único animal; assim, 1-4 cânulas poderiam ser implantadas dependendo de resultados e delineamento experimental desejado.
      1. Determinar as coordenadas de implante da região de interesse usando um atlas estereotáxica (por exemplo, O cérebro de Hamster dourado por Morin & madeira), mantendo-se em mente que o sensor se estende a 1 mm abaixo da cânula no tecido cerebral.
   2. Após uma cânula stereotaxically é reduzida para o local desejado do dorso-ventral, afixá-lo no crânio usando um boné, construído a partir de acrílico dentário, fixado com parafusos ósseos de aço inoxidável e uma cabeça de plástico montar ( Figura 3 ; Veja ¹⁵ para mais detalhes).
   3. Para testes de fibra de carbono, insira um eléctrodo de referência (350 μm de diâmetro, comprimento total de 7,5 mm) no hemisfério contralateral.
      Nota: Um local específico ou a distância entre a cânula não é necessária; eletrodos de referência podem ser colocados em qualquer lugar no hemisfério contralateral, o que é conveniente.

2. Biosensor e teste de fibra de carbono

1. após 1 semana de recuperação da cirurgia, administrar o regime de escorva de hormônio para induzir a receptividade sexual.
   1. Injetar 10 µ g de benzoato de estradiol em 0,1 mL de óleo de girassol por via subcutânea (s.c.), cerca de 48 h e 24 h antes do comportamento sexual, testes, para induzir a receptividade sexual para o macho ¹¹.
   2. Injetar 500 µ g de progesterona em 0,1 mL de óleo de girassol, s.c., 4h antes da introdução do macho para induzir a receptividade sexual ¹¹.
2. Testar todos os animais no início da fase escura de seu ciclo diário, como comportamentos sociais de roedores estão sujeitos a alteração sob luz branca e luz vermelha testar condições ^{16 , 17 , 18}.
3. para testes de glutamato biossensor enzimático, calibrar os sensores em vitro ( Figura 4) antes da utilização, conforme descrito anteriormente, ^{15 , 19}. tubos de centrifuga de soluções
   1. fazer a calibração frescas sobre o dia de testes em vidro de 20 mL. Para a solução do analito, dissolva 7,4 mg de ácido L-glutâmico em 10 mL de ultra-pura H ₂ O, invertendo-se delicadamente o tubo. Fazer a interferent solução dissolvendo 176,1 mg AA em 10 mL de ultra-pura H ₂ O.
   2. Configurar para a calibração, colocando um agitador magnético na base de um stand de anel de laboratório básico. Colocar um copo encamisado de 20 mL no topo do agitador magnético e prenda no lugar usando uma braçadeira média de 2 pinos. Bar
      1. Adicionar uma agitação magnética e 20 mL de fosfato de 100 mM de tampão salino (PBS) para o copo de encamisadas. Conectar o béquer encamisado para um banho de água circulante para aquecer a solução tampão a 37 ° C.
         Nota: As calibrações de biossensor enzimático devem ser realizadas a temperatura do corpo, desde que a atividade enzimática é influenciada pela temperatura.
   3. Coloque o suporte de calibração do sensor em cima o copo encamisado e defina um pré-amplificador de 4 canais calibração em cima, fixando-se no lugar usando uma pinça de ângulo reto. Conectar o pré-amplificador de um dispositivo de condicionamento e aquisição de dados para dados de calibração registro.
   4. Testar a sensibilidade de cada biossensor enzimático para glutamato (ou outros analitos de interesse para outros biosensor comercialmente disponíveis sondas por exemplo, glicose) antes da gravação experimental, colocando a sonda para o titular de calibração no topo de uma copo encamisado, submergindo a cavidade sensoriamento e uma parte do fio de referência de cloreto de prata (AgCl) na solução tampão.
      1. Antes de ligar cada sensor (até 4) sendo testado para uma porta em um pré-amplificador de 4 canais calibração, iniciar uma nova gravação na interface de computador utilizando o software de aquisição para download gratuito. Permitir que os sensores alcançar uma linha de base estável.
   5. Começar a adicionar as injeções do analito quando os sensores têm atingido uma base estável. Através do orifício no suporte de calibração para introduzir a ponta da pipeta para a solução-tampão. Use a ferramenta de anotação chave rápida do software de gravação para fazer anotações quando é feita uma injeção.
      1. Adições de fazer 10 µM de glutamato por pipetagem 40 μL da solução analito na solução tampão. Espere que o sensor estabilizar entre adições. Adicionar 3 injeções de solução de analito antes de adicionar uma única injeção de solução de interferent AA (50 μL injeção volume para 250 μM mudança na concentração).
         Nota: A calibração permite a conversão das mudanças no sinal amperométrico (visto durante a gravação experimental enzimática na etapa 2.12) para mudanças na concentração de glutamato, se desejado. Consulte a referência ¹⁵ para obter instruções passo a passo. As sondas dopaminérgico usadas por este laboratório são calibradas durante o processo de fabricação pelo provedor comercial. Sondas de glutamato devem ser aferidas no momento da utilização, como sua sensibilidade pode diminuir ao longo do tempo à medida que os componentes enzimáticos degradam ¹⁹. Porque eletrodos de fibra de carbono não sofrem degradação, a calibração realizada pela empresa antes do embarque é suficiente ao longo como taqui é um aumento da probabilidade de danificar a fibra de carbono fina (350 μm de diâmetro) através da manipulação adicional.
4. a câmara de teste de linha com fundamento retirado o animal ' gaiola casa de s.
   Nota: Isto aumenta a fêmea ' familiaridade s com os testes de câmara, bem como expõe o macho para estimular sexualmente as sugestões olfactory do acasalamento que foram distribuídas pela fêmea em resposta ao tratamento estradiol.
5. Levemente anestesiar os animais antes da inserção da sonda por isoflurano ou outro anestésico volátil em uma câmara de indução.
6. Remover o obdurator oclusiva da cânula guia e inserir o eletrodo de fibra de carbono ou sonda enzimática através do eixo guia.
7. Após a inserção da sonda, colocar o animal na câmara de teste.
   Nota: Este laboratório utiliza um aquário de vidro 10-gal (24.5 x 48,9 x 29,4 cm), mas redondas câmaras de área igual também podem ser empregadas.
8. Começar a gravar o sinal de vídeo e tempo bloqueado amperométrico em um programa de software disponíveis comercialmente, descrito em detalhe em outro lugar ¹⁵.
9. Ligar o sensor para o sistema de gravação: o potentiostat através de um cabo blindado eletricamente e uma giratória elétrica. Estabilize a conexão do sensor, enroscando um acessório de pino na montagem da cabeça. Reforçar a conexão usando a película de laboratório, se necessário.
   Nota: Um conector personalizado é necessário para conectar o eletrodo de fibra de carbono e o eletrodo de referência para o potentiostat, enquanto os sensores de glutamato enzimáticas podem ser conectados diretamente para o potentiostat.
10. Permitir que o sensor equilibrar no cérebro antes do ensaio experimental.
    Nota: Tempos de equilibração diferem dependendo do sensor de gravação (por exemplo, sensores enzimáticos requerem equilíbrio de 2-4 h, enquanto eletrodos de fibra de carbono requerem apenas cerca de 30 min). Se ambos os tipos de sensores são implantados, equilibrar o tempo sensor enzimático.
11. Depois de equilibração do sensor, introduzir um macho de estímulo para a câmara de teste.
12. Após a primeira montagem com inserção peniana (denominado intromissão) pelo macho estímulo, continuar a gravar para um adicional 10-30 min, dependendo das metas experimentais.
13. Seguindo testes comportamentais, desconecte a fêmea ' sensor de s.
14. Remover ambos os hamsters da câmara de teste. Remover a roupa de cama e limpar a câmara usando etanol a 70%.
    Nota: Devido o breve equilíbrio necessário para gravações de fibra de carbono, etapas 2.3-2.14 podem ser repetidas para testar vários animais no mesmo dia. Em contraste, os sensores enzimáticos requer cerca de 4 h de equilibração, testar apenas um animal por dia para limitar a variação inter sujeita possível devido a diferenças nos animais ' tempo circadiano no teste.

3. Sacrifício e perfusão

1. após a conclusão do período de testes, profundamente anestesiar a cobaia feminina com um agente euthanizing (por exemplo, este laboratório usa uma injeção intraperitoneal de 0,2 mL de solução de fenitoína e pentobarbital) .
2. Transcardially perfundir o animal com PBS, pH 7,6, para retirar todo o sangue circulante, seguido de uma fixação de 20 min usando 4% paraformaldeído-PBS de 25 mM.
3. Remover o cérebro e o postfix em ~ 30 mL da solução de paraformaldeído 4% em um tubo cónico de 50 mL durante a noite. Solução de sacarose-PBS
   1. loja do cérebro em um 10% até estar pronto para seção serial.
      Nota: Cérebros podem ser armazenados a 2 semanas, com as alterações de solução de sacarose semanais para evitar o potencial de crescimento de contaminantes.
4. Serial seção do cérebro em 40 µm corta a região implantada com qualquer um micrótomo de congelação ou criostato conforme descrito anteriormente ¹⁹.
5. Montar fatias serialmente em slides revestido adesivo comercialmente disponíveis (ou ver ²⁰ tornar). Deixe-a secar, pelo menos durante a noite.
6. Mancha os slides com tintura de cresilo violeta, clara, e lamela conforme descrito anteriormente ²⁰.
7. Os slides usando microscopia de campo claro para confirmar o posicionamento anatômico do sensor de imagem.

4. Coding comportamental

1. Vista e anotar os vídeos usando o software comercialmente disponível para download gratuito (ver Tabela de materiais) em câmera lenta para precisamente os comportamentos código tempo bloqueado ao sinal amperométrico.
   Nota: Para usar o código MATLAB em análise (veja abaixo ), anotar o início e final de cada um do sexo feminino ' s e macho ' comportamentos de s.
   1. No startLordosis anotar no quadro quando a fêmea inicia uma dorsoflexion de volta e defeitos a cauda para cima. Anotar a endLordosis quando a fêmea termina esta postura, que muitas vezes ocorre quando a fêmea reajusta para outro local na câmara de teste.
   2. Anotar startAI quando a fêmea está na postura lordose e o macho move o focinho em direção a fêmea ' região anogenital de s, onde pode ocorrer a cheirar, lamber ou noprograma de sua região perineal. Anotar endAI quando o macho remove o focinho da proximidade com a fêmea ' região anogenital de s.
   3. Anotar startMount quando o macho se aproxima e coloca suas dianteiras na mulher em uma postura de montagem, independentemente da orientação da tentativa de montagem (por exemplo, na lateral, alcatra).
   4. Anotar startIntromission quando empurrando bem sucedido ganha o acesso do pênis masculino montado para a fêmea ' vagina s.
      Nota: Uma intromissão é comportamentalmente distingue o empurrando montado que ocorre antes da penetração, como o macho visivelmente puxa seus membros superiores em direção ao seu corpo, empurra a pélvis para a frente e cachos sua cauda para cima, indicando a penetração (veja < classe forte = "xfig" > Figura 4 C).
      1. , Quando for o caso, anotar ejaculação.
         Nota: No final de uma luta de acasalamento e em conjunto com uma penetração bem sucedida, o macho vai ejacular. Embora um seja incapaz de visualizar a emissão real, masculinos hamsters têm uma característica pisando o movimento com o pé traseiro durante uma intromissão ²¹, assim anotar a ejaculação na ocorrência do movimento do pé.
   5. Anotar endIntromission e endMount simultaneamente no quadro quando o macho ter removido as duas patas e assim, não tem contato com a fêmea. Devido à frequente incapacidade de visualizar sua retirada, simultânea código estes dois comportamentos para permitir a consistência e confiabilidade através de acasalamento lutas.
      Nota: Uma luta de acasalamento ou segue uma ejaculação bem sucedida ou é quando a fêmea quebra a postura de lordose após pelo menos um monte.

5. Análise de dados de exemplo

Nota: O uso de fibra de carbono fixo-potencial e gravações enzimáticas para dopamina umglutamato de ND, respectivamente, permite a capacidade de medir tanto tónico e fásicos padrões de lançamento de eletroquímico. Este laboratório utiliza um sistema de aquisição livre, comercial e software para gravar e converter gravado sinais de analógico para digital (viés 0,600 V, taxa de amostragem = 1 Hz).

1. Descrição do protocolo de análise de dados de exemplo
   1. embora outros programas podem ser usados, quantificar o tônico e fásicas (transitórias) alterações no sinal eletroquímico gravado usando MATLAB.
      1. Para os dados apresentados, calcular o sinal de tônico usando um filtro de médio móvel de 50 pontos. Uma representação normalizada somente transientes do sinal foi calculada subtraindo-se o sinal de tónico de dados brutos. Ao identificar picos fásicos, existem várias opções algorítmicas (por exemplo, rotular picos como mudanças no sinal de mais de 1 SD acima da média).
      2. Identificar os locais destes picos, ou seja, local maxima, do sinal normalizado usar o MATLAB função peakfinder com a amplitude de pico mínimo definido como a raiz quadrada do sinal. A localização dos Picos detectada do sinal normalizado foi usada para extrair a amplitude de cada pico. A capacidade de detectar picos permite a identificação de qualquer tempo bloqueado comportamentos que podem ser coincidindo com ou dirigindo o pico relativo a neuroquímica sob investigação.
   2. Segmento os dados processados em conformidade com as anotações comportamentais (ver passo 3); um estudante ' s t-teste foi utilizado para avaliar as diferenças no nível de neurotransmissor do tónico, a ocorrência de transientes e a amplitude de transientes durante a pré-acasalamento lordose tal versus lordose durante surtos de acasalamento. Para medir as mudanças para padrões de tônico da eletroquímico lançamento, os pontos de dados que ocorrem durante a posição de lordose diretamente antes de uma luta de acasalamento (ou seja, pré-acasalamento lordose tal) foram comparados com os pontos de dados durante uma luta de acasalamento sessão usando um t-teste
2. Preparação dos dados brutos para protocolo de análise de dados descrito
   Nota: como mencionado, apesar de outros programas ou análises podem ser igualmente opções viáveis, para utilizar o código MATLAB descrito acima, os dados brutos devem ser preparados em da seguinte maneira:
   1. exportar os arquivos de anotação e tensão. Para fazer isso, sob o ' arquivo ' guia, selecione o ' exportação ' função e selecione o ' anotações ' guia para salvar as anotações. Sob o ' arquivo ' guia, selecione o ' exportação ' função e escolher o " TSV ' guia para salvar as medições de tensão como um arquivo de extensão TSV.
   2. Abrir cada arquivo com um programa de planilha e salvar como ' xls/xlsx ' tornar os arquivos compatíveis com o MATLAB.
      Nota: Para o ' anotação ' arquivo, há adicionais anotações que devem manualmente adicionados após a exportação em um programa de planilha para ditar o Iniciar e final de ambos a lordose de tal pré-acasalamento (anotado como PreMBlordorsis ) e o tal de acasalamento para que estes pontos de tempo podem ser directamente comparados como mencionado na etapa 5.1.2.
   3. Anotar o início da lordose tal pré-acasalamento (startPreMBlordosis) ao mesmo tempo, como um comportamento de lordose começa (startLordosis), que também inclui um comportamento de montar e também no início de um novo acasalamento tal se a fêmea permanece na postura lordose.
   4. Anotar o fim da lordose tal pré-acasalamento (endPreMBlordosis), quando a primeira montagem começa.
   5. Anotar o início de uma luta de acasalamento (startMB) ao mesmo tempo da endPreMBlordosis, enquanto isto significa o início de uma luta de acasalamento.
   6. Anotar o fim de uma luta de acasalamento (endMB) ou ao final de uma montagem que inclui uma ejaculação (consulte a etapa 4.1.4.1), ou seguindo a fêmea ' terminação de s da postura lordose (endLordosis).

Representative Results

Usando a eletroquímica e comportamental de codificação metodologia descrita acima, este laboratório começou a caracterizar ambos tônico e fásicas flutuações em dopamina e glutamato durante gravações no vivo de comportamento sexual. Devido a maneira temporalmente-precisa desta metodologia, nós pode caracterizar com mais precisão neurotransmissão durante o comportamento sexual; bem como atribuem alterações específicas nos padrões de lançamento de correspondentes alterações tônico durante surtos de acasalamento e correspondentes flutuações transitórias durante a recepção da fêmea de comportamentos copuladores individuais (por exemplo, penetração, ejaculação precoce) do macho montagem.

Especificamente, usamos esta metodologia para concentrar-se em medir os padrões de liberação de dopamina e glutamato no CNA, de animais separados. O NAc é uma região crítica envolvidos na recompensa processamento²² e tem sido descrito como uma região integral nos aspectos do comportamento sexual²³recompensa.

Observamos que durante o comportamento sexual, as fêmeas demonstram um aumento tônico nos níveis dopaminérgicos no núcleo NAc durante o acasalamento lutas (Figura 5). Enquanto essas alterações tônico são mostradas para todas as lutas de acasalamento, a metodologia descrita acima pode medir mudanças tônica entre cada luta acasalamento e assim aumentar a identificação temporal de mudanças gerais para níveis tónico da liberação do neurotransmissor ao longo toda a sessão. Além disso, esta metodologia descrita pode identificar alterações fásicas e temporalmente mapear os comportamentos provavelmente associados com estas variações fásicas neurotransmissor. Especificamente, estes resultados preliminares sugerem que durante o acasalamento surtos, transientes dopaminergic no NAc surgirem durante a inserção vaginal (penetração) pelo macho (Figura 6). Além disso, esta associação com intromissão é específica, com respostas dopaminergic insignificante para outros comportamentos copuladores, tais como o AI.

Um padrão semelhante tem sido observado em outros animais no que diz respeito a liberação de glutamato, com transientes rápidos que correspondem às intromissões individuais no núcleo dorsal NAc durante um ataque copulador (Figura 7). Este padrão é uma região específica, não há nenhum sinal discernível ocorrendo no NAc concha ou medial caudado de outros animais.

Figura 1 : Tecnologia enzimática Biosensor.
Norma fabricação de sondas disponíveis comercialmente biossensor enzimático que detectam os neurotransmissores através de transformação mediada por enzimas (imagem esquerda). No caso de sensores glutamatérgico, oxidase glutamato é funcionária na camada enzimática (imagem direita) para converter o neurotransmissor nonelectroactive eletroativos de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) que é detectado por oxidação a eletrodo de platina-irídio (Pt-Ir). Ácido ascórbico (AA), um interferent comum que é oxidado no mesmo potencial, é excluído através de uma adição de oxidase de AA na camada enzimática que converte o interferent para nonelectroactive de água. Excluem-se outros interferentes negativos eletroativos presentes no cérebro através de uma membrana seletiva passiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Componentes de um Hamster acasalamento tal.
Em hamsters, uma luta de acasalamento consiste em uma sequência de comportamentos copuladores, durante o qual a fêmea permanece na postura lordose imóvel enquanto o macho anogenitally investiga (A), monta (B)e alcança a intromissão de (C). . Nota uma intromissão é comportamentalmente distinguível de montagem como o macho puxa seus membros superiores em direção ao seu corpo, empurra a pélvis para a frente e enrola a cauda para cima, indicando a penetração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Construção do tampão crânio.
Cânulas de guia, parafusos ósseos e dentário acrílico são utilizados na construção de uma tampa de crânio para permitir a inserção de fibra de carbono ou sonda enzimática (ver¹⁵ para obter detalhes passo a passo). Esta figura mostra um implante de cânula única sobre o NAc certo para um sensor enzimática (sem eletrodo de referência implantado) e monte de cabeça de plástico para a estabilidade do sensor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Calibração de glutamato Biosensor.
A sensibilidade de cada biosensor para glutamato é testado em vitro antes da gravação experimental por 10 µm adições de glutamato (verde) a 37 ° C (desde que a atividade enzimática é influenciada pela temperatura). Cada sensor é confirmado para ser não-responsivos ao ácido ascórbico (AA; vermelho) ou dopamina (DA; azul). Esta calibração permite a conversão de alterações no sinal amperométrico visto durante gravação experimental para alterações da concentração de glutamato.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Tônico aumenta em dopamina durante uma luta de acasalamento.
R. exemplo estilizado de premating sinal de lordose tal vs acasalamento sinal de lordose de tal. Para medir a liberação de dopamina tónico, as respostas amperométrico para níveis de dopamina durante a lordose antes de uma luta de acasalamento (MB) foram comparadas com aqueles durante um MB. Caixas cinzentas indicam lordose antes um MB. BLcaixas de UE indicam lordose durante um MB. B. quantificação representativa de um animal, comparando a média tensão entre lordose preMB e lordose MB. Barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM) e asterisco indica diferença significativa (p-valor < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Representante dopamina Trace.
Fásicas liberação de dopamina é tempo bloqueado intromissões do macho no núcleo dorsal NAc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Representante glutamato Trace.
Transientes de glutamato correspondem às intromissões individuais do macho no núcleo dorsal NAc durante uma experiência sexual prolongada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Embora relativamente simples, alguns problemas podem surgir quando empregando esta técnica. Em primeiro lugar, o posicionamento estereotáxica das sondas deve ser preciso: ao contrário do microdialysis que as amostras de um raio mais amplo do meio extracelular em torno da sonda, esta técnica só permite a medição de um neurotransmissor que entra em contato direto com a sonda. Em segundo lugar, no caso da gravação de fibra de carbono, devido a pequena largura da fibra, pode ocorrer a ruptura, e a sonda deve ser introduzida com cuidado deliberado. No caso de biosensores glutamatérgico, degradação enzimática pode ocorrer se a sonda não é usada dentro do prazo garantido de 3 semanas. Felizmente, todas estas questões são endereçáveis e podem ser eliminadas com cuidado e atenção aos detalhes.

Uma ressalva potencialmente problemática surge na especificidade das gravações de fibra de carbono fixo-potencial. Porque o potencial aplicado para dopamina coincide com outras monoaminas, tais como a noradrenalina, se as gravações são feitas em áreas que liberam ambos os neurotransmissores, que esta falta de especificidade química pode limitar a interpretação dos resultados. No NAc isto não representa um problema importante, com dopamina, sendo o principal catecolamina transmissor²⁴. Porque cerca de 98% das células no NAc são médios neurônios espinhosos que respondem ao de neurotransmissão dopaminérgico²⁴, o sinal é inclinado para a deteção de dopamina e facilita o uso dessa abordagem mais turn-key.

Outro benefício desta biossensor enzimático e sistema de gravação de fibra de carbono fixo-potencial é que gravações dual-sonda podem ser realizadas, para que ambos eletroativos e nonelectroactive neurotransmissores como a dopamina e o glutamato podem ser medidos em simultaneamente o mesmo animal. Embora os dados apresentados vêm de gravações em animais distintos, estas técnicas podem ser empregadas simultaneamente, tal que um pode avaliar a convergência da neurotransmissão em várias regiões do cérebro, ou na mesma região bilateralmente. Combinação de gravações dentro do mesmo animal, ou comparação de gravações através de animais como mostrado aqui, são as duas ferramentas poderosas em elucidar os mecanismos por trás de conexões de rede e sinalização.

Em suma, este artigo demonstra as técnicas poderosas de biosensing enzimático e gravação de fixo-potencial para medir vários neurotransmissores eletroativos e nonelectroactive, utilizando uma única instalação experimental. Embora os dados aqui apresentaram vêm de gravações individual neurotransmissor através de vários animais, este sistema fornece a capacidade para gravar até 4 sensores em um animal simultaneamente¹⁵. Os resultados da amostra apresentados coletivamente fornecem a introspecção rápida neurotransmissão no hamster fêmea resultantes de padrões específicos de estimulação copulador do macho. Além disso, estas experiências demonstram respostas tempo bloqueado de transientes dopaminérgico e glutamatérgico no NAc núcleo da fêmea a intromissão do macho, sugerindo que esta versão pode ser responsável pela codificação distintas Propriedades gratificantes de comportamento sexual. Nosso objetivo é continuar utilizando o padrão de acasalamento em hamsters sírios fêmeas para desenvolver uma imagem mais completa da relação de dopamina na vivo e liberação de glutamato e os circuitos subjacentes aos componentes individuais de estímulos imperatividade do macho. Acreditamos que a capacidade de caracterizar os padrões desses neurotransmissores não é apenas benéfica de uma ciência básica perspectiva²³, mas também na elucidação de possíveis abordagens terapêuticas para formas patológicas de comportamento de recompensa como o vício de drogas²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.